(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(71)申請(qǐng)人濱州醫(yī)學(xué)院地址264003山東省煙臺(tái)市萊山區(qū)觀海路346號(hào)(72)發(fā)明人林棟趙東乙李東升王非凡成凱(74)專利代理機(jī)構(gòu)煙臺(tái)微遠(yuǎn)知行知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)37453專利代理師毛毛CO7K5/103(200CO7K5/11((54)發(fā)明名稱保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽及其制備方法與應(yīng)用本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)兩步酶解從太平洋牡蠣肉中獲得了四個(gè)保護(hù)酒精性肝損傷的高F值寡肽，包括氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1~4所示的肽中的至少一種。四個(gè)高F值寡肽與ALDH受體對(duì)接能量分別為-7.1kcal/mol,-6.5kcal/mol,-8.0kcal/mol和-7.2kcal/mol。上述肽具備較高的ALDH激活率。本發(fā)明的保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣源高般烷基電荷吸引烷基21.保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1~4所示的肽中的至少一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣高F值寡肽，其特征在于，所述的牡蠣為太平洋牡蠣。3.如權(quán)利要求1或2所述的牡蠣高F值寡肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：S1.通過(guò)對(duì)牡蠣進(jìn)行酶解獲得牡蠣肽；S2.對(duì)牡蠣肽進(jìn)行序列鑒定；S3.篩選可與受體ALDH有效結(jié)合的牡蠣4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中：依次使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)牡蠣肉進(jìn)行酶解。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中：6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中：酶解后，使用超濾和納濾對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中：通過(guò)對(duì)酶解液進(jìn)行納濾和8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S2中：使用LC-MS/MS進(jìn)行多肽序列分析。9.如權(quán)利要求1或2所述的牡蠣高F值寡肽在食品中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求1或2所述的牡蠣高F值寡肽在制備保護(hù)酒精性肝損傷功能性食品或制備保護(hù)酒精性肝損傷藥物中的應(yīng)用。3保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽及其制備方法與應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]酒精性肝病(ALD)是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致肝臟損傷的重要疾病之一，隨著飲酒人群的擴(kuò)大和酗酒現(xiàn)象的增多，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。酒精進(jìn)入人體后，主要通過(guò)肝臟代謝，乙醇在乙醇脫氫酶(ADH)作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，而乙醛的毒性遠(yuǎn)高于乙醇，可直接損傷肝細(xì)胞，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。乙醛脫氫酶(ALDH)作為關(guān)鍵代謝酶，能將乙醛進(jìn)ALDH2基因突變或缺失，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的乙醛脫氫酶活性大大降低，使得乙醛在體內(nèi)長(zhǎng)期積累無(wú)法代謝，進(jìn)而引起毛細(xì)血管擴(kuò)張，引起皮膚潮紅和發(fā)炎，進(jìn)而會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，增加心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。高F值寡肽是一類功能性短肽，F(xiàn)值指支鏈氨基酸(BCAA)與芳香族氨基酸(AAA)含量的摩爾數(shù)比值，因其特殊的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)，在抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)肝臟代謝等方面展現(xiàn)出顯著潛力，被視為治療酒精性肝損傷的新型功能性物質(zhì)。高F值寡肽與ALDH相互作用而減輕乙醛對(duì)肝細(xì)胞的直接毒性作用，保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性。[0003]生物信息學(xué)工具輔助篩選活性肽，是基于活性肽中已知的氨基酸序列，利用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和軟件分析，對(duì)肽段可能的生物活性、安全性及生物可及性等進(jìn)行預(yù)測(cè)。在此基礎(chǔ)上選取目標(biāo)肽段進(jìn)行化學(xué)合成并對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)生物信息學(xué)工具能節(jié)省大量時(shí)間成本和實(shí)驗(yàn)成本。因此，使用生物信息學(xué)工具輔助篩選具有保護(hù)酒精性肝損傷功能的高F值寡肽，探究其與ALDH受體的相互作用，可為開(kāi)發(fā)保護(hù)酒精性肝損傷的功能性食品提供基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容[0004]本發(fā)明提供一種保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的高F值寡肽為牡蠣源高F值寡肽，可與ALDH受體有效結(jié)合，可以加速乙醇代謝、保護(hù)肝細(xì)胞免受乙醇誘導(dǎo)的損傷。本發(fā)明的目的之一是提供一種保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽，包括氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1~4所示的肽中的至少一種。4[0010]上述四個(gè)肽均為高F值寡肽。F值是指支鏈氨基酸(BCAA:Val,Ile,Leu)與芳香族氨基酸(AAA:Trp,Tyr,Phe)含量的摩爾數(shù)比值，高F值寡肽的F值應(yīng)大于20。本發(fā)明中的高F值寡肽是指F值大于20、并且由2~10個(gè)氨基酸組成的肽。上述四個(gè)肽均不含芳香族氨基酸。[0011]具體地，所述的牡蠣為太平洋牡蠣(Crassostreagigas),上述保護(hù)酒精性肝損傷的高F值寡肽分離提取自太平洋牡蠣肉。[0012]本發(fā)明的目的之二是提供上述牡蠣高F值寡肽的制備方法，包括如下步驟：S1.通過(guò)對(duì)牡蠣進(jìn)行酶解獲得牡蠣肽；S2.對(duì)牡蠣肽進(jìn)行序列鑒定；S3.篩選可與受體ALDH有效結(jié)合的牡蠣[0013]進(jìn)一步，步驟S1中：依次使用外切酶胃蛋白酶和內(nèi)切酶木瓜蛋白酶對(duì)牡蠣肉進(jìn)行酶解。向待處理原料中加入胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至2~4,30~37℃酶解3~6h,滅酶；再加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至6~8,55~65℃酶解2~4h,滅酶。[0015]其中，胃蛋白酶的添加量?jī)?yōu)選為以待處理原料(牡蠣肉)計(jì)800~1200U/g。[0016]其中，木瓜蛋白酶添加量?jī)?yōu)選為以待處理原料(牡蠣肉)計(jì)1800~2200U/g。[0017]具體地，步驟S1中：在對(duì)牡蠣肉進(jìn)行酶解前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。所述的預(yù)處理[0018]其中，牡蠣肉與水的用量比[0019]其中，優(yōu)選使用沸水浴進(jìn)行熱處理。[0020]其中，牡蠣中加的水優(yōu)選為超純水。地，優(yōu)選向酶解液中添加5wt%~15wt%[0022]進(jìn)一步，步驟S1中：酶解后，使用超濾和納濾對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化。使用納濾脫除酶解液中鹽和游離氨基酸，使用超濾脫除大分子物質(zhì)。具體地，優(yōu)選通過(guò)對(duì)酶解液進(jìn)行納濾和超濾，得到分子量200~3000Da組分。庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，得出全部肽的序列。優(yōu)選使用C18StageTip色譜柱進(jìn)行脫鹽。[0025]進(jìn)一步，步驟S3中：優(yōu)選使用pyrx軟件內(nèi)部的vina篩選可與ALDH受體有效結(jié)合的牡蠣高F值寡肽。[0026]本發(fā)明的目的之三是提供上述牡蠣高F值寡肽在食品中的應(yīng)用。[0027]本發(fā)明的目的之四是提供上述牡蠣高F值寡肽在制備保護(hù)酒精性肝損傷功能性食品或制備保護(hù)酒精性肝損傷藥物中的應(yīng)用。[0028]本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明通過(guò)兩步酶解從太平洋牡蠣肉中獲得了四個(gè)保護(hù)酒精性肝損傷的高F值寡肽，與ALDH受體對(duì)接能量分別為-7.1kcal/mol,-6.5kcal/mol,-8.0kcal/mol。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，上述肽具備較高5源高F值寡肽可用于功能性食品的研發(fā)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。附圖說(shuō)明[0029]圖1為氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的高F值寡肽與ALDH受體的分子對(duì)接結(jié)果圖2為氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的高F值寡肽與ALDH受體的分子對(duì)接結(jié)果圖3為氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的高F值寡肽與ALDH受體的分子對(duì)接結(jié)果圖4為氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的高F值寡肽與ALDH受體的分子對(duì)接結(jié)果具體實(shí)施方式[0030]以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0031]實(shí)施例中，使用的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶購(gòu)買自生工生物工程有限公司。實(shí)施例[0032]制備保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽，步驟如下：S1.制備牡蠣肽：(1)原料預(yù)處理：稱取太平洋牡蠣肉1kg,加入5L超純水并勻漿，沸水浴加熱15[0033](2)酶解：向步驟(1)獲得的勻漿液中加入以牡蠣肉計(jì)1000U/g的胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH3,35℃酶解6h,然后100℃煮沸滅酶；冷卻后，加入以牡蠣肉計(jì)2000U/g的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH6.5,55℃酶解4h,然后100℃煮沸滅酶；之后5000r/min離心15min,取上[0034](3)活性炭吸附：向步驟(2)獲得的酶解液中加入10wt%的活性炭，35℃攪拌2h,脫除芳香族氨基酸，得脫芳酶解液。[0035](4)分離純化：對(duì)步驟(3濾膜除鹽和游離氨基酸，之后選擇3000Da卷式膜進(jìn)行超濾，得到200~3000Da組分；冷凍干[0036]S2.對(duì)牡蠣肽進(jìn)行序列鑒定：將步驟S1得到的組分肽使用C18StageTip色譜柱脫鹽，并使用LC-MS/MS進(jìn)行多肽序列分析，通過(guò)與太平洋牡蠣蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，得出全部肽序列。通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心藥物主要有效成分的SDF格式文件，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)收集關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行清除水分子和小分子配體等優(yōu)化處理并用AutoDockTools進(jìn)行加氫與電荷處理并另存為pdbqt格式。以關(guān)鍵靶點(diǎn)ALDH為受體，以其6表兩者結(jié)合的結(jié)合能力，結(jié)合能越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。使用Pymol(https://詢，通過(guò)PeptideCutter工具和CPPpred工具對(duì)肽的耐消化特性和細(xì)胞膜穿透性進(jìn)行預(yù)[0039]表1保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽的氨基酸序列及對(duì)接能量序列ALDH對(duì)接能量(kcal/mol)氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1~4所示的肽與ALDH受體的分子對(duì)接結(jié)果依次見(jiàn)圖1~TRP-185,GLN-213,SER-263,GLN-366,TYR-442,GLU-212;如圖2所示，氨基酸序列如測(cè)試[0042]表2保護(hù)酒精性肝損傷的牡蠣高F值寡肽的ALDH激活率牡蠣高F值寡肽序列7[0043]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包