第十三章甾體激素類藥物分析第一頁，共113頁。基本要求一、掌握本類藥物的化學結(jié)構(gòu)差異與分析方法的關(guān)系

掌握“其它甾體”、特殊雜質(zhì)檢查方法的基本原理二、熟悉四氮唑比色法、異煙肼法、Kober反應比色法熟悉紫外分光光度法含量測的基本方法和原理三、了解HPLC法，本類藥物的分類第二頁，共113頁?；窘Y(jié)構(gòu)：環(huán)戊烷駢多氫菲ABCD12345678910111213141516171819第三頁，共113頁。分類：甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素第四頁，共113頁。腎上腺皮質(zhì)激素氫化可的松第五頁，共113頁。腎上腺皮質(zhì)激素醋酸地塞米松第六頁，共113頁。雄性激素丙酸睪酮第七頁，共113頁。蛋白同化激素苯丙酸諾龍第八頁，共113頁。孕激素黃體酮第九頁，共113頁。雌激素炔雌醇第十頁，共113頁。一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應

C17

–

α–醇酮基還原性第十一頁，共113頁。2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應

C17–

β–羥基可成酯第十二頁，共113頁。3.孕激素主要活性基團性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化納反應C17–乙炔基與AgNO3反應第十三頁，共113頁。4.雌激素主要活性基團性質(zhì)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應C17–乙炔基與AgNO3反應C17–羥基可成酯第十四頁，共113頁。二、鑒別試驗（一）與強酸的呈色反應甾體激素類藥物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl（母核）第十五頁，共113頁。與硫酸顯色反應

顯色熒光加水稀釋潑尼松龍深紅

絮狀↓灰潑尼松橙

黃→藍綠炔雌醚橙紅

黃綠

↓紅色

炔雌醇橙紅

黃綠

絮狀↓玫紅醋酸可的松黃或微褪色并澄

帶橙清第十六頁，共113頁。(二)官能團的反應腎上腺皮質(zhì)激素藥物呈色四氮唑鹽OHˉ1C17

–

α–醇酮基還原性A.呈色反應第十七頁，共113頁。腎上腺皮質(zhì)激素藥物Cu2O↓橙紅色堿性酒石酸銅B.沉淀反應Ag↓黑色氨制硝酸銀第十八頁，共113頁。甾酮類激素藥物呈色羰基試劑2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼第十九頁，共113頁。異煙腙（黃色）睪酮第二十頁，共113頁。黃體酮異煙雙腙（黃色）第二十一頁，共113頁。具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物呈色亞硝基鐵氰化納間二硝基酚芳香醛3.甲酮基第二十二頁，共113頁。黃體酮藍紫色亞硝基鐵氰化納其他甾體淡橙色不顯色第二十三頁，共113頁。黃體酮第二十四頁，共113頁。藍紫色第二十五頁，共113頁。有機氟Fˉ有機破壞有機氯Clˉ4.有機鹵素茜素氟藍硝酸亞鈰硝酸—硝酸銀AgCl↓呈色第二十六頁，共113頁。茜素氟藍藍紫色F-第二十七頁，共113頁。雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸5.酚羥基第二十八頁，共113頁。含炔基的甾體激素銀鹽沉淀硝酸銀6.乙炔基↓第二十九頁，共113頁。炔雌醇白第三十頁，共113頁?！鱇OH(三)制備衍生物測定m.p.第三十一頁，共113頁。△△第三十二頁，共113頁。香（四）水解產(chǎn)物的反應第三十三頁，共113頁。特臭特臭第三十四頁，共113頁?！鳎?3-酮、苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu)1.結(jié)構(gòu)依據(jù)240nm左右280nm左右（五）UV法第三十五頁，共113頁?！鳎?3-酮240nm苯環(huán)280nm第三十六頁，共113頁。2.示例曲安西龍丙酸倍氯米松

溶劑甲醇乙醇20μg/ml濃度20μg/ml結(jié)果判斷在238nm處有最大吸收在239nm處有最大吸收，A為0.57～0.60，在239nm與263nm處的吸收度比值為2.25～2.45第三十七頁，共113頁。第三十八頁，共113頁。第三十九頁，共113頁。3300～3000cm-13000～2700cm-11900～1650cm-11650～1450cm-11000～650cm-1（六）IR法3750～3300cm-1ν第四十頁，共113頁。醋酸可的松結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC20–酮基、C11–酮基、醋酸酯第四十一頁，共113頁。1630cm-1ν3420cm-亞甲基、角甲基吸收帶1750cm-11232cm-11052cm-1第四十二頁，共113頁。結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC17–乙炔基炔諾酮第四十三頁，共113頁。1650cm-1ν3300cm-3270cm-1ν1615cm-1第四十四頁，共113頁。結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇第四十五頁，共113頁。1505cm-1ν3505cm-3300cm-1ν1590cm-13610cm-ν酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動第四十六頁，共113頁。（七）TLC法

主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別

方法：對照品法要求供試品溶液所顯主斑點的顏色和位置與對照品溶液的主斑點相同。第四十七頁，共113頁。炔諾酮TLC圖第四十八頁，共113頁。（八）HPLC法

主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）

方法：對照品法要求在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對照品峰的tR一致。第四十九頁，共113頁。三、雜質(zhì)檢查（一）其他甾體定義與標示藥物結(jié)構(gòu)不同的甾體化合物都稱為“其他甾體”第五十頁，共113頁。Li/NH3C2H5OH弱酸雌二醇－3－甲醚苯丙酸諾龍的合成路線III第五十一頁，共113頁。強酸苯丙酰氯HClIII第五十二頁，共113頁。

特點（1）可能存在多個甾體雜質(zhì)（2）結(jié)構(gòu)類似2.來源原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物第五十三頁，共113頁。4.方法（具有一定分離能力）

TLC法（高低濃度對比法）

HPLC法（類似高低濃度對比法）第五十四頁，共113頁。（1）TLC法（高低濃度對比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)斑點數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)斑點顏色第五十五頁，共113頁。醋酸氟輕松檢查其他甾體

取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作為供試液，精密量取適量，加氯仿-甲醇（9：1）稀釋成0.06mg/ml作為對照液；照薄層色譜法，各取5μl，分別點于同一硅膠G板上，以氯仿-甲醇（97:3）為展開劑，展開后晾干，在105℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍試第五十六頁，共113頁。液，立即檢視，供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于2個，其顏色與對照液的主斑點比較，不得更深。12第五十七頁，共113頁。（2）HPLC法（高低濃度對比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積第五十八頁，共113頁。

取本品適量，精密稱定，以無水乙醇為溶劑，配制成每1ml含2mg的溶液（1）與每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量測定項下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10μl注入液相色譜儀，調(diào)整儀器靈敏度，使主成分峰高度達記錄儀的滿量程。再分別取溶液（1）醋酸甲地孕酮檢查其他甾體第五十九頁，共113頁。

和溶液（2）各10μl，進樣。記錄至主成分峰保留時間的2倍。溶液（1）顯示的雜質(zhì)峰數(shù)不得超過4個，各雜質(zhì)峰面積及其總和分別不得大于溶液（2）主峰面積的1/2和3/4。供試溶液：溶液（1）2mg/ml對照溶液：溶液（2）0.04mg/ml第六十頁，共113頁。特點：（1）需特殊的儀器；（2）不需對照品；（3）可以控制雜質(zhì)的總量；

第六十一頁，共113頁。（二）游離磷酸地塞米松磷酸鈉氫化可的松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉氫化潑尼松磷酸鈉對照品法第六十二頁，共113頁。原理：方法：第六十三頁，共113頁。檢查游離磷酸地塞米松磷酸鈉

精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加鉬酸銨硫、酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，搖勻，在20℃放置30～50分鐘，照分光光度法，在740nm處測定吸收度，與對照液4.0ml同法處理的吸收度比較，不得更大。第六十四頁，共113頁。（對照液

0.0035%KH2PO4）第六十五頁，共113頁。（三）甲醇和丙酮（靈敏度法）甲醇不得出峰檢測限=3.1ng丙酮≤5.0%

內(nèi)標法+校正因子GC法第六十六頁，共113頁。地塞米松磷酸鈉檢查甲醇和丙酮

精密稱取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液2ml，加水稀釋至刻度，作為供試液；另精密量取甲醇10μl(≈7.9mg)與丙酮100μl(≈79mg)置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液20ml，加水至刻度，作為對照液。照氣相色譜法測定，含丙酮不得過5.0%，并不得出現(xiàn)甲醇峰。第六十七頁，共113頁。炔雌醇第六十八頁，共113頁。（四）雌酮原理Zimmermann反應堿性KOH乙醇高純度第六十九頁，共113頁。硒四、來源合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫劇毒原理方法第七十頁，共113頁。醋酸氟輕松檢查硒取本品50mg，照氧瓶燃燒法進行破壞后，將吸收液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用水15ml沖洗燃燒瓶及鉑絲，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒對照液（0.05ug/ml）和上述供試品溶液分別用氨試液調(diào)節(jié)pH值至2.00.2后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水第七十一頁，共113頁。

少量分次洗滌燒杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加鹽酸羥胺溶液（1→2）1ml，搖勻后，立即精密加二氨基奈試液5ml，搖勻，在室溫下放置100分鐘，精密加環(huán)己烷5ml，強烈振搖2′，靜置分層，取環(huán)己烷脫水后，測A378nm。

規(guī)定A供＜A對。第七十二頁，共113頁。第七十三頁，共113頁。四、含量測定（一）UV法△４-3-酮240nm（±）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯環(huán)280nm（±）雌激素第七十四頁，共113頁。（二）反應分光光度法1.適用于非分光光度活性藥物2.使待測組分光譜位移，避免干擾3.增加測定靈敏度4.增加選擇性弱、非分光光度活性藥物強分光光度活性藥物化學反應第七十五頁，共113頁。

腎上腺皮質(zhì)激素類C17-α－醇酮基強還原性1.原理OH-[還原]四氮唑比色法第七十六頁，共113頁。[O]OH-分子重排第七十七頁，共113頁。三苯甲瓚↓深紅氯化三苯四氮唑（TTC）紅四氮唑（RT）第七十八頁，共113頁。藍四氮唑（BT）第七十九頁，共113頁。雙甲瓚（暗藍）第八十頁，共113頁。2.方法ChPTTC（RT）BPTTC（RT）USPBT對照品法40～45′暗第八十一頁，共113頁。

醋酸潑尼松龍軟膏含量測定對照液：精密稱取醋酸潑尼松龍對照品20mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試液：精密稱取本品4g（約相當于醋酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分攪拌，使醋酸潑尼松龍溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取第八十二頁，共113頁。三次，濾液并入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法：精密量取上述溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40～50分鐘，照分光光度法，在485nm的波長處分別測定吸收度，計算，即得。操作應避光。第八十三頁，共113頁。3.討論（1）基團對反應速度的影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16無論何種取代基ν↓第八十四頁，共113頁。（2）溶劑、水分的影響含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→幾無反應—無醛無水乙醇醛→A↑—無水乙醇第八十五頁，共113頁。（3）O2與光線的影響反應過程反應產(chǎn)物怕光→避光、快速O2影響顏色強度和穩(wěn)定性→隔絕空氣、快速、充N2第八十六頁，共113頁。（4）堿的種類及加入順序反應應在強堿性（pH13.75）條件下進行以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序：第八十七頁，共113頁。（5）溫度與時間t℃↑→ν↑→甲瓚分解↑→%↓ChP25℃40～45′BP30℃1h第八十八頁，共113頁。4.特點：缺點影響因素太多優(yōu)點測定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應）第八十九頁，共113頁。腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基1.原理HCl（縮合）異煙肼比色法第九十頁，共113頁。異煙腙（黃色）第九十一頁，共113頁。2.方法暗45′對照品法第九十二頁，共113頁。

醋酸地塞米松軟膏含量測定對照液：精密稱取醋酸地塞米松對照品25mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，用無水乙醇稀釋至50ml，搖勻。供試液：精密稱取本品適量（約相當于醋酸地塞米松25mg），置燒杯中，加無水乙醇約25ml，置水浴中加熱，攪拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷卻，第九十三頁，共113頁。濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取三次，濾液并入量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法：精密量取上述溶液各10ml，分別置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，殘渣中加氯仿10ml，振搖，使殘渣溶解，各精密加0.1%異煙肼甲醇溶液10ml，搖勻，置55℃暗處保溫45分鐘，取出，放冷，用氯仿稀釋至25ml。搖勻，在415nm的波長處分別測定吸收度，計算即得。第九十四頁，共113頁。3.討論反應速度（1）C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反應反應專屬性C3－酮基第九十五頁，共113頁。（2）溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽→甲醇、乙醇無水甲醇無水乙醇第九十六頁，共113頁。（3）水分、O2與光線的影響含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時→

O2與光線無影響第九十七頁，共113頁。酸、異煙肼的量(3)鹽酸:異煙肼=2:1樣品:異煙肼=1:8→ν↑酸度↑→異煙肼鹽↓酸度↓→A↓溫度(4)t℃↑→ν↑第九十八頁，共113頁。1.原理λmax=465λmax=515雌激素Kober反應比色法△△第九十九頁，共113頁。第一百頁，共113頁。雌二醇-3-甲醚λmax=465λmax=515第一百零一頁，共113頁。鐵－酚試劑[(NH4)2Fe(SO4)2

+H2SO4+H2O2+苯酚]*鐵鹽的作用加快黃色產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化加強紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性*酚的作用加快紅色產(chǎn)物的形成消除反應產(chǎn)生的熒光Iron-phenolReagent第一百零二頁，共113頁。2.特點：優(yōu)點較高的靈敏度具有一定的選擇性缺點非化學計量反應反應應控制條件注意平行原則第一百零三頁，共113頁。（三）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多內(nèi)標法）特點用樣量少，靈敏度高，分離效果好，測定速度快（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設計的比色法有干擾）第一百零四頁，共113頁。方法

官能團

對象紫外△4-3-酮，△1，4-3-酮腎上腺皮質(zhì)激素芳香A環(huán)，酚羥基雌、雄激素，避孕藥四氮唑17位

-醇酮基腎上腺皮質(zhì)激素異煙肼△4-3-酮，△1，4-3-酮腎上腺皮質(zhì)激素雄激素，孕酮鐵-酚酚羥基雌激素2，4-二△4-3-酮，△1，4-3-酮腎上腺皮質(zhì)激素硝基苯肼C20酮基硝基苯肼雄激素，孕酮苯肼17、21-二羥基-20酮基腎上腺皮質(zhì)激素硝酸銀-乙炔基含乙炔基氫氧化鈉結(jié)構(gòu)與含量測定總結(jié)第一百零五頁，共113頁。

練習題1.甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應的基團

A.酚羥基

B.活潑次甲基

C.甲酮基