黑頸鶴（Grusnigricollis）越冬亞群之間的隔離與交流李來興中國科學院西北高原生物研究所2018年8月16日呼和浩特?局部種群的理解?科研數(shù)據(jù)的解讀?觀察結果的分析?保護實踐的總結-------存在重大誤區(qū)需要對黑頸鶴種群的亞群之間的基因交流狀況作出基本判斷或分析研究方法?種群規(guī)模評估------種群田間異步統(tǒng)計方法-------遺傳結構分析-------腸道微生物群落比較方法------種群田間異步統(tǒng)計方法------遺傳結構分析方法------腸道微生物群落比較方法研究結果?黑頸鶴種群規(guī)模評估?黑頸鶴越冬亞群分布?黑頸鶴越冬亞群遺傳樹狀圖分析?黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落關系樹狀圖分析------黑頸鶴越冬亞群分布------黑頸鶴越冬亞群之間遺傳距離分析------黑頸鶴越冬亞群之間遺傳距離分析POP1為西藏自治區(qū)黑頸鶴種群，POP2為云南省黑頸鶴種群，POP3為貴州省草海黑頸鶴種群，POP4為米林縣黑頸鶴種群。大尺度聚類分析的結果，不出預料地顯示出項目評價區(qū)越冬黑頸鶴亞群，與西藏越冬群類緣關系較近而與云貴越冬群類緣關系較遠。而當每個樣本進行比較時，給我們給出了幾方面的提示。首先是一個日喀則的亞群，代表了黑頸鶴最早的越冬群，而后分化出了分別在拉薩地區(qū)和貴州草海越冬的兩個亞群。最后一個大類，代表了幾乎整個黑頸鶴越冬棲息地的越冬亞群，它們聚成了一個大類，包括了在評價區(qū)分布的所有3個黑頸鶴越冬亞群，------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較?基于第二代高通量測序技術，不經(jīng)過分離培養(yǎng)微生物，直接對樣本中微生物的DNA進行測定。不斷更新的生物信息學分析方法，不僅可以讓科研工作者獲得準確的不同環(huán)境中微生物群落的組成信息和多樣性信息，還可以根據(jù)不同的實驗設計，比較不同空間或/和時間上微生物結構發(fā)生的變化，尋找變化規(guī)律；與環(huán)境因子的關聯(lián)性分析、共表達網(wǎng)絡分析、功能基因預測等深入的數(shù)據(jù)挖掘為進一步認知和理解環(huán)境微生物群落提供了有力的研究工具。?16SrRNA基因普遍存在于原核細胞，在細菌基因組中位于核糖體小亞基（約1540bp），該區(qū)域兼顧保守性和高變性，含有10個保守區(qū)域(ConservedRegions)和9個高變區(qū)域(VariableRegions)，保守區(qū)可用于設計引物進行目的片段的擴增，而通過對高變區(qū)的分析可以辨別細菌種類。因此，16SrRNA基因被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育學研究和物種分類鑒定。目前用于二代測序的區(qū)域主要有V3區(qū)，V6區(qū)，V1區(qū)，V3-V4區(qū)、和V4-V5區(qū)等。------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較采樣策略每個越冬群平行采集3份黑頸鶴新鮮糞便顆粒；越冬------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較Specaccum物種累積曲線橫坐標：樣本量；縱坐標：抽樣后的OTU數(shù)目?關于Alpha多樣性分析黑頸鶴腸道微生物群落Alpha多樣性分析結果，無論采用主坐標分析（PrincipalCoordinateAnalysis，PCoA），還是稀釋性曲線（rarefactioncurve）、香農-維納指數(shù)（Shannon-WienerIndex）等等，結果都相當一致：只要采樣得當，只需要少量樣品，就可滿足其腸道微生物群落中物種多樣性測試的需要。這一結論，盡管在本專題研究中，僅能說明采樣和測試及研究方法的準確性，對群落之間的的關系分析作用不明顯。但可以預見的是，黑頸鶴腸道微生物群落Alpha多樣性分析方法，對在以后的黑頸鶴對環(huán)境適應性研究和種群恢復和保護研究中，將發(fā)揮很大的作用。------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較?Beta多樣性分析Beta多樣性是對不同樣本/不同組間樣本的微生物群落構成進行比較分析?？梢杂肙TUs的豐度信息進行樣本間距離計算，也可以用OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關系進行計算。UniFrac[10]是用于比較生物群落的一種距離度量，它在計算過程中包含了遺傳距離（phylogeneticdistances）的信息,根據(jù)構建的進化樹枝的長度計量兩個不同環(huán)境樣品之間的差異。UniFrac分析分為WeightedUnifrac和UnweightedUnifrac兩種度量方法，兩者之間差異在于是否計入不同環(huán)境樣品的序列相對豐度。WeightedUnifrac算法在計算樹枝長度時將序列的豐度信息進行加權計算，因此UnweightedUnifrac可以檢測樣品間變化的存在，而WeightedUnifrac可以更進一步定量的檢測樣品間不同譜系上發(fā)生的變異。基于OTU豐度信息表計算Unifrac距離（UnweightedUnifrac）和WeightedUnifrac距離。距離矩陣可用于后續(xù)得Beta多樣性分析和可視化統(tǒng)計分析，從中發(fā)現(xiàn)不同樣品（組）間的差異。------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較?樹狀圖可以通過樹枝結構比較直觀地描述和比較多個樣品間的相基于距離矩陣，使用UPGMA（UnweightedMethodwithArithmeticmean)聚類方法進行分析構建進化樹，基UnweightedUnifrac距離的UPGMA聚類樹------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較分析結論不明確的原因分析本次利用腸道微生物群落比較分析不同黑頸鶴越冬亞群之間的類緣關系，在國內外尚屬首次，完全是一種方法論上的創(chuàng)新。就本專題而言，照搬生物群落學比較方面的方法，出現(xiàn)與預期結果不符的情況，是一種必然，故而需要改進。其次，采集策略僅考慮本專題目標，未與測試和分析專業(yè)人員討論、存在三維編號（田間、實驗室和制圖的編號不一致）、同一地點不同時間的采樣在編號、保存和分析時出現(xiàn)混淆、對數(shù)據(jù)或結果有不同理解的分析人員，對所謂的“壞”數(shù)據(jù)的選擇性剔除標準不一致，等，可能均會導致前述的分析結果的不明朗或不明確。------黑頸鶴越冬亞群腸道微生物群落相似性比較剔除一些干擾后的主坐標分析（PCoA）米林縣3個區(qū)域黑頸鶴種群與林周縣及日喀則市黑頸鶴種群的PCoA分析可以看出，米林縣仲尼瑪公園和農場區(qū)域的黑頸鶴種群和林周縣與日喀則市的黑頸鶴種群距離較近。而米林縣羌納鄉(xiāng)的黑頸鶴種群與上述地區(qū)表現(xiàn)出了較大差異。米林縣羌納鄉(xiāng)區(qū)域越冬黑頸鶴亞群與貴州省威寧縣草海區(qū)域黑頸鶴越冬亞群的主坐標分析圖米林縣羌納鄉(xiāng)區(qū)域越冬黑頸鶴亞群與貴州省威寧縣草海區(qū)域黑頸鶴越冬亞群的主坐標分析圖進一步，我們將米林縣羌納鄉(xiāng)的黑頸鶴種群與貴州省威寧縣草海保護區(qū)六個區(qū)域的黑頸鶴種群（樣本編號為CH）進行比較。如圖-6-15所示，米林縣羌納鄉(xiāng)的黑頸鶴種群與草海保鶴種群距離較近。綜上這些研究結果，我們認為，米林縣仲尼瑪公園和農場區(qū)域的黑頸鶴種群與西藏自治區(qū)林周縣和日喀則市的黑頸鶴種群，具有較為相近的腸道微生物組成。而米林縣羌納鄉(xiāng)區(qū)域的黑頸鶴種群則表現(xiàn)出與貴州省威寧縣草海保護區(qū)的黑頸鶴相似的腸道微生物組成。濕地公園越冬黑頸鶴亞群與米林農場越冬黑頸鶴亞群很可能來自具有相同或相似的微生物背景棲息地。這兩個亞群，可能從日喀則和拉薩河谷越冬的黑頸鶴亞群分離出來不久，雖然它們現(xiàn)在利用的是不同的越冬地，但很可能它們還在利用相同或相近的繁殖地。羌納鄉(xiāng)越冬黑頸鶴亞群雖然與其它兩個越冬亞群在利用同一塊越冬群（尼洋河河口及其40km以內的重點研