15I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。1番茄病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程GB/T34265Sanger法測序技術(shù)GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評價SN/T2497.21進出口危險化學品安全試驗方法第21部分：瓊脂糖凝反轉(zhuǎn)錄Reversereversetranscrip聚合酶鏈式反應polymerasechainr2脫氧核苷三磷酸、引物和緩沖液組成，反應過程主要包括變性、退火和延南方番茄病毒(Southern番茄斑駁花葉病毒(Tomatomottle番茄斑萎病毒(Tomatospottedw番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)。采用5點法抽樣。種植面積在2001m2以內(nèi)(含2001m2),抽檢100株。種植面積在2001m2到20010m2之間(含20010m2),前2001m2抽100株，之后每增2001m2增檢50株。種植面積超過20010m2時，前20010m2按上述方法抽樣，之后每增加2001m2增檢20株。運輸。樣品在檢測點存儲時間較短時(一般不超過24h),在4℃存放即可。長期存放樣品時，需要將樣3選擇市售的用于提取含有多糖多酚材料的RNADNA病毒檢測不執(zhí)行該步驟。以提取的質(zhì)量合格的總RNA為模板，選擇市售的具有基因組DNA去除功能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。市售產(chǎn)品通常為預混液或單品，根據(jù)所選產(chǎn)品提供的說明書，進行PCR反應混合物配制，并按書指示加入cDNA或DNA模板以及病毒檢測引物。各種病毒的特異AMVAMV-FaAMVAMV-RbACAAGATGTTTAAAGCCGTGAGAGCAATYGTGTCAATTTTA47.4.2PCR反應程序95℃預變性2min。35個反應循環(huán)：95℃變性20s;退火20s,退火溫度按引物合成報告設置，兩個引物退火溫度不一致時，取較低溫度；72℃延伸，延伸時間根據(jù)所選產(chǎn)品說明書提供的參數(shù)進行計算。最后，72℃終延伸5min。7.5瓊脂糖凝膠電泳檢測7.5.1瓊脂糖凝膠制備用Tris-乙酸緩沖液溶解瓊脂糖，制備質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的制備按照SN/T2497.21執(zhí)行。7.5.2電泳檢測用Tris-乙酸緩沖液，在水平板電泳槽中進行電泳。上樣、電泳按照SN/T2497.21執(zhí)行。電泳結(jié)束時，凝膠置于紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)進行觀測和拍照，獲取的圖片用于結(jié)果判定。8結(jié)果判定8.1異常結(jié)果根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖，與圖中DNA相對分子質(zhì)量標準品相比，從陰性對照樣品擴增到了預期大小的DNA片段，或從陰性對照和陽性對照樣品均未擴增到預期大小的DNA片段。此時，判定為檢測錯誤，應重新進行檢測。8.2陽性結(jié)果從陰性對照樣品未擴增到預期大小的DNA片段，從被檢測樣品擴增到了預期大小的DNA片段。有陽性對照時，從陽性對照擴增的DNA片段大小，與判定為陽性的樣品中擴增的DNA片段大小一致。此時，判定被檢測樣品為陽性，即番茄樣品攜帶了特定的病毒。8.3陰性結(jié)果從陰性對照和被檢測樣品中未擴增到預期大小的DNA片段，從陽性對照中擴增到預期大小的DNA片段。此時，判定被檢測樣品為陰性，即番茄樣品未攜帶被檢測病毒。9結(jié)果驗證當不具備陽性對照，只有陰性對照時，應當隨機選取3～5