第2章

細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程1890年，希普（W.

Heape，1855-1929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。1907年，哈里森（R.

G.Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法。1951年，張明覺（1908-1991）等發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子的獲能現(xiàn)象。1958年，格登（J.Gurdon，1933-）用非洲爪蟾進(jìn)行體細(xì)胞核移植，成功培育出性成熟個體。同一時期，童弟周（1902-1979）等開展了魚類細(xì)胞核移植工作。1959年試管兔誕生，之后多種試管動物相繼出生。1975年，米爾斯坦（C.Milstein，1927-2002）和科勒（G.

K?hler，1946-1995）等創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)。1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941-）等成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細(xì)胞。1996年，世界上第一只細(xì)胞克隆羊多莉在英國誕生。隨后多種克隆動物相繼問世。2006年，山中伸彌（S.Yamanaka，1962-）等獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。我國科學(xué)家利用這種細(xì)胞培育出了小鼠。2014年，世界上第一個用單細(xì)胞基因組測序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。2017年，我國科學(xué)家首次培育出體細(xì)胞克隆猴。動物細(xì)胞工程（含胚胎工程）

在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？通過細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚

可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增；——動物細(xì)胞培養(yǎng)

目前，科學(xué)家還在研究對皮膚干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚?！杉?xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)

從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。原理：細(xì)胞增殖大致過程：動物體組織單個細(xì)胞細(xì)胞生長和增殖取出分散適宜條件地位：動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件

動物體內(nèi)的細(xì)胞之所以能夠維持正常的生命活動，是因為機(jī)體給這些細(xì)胞提供了適宜的條件，包括充足的營養(yǎng)和穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境等。動物細(xì)胞培養(yǎng)（模擬體內(nèi)細(xì)胞正常生長增殖的環(huán)境）也需要滿足這些條件。動物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件營養(yǎng)條件其他條件糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素

……無菌、無毒的環(huán)境；適宜溫度、pH和滲透壓；適宜的氣體環(huán)境。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.營養(yǎng)（1）已知營養(yǎng)成分細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)(糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素等);動物細(xì)胞常用的糖類是葡萄糖，與植物組織培養(yǎng)常用蔗糖不同將細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基稱為合成培養(yǎng)基。（2）未知營養(yǎng)成分血清(含人類未知、細(xì)胞生長增殖所必需的物質(zhì))等天然成分;營養(yǎng)條件：合成培養(yǎng)基+血清等天然成分（3）培養(yǎng)基的類型（物理性質(zhì)）一般使用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液。為什么對動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時通常要添加血清？1、血清中含有必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，這些都是細(xì)胞生長和代謝所必需的。2、血清中含有多種細(xì)胞生長因子，如上皮生長因子（EGF）、血小板源生長因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，這些因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。3、血清中含有多種激素，如胰島素和促生長激素，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長。4、血清中的某些成分（粘附分子）可以幫助細(xì)胞粘附到培養(yǎng)容器上，這對于許多細(xì)胞系的生長是必要的。5、血清中的某些成分可以結(jié)合和去除培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)，起到一定的解毒作用，減少有毒物質(zhì)對細(xì)胞的毒害。至今血清中仍有許多對細(xì)胞生長有利的因子未研究清楚。血清中含有多種未知的促細(xì)胞生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，這是細(xì)胞生長和增殖所必需的。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件2.無菌、無毒的環(huán)境（1）無菌：培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具滅菌處理；無菌操作；適量添加抗生素。（2）無毒：定期更換培養(yǎng)液。清除代謝物，防止代謝物積累對細(xì)胞自身造成危害。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件3.溫度、pH和滲透壓（1）溫度：哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以36.5±0.5℃為宜；（2）pH：多數(shù)動物細(xì)胞生存的適宜pH為；（3）滲透壓：適宜的滲透壓維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件4.氣體環(huán)境（1）氣體的組成及作用：95%空氣

+

5%CO2；O2:細(xì)胞代謝所必需CO2:維持培養(yǎng)液的pH（2）培養(yǎng)裝置：培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿（3）培養(yǎng)儀器：CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱養(yǎng)二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)取動物組織制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液進(jìn)行原代培養(yǎng)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代培養(yǎng)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分散成單個細(xì)胞二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)取材對象:一般取材于動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。取材原因:細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，容易培養(yǎng)。取動物組織二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)或膠原蛋白酶方法:機(jī)械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間。思考:1.為什么要分散成單個細(xì)胞？2.用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理說明動物細(xì)胞間的物質(zhì)

主要是什么成分？動物細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖（接觸抑制）；細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，有利于細(xì)胞生長和增殖。蛋白質(zhì)二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)或膠原蛋白酶方法:機(jī)械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間。思考:3.可以用胃蛋白酶來處理組織嗎？

4.胰蛋白酶處理時間過長，會怎樣？？不可以，因為胃蛋白酶的最適PH為1.5左右；長時間會分解細(xì)胞膜蛋白，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，把細(xì)胞消化掉。注意控制時間和酶用量。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)操作:往分散的單個細(xì)胞中加入培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。制成細(xì)胞懸液二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng)直接在培養(yǎng)皿進(jìn)行原代培養(yǎng)原代培養(yǎng):指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞類型：能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖；需要貼附于某些基質(zhì)表面才能生長增殖。（大多數(shù)）細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等細(xì)胞分裂受阻接觸抑制二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng)直接在培養(yǎng)皿進(jìn)行原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)的特點(diǎn):細(xì)胞貼壁接觸抑制培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。對細(xì)胞進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖。瓶壁上的細(xì)胞是單層細(xì)胞。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng):分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)思考:如何收集原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)？懸浮生長的細(xì)胞直接用離心法收集；貼壁生長的細(xì)胞先用胰蛋白酶等處理,使之分散成單個細(xì)胞，然后再用離心法收集。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng):分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)思考:細(xì)胞可以一直進(jìn)行傳代培養(yǎng)嗎？分瓶培養(yǎng)后的細(xì)胞一般傳至10代左右，細(xì)胞的生長、分裂就會出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，但也有極少數(shù)細(xì)胞能存活下來，并可傳至40-50代，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后會再次出現(xiàn)停滯，不能繼續(xù)傳代，但有部分細(xì)胞的細(xì)胞核型(遺傳物質(zhì))發(fā)生了改變，并帶有癌變的特點(diǎn)，從而有可能在適宜培養(yǎng)條件下無限傳代下去，這種傳代細(xì)胞叫作細(xì)胞系。動物細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)前處理取材培養(yǎng)基的物理性質(zhì)培養(yǎng)基的成分特有成分相同點(diǎn)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖離體用機(jī)械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細(xì)胞分散開離體植物器官、組織、細(xì)胞動物胚胎或幼齡動物的組織、器官固體液體(又稱培養(yǎng)液)水、有機(jī)營養(yǎng)成分、無機(jī)營養(yǎng)成分、植物激素糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)及血清等天然成分植物激素血清細(xì)胞分裂方式都是有絲分裂；都要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作。三、干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.概念：干細(xì)胞是指動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞。在一定條件下，干細(xì)胞可以分化成其他類型的細(xì)胞。2.分布：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。3.分類：三、干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用4.胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞分布特點(diǎn)應(yīng)用實(shí)例局限性早期胚胎中具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個體的潛能。在體外分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)元和造血干細(xì)胞等。必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題。三、干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用5.成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞成體組織或器官內(nèi)造血干細(xì)胞（骨髓、外周血和臍帶血中）神經(jīng)干細(xì)胞（神經(jīng)系統(tǒng)中）精原干細(xì)胞（睪丸中）具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕　柎暮Ｄ〉龋┲委煱籽〖耙恍盒阅[瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病造血干細(xì)胞

→神經(jīng)干細(xì)胞→分布舉例特點(diǎn)應(yīng)用實(shí)例三、干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用6.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過體外誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞將特定基因，特定蛋白導(dǎo)入細(xì)胞；用小分子化合物誘導(dǎo)形成。誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎；可以避免免疫排斥反應(yīng)。來源制備方法優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用實(shí)例iPS細(xì)胞可治療鐮狀細(xì)胞貧血癥；在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究也取得新進(jìn)展2006年，日本科學(xué)家山中伸彌，從24個對胚胎干細(xì)胞維持十分重要的基因中篩選出4個基因組合（Oct4、Sox2、c-myc和KLF4），在小鼠的成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，成功誘導(dǎo)出一種多能干細(xì)胞，稱“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”（iPS細(xì)胞），并用iPS細(xì)胞治療了小鼠的鐮狀細(xì)胞貧血。2012年山中伸彌與約翰·戈登一起獲得諾貝爾生理學(xué)獎或醫(yī)學(xué)獎。體細(xì)胞iPS細(xì)胞細(xì)胞衰老腫瘤細(xì)胞Oct3/4Sox2Klf4c-Mycc-Myc作為原癌基因，一方面促進(jìn)細(xì)胞的自我更新，另一方面也增加了細(xì)胞的成瘤性。下列有關(guān)動物細(xì)胞培養(yǎng)時所提供的物質(zhì)及其作用的描述不正確的是(

)選項提供物質(zhì)作用A抗生素主要防止動物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中被病毒感染B血清補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)C氧氣滿足細(xì)胞代謝的需要D二氧化碳維持培養(yǎng)液的酸堿度A

如圖為動物成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)過程示意圖。下列敘述正確的是

(

)A.步驟①的操作不需要在無菌環(huán)境中進(jìn)行B.步驟②中用鹽酸溶解細(xì)胞間物質(zhì)使細(xì)胞分離C.步驟③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶處理D.步驟④培養(yǎng)過程中不會發(fā)生細(xì)胞癌變C

下圖為幼鼠腎臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程示意圖，下列有關(guān)敘述錯誤的是(

)A．甲→乙過程通常需要剪碎后，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理B．在丙中培養(yǎng)的細(xì)胞通常在10代以內(nèi)，一般未發(fā)生癌變C．丁過程表示傳代培養(yǎng)，大多細(xì)胞一般能增殖10～50代D．培養(yǎng)過程中應(yīng)提供5%CO2和95%O2的氣體環(huán)境，以維持培養(yǎng)液正常的pHD

左圖為動物細(xì)胞培養(yǎng)過程示意圖，請回答以下幾個問題：（1）容器A中的動物器官或組織首先要剪碎，然后用胰蛋白酶處理，其目的是___________________________；（2）培養(yǎng)先在B瓶中進(jìn)行。瓶中的培養(yǎng)基成分有葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和______________等。當(dāng)細(xì)胞分裂生長到__________時，就會停止增殖，需用胰蛋白酶處理后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，稱為_________。（3）有一類不正常的動物細(xì)胞，體外培養(yǎng)不受接觸抑制機(jī)制的制約而表現(xiàn)為“瘋長”，這類細(xì)胞最可能是________。使組織分散成單個細(xì)胞傳代培養(yǎng)動物血清癌細(xì)胞相互接觸一、概念檢測1.判斷下列有關(guān)動物細(xì)胞培養(yǎng)的表述是否正確。(1)培養(yǎng)環(huán)境中需要O?，不需要CO?。()(2)細(xì)胞要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。()(3)培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清。()(4)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞需定期用胰蛋白酶處理，分瓶