第1章植組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和操作技術(shù)第一頁，共48頁。本章教學(xué)目的與要求：(1)掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計；(2)掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及其使用方法；(3)掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。(4)掌握滅菌和消毒的區(qū)別；(5)掌握滅菌的不同方法和具體操作過程；(6)掌握無菌接種的步驟；(7)掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟；(8)一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法；(9)掌握試管苗馴化的基本程序；第1章

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及操作技術(shù)第二頁，共48頁。第1章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室

構(gòu)建及操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)學(xué)第三頁，共48頁。

商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計與主要設(shè)備培養(yǎng)基及其配制外植體的選擇與培養(yǎng)試管苗的馴化與移栽第1章

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及操作技術(shù)本章主要內(nèi)容第四頁，共48頁。1、培養(yǎng)器皿的清洗；

2、培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌；

3、無菌操作——材料的表面滅菌和接種；

4、將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)；

5、試管苗的馴化、移栽和初期管理。第1章

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及操作技術(shù)第一節(jié)商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的

設(shè)計與主要設(shè)備一般組織培養(yǎng)的操作工序：第五頁，共48頁。準(zhǔn)備室溫室馴化室培養(yǎng)室無菌操作室緩沖室實(shí)驗(yàn)室組成一、設(shè)計：第一節(jié)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計與主要設(shè)備第六頁，共48頁。二、儀器設(shè)備和器皿用具1、超凈工作臺或接種箱2、空調(diào)3、除濕機(jī)或加濕器4、恒溫培養(yǎng)箱5、高壓滅菌鍋6、冰箱7、天平8、顯微鏡9、水浴鍋10、搖床與轉(zhuǎn)床11、蒸餾水發(fā)生器12、酸度計13、離心機(jī)（一）常見儀器設(shè)備第一節(jié)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計與主要設(shè)備第七頁，共48頁。1、培養(yǎng)器皿：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、

圓形培養(yǎng)瓶、果醬瓶

2、分注器

3、離心管

4、刻度移液管

5、細(xì)菌過濾器

6、實(shí)驗(yàn)器皿：量筒、燒杯、容量瓶、

試劑瓶、塑料瓶、酒精燈等。第一節(jié)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計與主要設(shè)備（二）各類玻璃器皿第八頁，共48頁。1、鑷子：尖頭鑷子、槍形鑷子2、剪子3、解剖刀4、接種針5、鉆孔器第一節(jié)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計與主要設(shè)備（三）器械用具第九頁，共48頁。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制本節(jié)目的要求：

(1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)；

(2)掌握基本培養(yǎng)基的配方；

(3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；

(4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法；

(5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；

(6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。第1章

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及操作技術(shù)第十頁，共48頁。一、培養(yǎng)基的成分第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制其它添加物碳水化合物植物生長調(diào)節(jié)劑有機(jī)營養(yǎng)物無機(jī)營養(yǎng)物培養(yǎng)基組成第十一頁，共48頁。1、無機(jī)營養(yǎng)元素(inorganicelement)1)大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素。

[N、P、K、Mg、S和Ca等]。2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。

[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等]。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十二頁，共48頁。2、有機(jī)化合物(organiccompound)最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。使用濃度在1%—5%，常用3%

作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。（1）碳水化合物第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十三頁，共48頁。在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動。種類：VBl(鹽酸硫胺素)、

VB6(鹽酸吡哆醇)、

Vpp(煙酸)、

Vc（抗壞血酸）、

VH(生物素)、

VB11(葉酸)、

VB12（鈷胺素)等。使用濃度：一般用量為0.1—1.0mg／L。（2）維生素(vitamin)第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十四頁，共48頁。又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度：一般為lOOmg／L，作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。（3）肌醇第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十五頁，共48頁。作用：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用濃度：為10—200mg／L。（4）氨基酸(alminoacide）第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十六頁，共48頁。3、有機(jī)附加物（天然復(fù)合物）10%—20%150-200ml／L150—200g／L0.01%-0.05%濃度：第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制有機(jī)附加物椰乳香蕉馬鈴薯酵母提取液第十七頁，共48頁。4、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone)赤霉素（gibberellicacid）細(xì)胞分裂素類(cytokinin)生長素類(auxin)第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十八頁，共48頁。

*作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成；促進(jìn)細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長；促進(jìn)生根。

在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-5—10-8mg／L)就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。（1）生長素類第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第十九頁，共48頁。吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)*生長素種類：第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十頁，共48頁。IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)生長素作用強(qiáng)弱順序：強(qiáng)弱第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十一頁，共48頁。種類：6—BA(6—芐基腺嘌呤)Kt(kinetin激動素)Zt(zeatin玉米素)（2）細(xì)胞分裂素類

細(xì)胞分裂素作用：①促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。②誘導(dǎo)芽分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。③抑制根的分化。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十二頁，共48頁。Kt(激動素)6—BA(6—芐基腺嘌呤)Zt(玉米素)細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序強(qiáng)弱第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十三頁，共48頁。GA3（赤霉酸）：作用：促進(jìn)幼芽伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。

赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當(dāng)生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。（3）赤霉素第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十四頁，共48頁。5、培養(yǎng)材料的支持物---瓊脂(agar)固體培養(yǎng)時最好的固化劑。用量：6—10g／L。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。

第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十五頁，共48頁。固體培養(yǎng)基的特點(diǎn)（與液體培養(yǎng)基相比）:優(yōu)點(diǎn):操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。缺點(diǎn):培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十六頁，共48頁。6、抗生物質(zhì)(antibiotic)種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：5—20mg/L。作用：可防止菌類污染。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十七頁，共48頁。7、活性炭(activecarbon)目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根。使用濃度：1—5g／L。它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十八頁，共48頁。8、水（water)作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二十九頁，共48頁。二、培養(yǎng)基的PH值(pHvalue)1、多數(shù)植物要求2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調(diào)節(jié).3、注意：經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pH會下降0.2-0.8,固調(diào)整pH值時,應(yīng)高于0.5；pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)pH>6.0時，培養(yǎng)基將會變硬，pH<5.0時，瓊脂凝固不好。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十頁，共48頁。種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制不同植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見表)第三十一頁，共48頁。

培養(yǎng)基(culturemedium)：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。

三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十二頁，共48頁。1、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基2、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基3、根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基4、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、改良培養(yǎng)基。（一）培養(yǎng)基的種類第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十三頁，共48頁。

若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物的培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基。

在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加各種各樣的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他有機(jī)附加物的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基：

指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)基：

指用來接種繼初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十四頁，共48頁。母液名稱藥品名稱

原配方量(mg)/L大量元素母液

NH4NO31650KNO31900CaCl·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO4170微量元素母液MnSO4·H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6CoCl·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.02H3BO36.2Na2MO4·2H2O0.25KI0.83鐵鹽母液FeSO4·7H2O28.7Na2-EDTA37.3有機(jī)物母液煙酸(Vpp)0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素0.1肌醇100甘氨酸2（二）MS培養(yǎng)基配方第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十五頁，共48頁。1、MS培養(yǎng)基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計的。是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。特點(diǎn)：是無機(jī)鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。（三）常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十六頁，共48頁。2、White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。特點(diǎn)：無機(jī)鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。3、N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。特點(diǎn)：是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十七頁，共48頁。(4)B5培養(yǎng)基:是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計的。特點(diǎn)：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。(5)KM—8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。特點(diǎn)：是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十八頁，共48頁。

四、培養(yǎng)基的配制（一）、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:

①保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性②配制時的快速移?、郾阌诘蜏乇２?。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第三十九頁，共48頁。單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml或mg/L表示?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。配制生長素類：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。濃度為：1-5mg／ml。配制細(xì)胞分裂素類：一般先用少量0.5-1N鹽酸加熱溶解。濃度為：1-5mg／ml。第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制

母液的配制方法：第四十頁，共48頁。

ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制母液名稱藥品名稱

原配方量(mg)/L擴(kuò)大倍數(shù)

稱取量

(mg)母液體積

(ml)

移取量

(ml)/L大量元素母液

NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl·2H2O440104400MgSO4·7H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液MnSO4·H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860CoCl·6H2O0.0251002.5CuSO4·5H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO4·2H2O0.2510025KI0.8310083鐵鹽母液FeSO4·7H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有機(jī)物母液煙酸(Vpp)0.5502550010鹽酸吡哆醇0.55025鹽酸硫胺素0.1505肌醇100505000甘氨酸250100第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第四十一頁，共48頁。（二）培養(yǎng)基的配制及其滅菌1.配制方法：1、將母液按順序擺放2、取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器3、按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)4、加入蔗糖(30g/L)溶解5、加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min5、定容6、調(diào)PH值(pH=5