有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的測(cè)定主講教師：王旭峰農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)員2學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握食品中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定的原理；了解有機(jī)氯農(nóng)藥的特性及危害；掌握有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定的操作步驟；能夠正確制備各類食品樣品；能夠熟知有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定過(guò)程中的注意事項(xiàng)。3一、檢測(cè)依據(jù)目前現(xiàn)行的《食品中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的測(cè)定》采用的國(guó)標(biāo)是GB/T5009.19——2008《食品中有機(jī)氯農(nóng)藥多組分殘留量的測(cè)定》，2008年12月3日發(fā)布，2009年3月1日實(shí)施。4一、有機(jī)氯農(nóng)藥概述有機(jī)氯農(nóng)藥（簡(jiǎn)稱Ocp）是一類組成里含有氯的有機(jī)殺蟲(chóng)劑、殺菌劑。一般分為兩大類：一類是滴滴涕類，稱為氯代苯及其衍生物，包括滴滴涕及六六六等；另一類是氯化甲撐萘類，如艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、七氯、氯丹及毒殺芬等。我國(guó)曾經(jīng)使用較多的是滴滴涕和六六六。滴滴涕、六六六具有廣譜、高效、價(jià)康、使用方便、中等毒性等優(yōu)點(diǎn)，從20世紀(jì)40年代使用以來(lái)，使用量曾達(dá)到農(nóng)藥總量的60%~70%。但是其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界中不易分解，長(zhǎng)期使用，會(huì)連年積累，致使土壤、水域、農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)農(nóng)藥積累增多。我國(guó)已于1983年停止生產(chǎn)。5二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（一）原理試樣中有機(jī)氯農(nóng)藥組分經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凝膠色譜層析凈化，用毛細(xì)管柱氣相色譜分離。電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。6二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（二）試劑（1）丙酮。分析純，重蒸。（2）石油醚。沸程30~60℃，分析純，重蒸。（3）乙酸乙酯。分析純，重蒸。（4）環(huán)已烷。分析純，重蒸。（5）正已烷。分析純，重蒸。（6）氯化鈉。（7）無(wú)水硫酸鈉。無(wú)水硫酸鈉置于干燥箱中，120℃干燥4h，冷卻后密閉保存。（8）聚苯乙烯凝膠（Bio-BeadsS-X3）：200~400目，或同類產(chǎn)品。7二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（9）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。a-六六六、β-六六六、γ-六六六，δ-六六六、p，p'-滴滴伊、p，p'-滴滴滴、o，p'-滴滴涕、p，p'-滴滴涕、六氯苯、五氯硝酸苯、五氯苯胺、五氯苯基硫醚、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、異狄氏劑醛、異狄氏劑酮、七氯、環(huán)氧七氯、氧氯丹、反氯丹、順氯丹、α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸鹽、滅蟻靈，純度>98%。（10）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確稱取或量取上述農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量，用少量苯溶解后，用正己烷稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正已烷稀釋為系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。8二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（三）儀器（1）氣相色譜儀。配電子捕獲檢測(cè)器（ECD）。（2）凝膠凈化柱。長(zhǎng)30cm，內(nèi)徑2.3~2.5cm具塞玻璃層析柱，柱底墊少許玻璃棉。用洗脫劑乙酸乙酯-環(huán)已烷（1+1）浸泡的凝膠，以濕法裝入柱中，柱床高約26cm，凝膠始終保持在洗脫劑中。（3）全自動(dòng)凝膠色譜系統(tǒng)。帶有固定波長(zhǎng)（254nm）紫外檢測(cè)器。供選擇使用。（4）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。（5）組織勻漿器。（6）振蕩器。（7）氮?dú)鉂饪s器。9二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（四）測(cè)定步驟1.試樣制備蛋品去殼，制成勻漿；肉品去筋后，切成小塊，制成肉糜；乳品混勻待用。2.提取與分配（1）蛋類：稱取試樣20g(精確到0.01g)于200mL具塞三角瓶中，加水5mL(視試樣水分含量加水，使總水量約為20g。通常鮮蛋水分含量約75%，加水5mL即可)再加入40mL丙酮，振搖30min后，加入氯化鈉6g，充分搖勻，再加入30mL石油醚，振搖30min。10二、毛細(xì)管柱氣相色譜法（1）蛋類：靜置分層后，將有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至100mL具塞三角瓶中經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，并量取35mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至約1mL，加入2mL乙酸乙酯-環(huán)已烷(1+1)溶液再濃縮，如此重復(fù)3次，濃縮至約1mL供凝膠色譜層析凈化使用，或?qū)饪s液轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)凝膠滲透色譜系統(tǒng)配套的進(jìn)樣試管中，用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1+1)溶液洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶數(shù)次，將洗滌液合并至試管中，定容至10mL。11二、毛細(xì)管柱氣相色譜法2.提取與分配（2）肉類：稱取試樣20g(精確到0.01g)，加水15mL(視試樣水分含量加水，使總水量約20g)。加40mL丙酮，振搖30min，以下按照蛋類試樣的提取、分配步驟處理。（3）乳類：稱取試樣20g(精確到0.01g)，鮮乳不需加水，直接加丙酮提取。以下按照蛋類試樣的提取、分配步驟處理。12二、毛細(xì)管柱氣相色譜法2.提取與分配（4）大豆油樣品：稱取具有代表性試樣1g（精確至0.01g），直接加入30mL石油醚，振搖30min后，將有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至約1mL，加2mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶解再濃縮，如此重復(fù)3次，濃縮至約1mL，供凝膠色譜層析凈化用。或?qū)饪s液轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)凝膠色譜系統(tǒng)配套的進(jìn)樣試管中，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶液洗滌蒸發(fā)瓶數(shù)次，將洗滌液合并至試管中，定容至10mL。13二、毛細(xì)管柱氣相色譜法2.提取與分配（5）植物類：稱取試樣勻漿20g，加水5mL(視其水分含量加水，使總水量約20mL)，加丙酮40mL，振蕩30min，加氯化鈉6g，搖勻。加石油醚30mL，再振蕩30min，以下按照蛋類試樣的提取、分配步驟處理。14二、毛細(xì)管柱氣相色譜法3.凈化選擇下列手動(dòng)或全自動(dòng)凈化方法中的任何一種。（1）手動(dòng)凝膠色譜柱凈化。將試樣濃縮液經(jīng)凝膠柱以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶液洗脫，棄去0~35mL流分，收集35~70mL流分。將其用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1mL，再用凝膠柱以乙酸乙酯-環(huán)已烷（1+1）溶液洗脫，收集35~70mL流分。蒸發(fā)濃縮后，再用氮?dú)獯党軇?，用正已烷定容?mL，供氣相色譜分析用。15二、毛細(xì)管柱氣相色譜法3.凈化（2）全自動(dòng)凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化。試樣由5mL試樣環(huán)注入凝膠滲透色譜柱，泵流速5.0mL/min，以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶液洗脫，棄去0~7.5mL流分，收集7.5~15mL流分，15~20min沖洗凝膠滲透色譜柱，凈收集的流分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1mL，再用氮?dú)獯党軇谜和槎ㄈ葜?mL，供氣相色譜分析用。16二、毛細(xì)管柱氣相色譜法

17二、毛細(xì)管柱氣相色譜法4.測(cè)定（2）色譜分析。分別吸取1μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣凈化液注入氣相色譜儀分離分析，記錄色譜圖，以保留時(shí)間定性，以試樣和標(biāo)準(zhǔn)的峰高或峰面積比較定量。18二、毛細(xì)管柱氣相色譜法

19三、填充柱氣相色譜法（一）原理樣品中六六六、滴滴涕經(jīng)提取、凈化后用氣相色譜法測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。電子捕獲檢測(cè)器對(duì)于負(fù)電極強(qiáng)的化合物具有較高的靈敏度，利用這一特點(diǎn)，可分別測(cè)出微量的六六六和滴滴涕。不同異構(gòu)體和代謝物可同時(shí)分別測(cè)定。20三、填充柱氣相色譜法（二）試劑使用的試劑一般系分析純，有機(jī)溶劑需經(jīng)重蒸餾。（1）丙酮。（2）正已烷（3）石油醚。沸程30~60℃。（4）苯。（5）硫酸。（6）無(wú)水硫酸鈉。（7）硫酸鈉溶液（20g/L）。21三、填充柱氣相色譜法

（8）六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱取甲、乙、丙、丁六六六四種異構(gòu)體和p，p'-滴滴涕、p，p'-滴滴滴、p，p'-滴滴伊、o，p'-滴滴涕、（a-HCH、β-HCh、γ-HCH、δ-HCH、p，p'-DDT、p，p'-DDD、p，p'-DDE、o，p'-DDT）各10.0mg，溶于苯，分別移入100mL容量瓶中，加苯至刻度，混勻，每毫升含農(nóng)藥100.0μg，作為儲(chǔ)備液存于冰箱中。

（9）六六六、滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一容量瓶，以己烷稀釋至適宜濃度，α-HCH、γ-HCH、δ-HCH的濃度為0.005μg/mL；β-HCH、p，p'-DDE的濃度為0.01μg/mL，o，p'-DDT濃度為0.05μg/mL，p，p'-DDD的濃度為0.02μg/mL、p，p'-DDT的濃度為0.1μg/mL。22三、填充柱氣相色譜法（三）儀器（1）小型粉碎機(jī)。（2）勻漿機(jī)?？刹捎媒M織搗碎機(jī)。（3）電動(dòng)振蕩器。（4）離心機(jī)。（5）旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)器。（6）吹氮濃縮器。（7）氣相色譜儀，具有電子捕獲檢測(cè)器（ECD）。23三、填充柱氣相色譜法（四）測(cè)定步驟1.試樣制備谷物制成粉末，其制品制成勻漿；食用油混勻后，待用。2.提?。?）稱取具有代表性的樣品勻漿20g，加水5mL（視水分含量加水，使總水量約20mL），加丙酮40mL，振蕩30min，加氧化鈉6g，搖勻。加石油醚30mL，再振蕩30min，靜置分層。取上清液35mL經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，以石油醚定容至5mL，加濃硫酸0.5mL，振搖0.5min，3000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液進(jìn)行GC分析。24三、填充柱氣相色譜法2.提?。?）稱取具有代表性的粉末樣品2.00g，加石油醚20mL，振蕩30min，過(guò)濾，濃縮，定容至5mL，加濃硫酸0.5mL，振搖0.5min，3000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液進(jìn)行GC分析。（3）稱取具有代表性的均勻食用油樣品0.50g，以石油醚溶解于10mL試管中定容至10.0mL，加濃硫酸1.0mL，振搖0.5min，3000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液進(jìn)行GC分析。25三、填充柱氣相色譜法3.氣相色譜參考條件（1）色譜柱。內(nèi)徑3mm，長(zhǎng)2m的玻璃柱，內(nèi)裝涂以1.5%OV-17和2%QF-1的混合固定液的80~100目硅藻土。（2）檢測(cè)器。電子捕獲檢測(cè)器。汽化室溫度：195℃；色譜柱溫度：185℃；檢測(cè)器溫度：225℃。載氣（氮?dú)猓┝魉伲?10mL/min。4.測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)使用液及樣品提取凈化溶液的進(jìn)樣量為1~10μL，外標(biāo)法定量。26三、填充柱氣相色譜法

27三、填充柱氣相色譜法結(jié)果的表述：報(bào)告平行測(cè)定的算術(shù)平均值的二位有效數(shù)。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%（即相對(duì)相差≤15%）。28三、填充柱氣相色譜法（六）說(shuō)明（1）有機(jī)氯農(nóng)藥為弱極性物質(zhì)，因而提取選用弱極性溶劑——石油醚提取。此外，提取溶劑的沸點(diǎn)以45~80℃為宜，因?yàn)榉悬c(diǎn)太低，容易揮發(fā)，而沸點(diǎn)太高，則不易濃縮。在選擇提取劑時(shí)，還要考慮溶劑的穩(wěn)定性，即溶劑不能與樣品發(fā)生作用，提取溶劑還不能含氯。29三、填充柱氣相色譜法（2）磺化法是在提取液中，直接加入1/10量的濃硫酸，振搖后，其中油脂、色素等干擾物質(zhì)，遇到濃硫酸就磺化為極性較大且易溶于水的化合物。利用這一反應(yīng)，使提取液中主要干擾物質(zhì)油脂、色素磺化后，與有機(jī)層分離而除去?；腔ㄖ饕糜趯?duì)酸穩(wěn)定性的滴滴涕、六六六等有機(jī)氯農(nóng)藥。它具有操作簡(jiǎn)便，不受任何影響的優(yōu)點(diǎn)。此外，也可采用柱層析、液-液分配等操作凈化，但這類凈化步驟繁瑣、有機(jī)溶劑用量大，農(nóng)藥也容易損失。30三、填充柱氣相色譜法（3）采用離心法分離石油醚提取液較原有方法所采用的液液分配法，分離更徹底，能有效地消除水溶性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響，保護(hù)色譜柱和檢測(cè)器。原有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用的在分液漏斗中進(jìn)行液液分配，需要較長(zhǎng)時(shí)間的靜置分層。（4）有機(jī)氯農(nóng)藥易揮發(fā)，故揮干溶劑時(shí)溫度勿高于60℃，最好50℃減壓揮干。干后不能久置，應(yīng)立即加入溶劑，否則回收率將降低。減壓濃縮時(shí)，千萬(wàn)注意不要蒸至全干，如蒸至全干，結(jié)果偏低。31三、填充柱氣相色譜法（5）樣品經(jīng)凈化、濃縮、定容之后，不能含有水分，以免污染電子捕獲檢測(cè)器，降低靈敏度。若樣品凈化不干凈或試劑有問(wèn)題（必要時(shí)所用試劑要重蒸處理）時(shí)，檢測(cè)器易受污染，其靈敏度即會(huì)降低，此時(shí)基流會(huì)明顯下降，若用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，此時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行，讓檢測(cè)器自凈片刻，基流回復(fù)原來(lái)水平后再進(jìn)行，否則結(jié)果偏低（若用內(nèi)標(biāo)