AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響及羅格列酮干預(yù)機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義近年來，糖尿病與惡性腫瘤之間的關(guān)聯(lián)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，糖尿病患者患多種惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，其中糖尿病與結(jié)腸癌的關(guān)系尤為密切。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患者結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者明顯升高，且糖尿病病史越長，結(jié)腸癌的罹患危險(xiǎn)越高。這種現(xiàn)象背后的機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。糖尿病患者體內(nèi)由于血糖代謝紊亂，長期處于高血糖狀態(tài)，這使得體內(nèi)過多的葡萄糖與脂肪、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生非酶促反應(yīng)，即美拉德反應(yīng)，大量生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advancedglycationendproducts,AGEs）。AGEs在體內(nèi)的積累是糖尿病引發(fā)結(jié)腸癌的關(guān)鍵因素之一。AGEs可以與細(xì)胞表面的糖基化終產(chǎn)物受體（receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE）特異性結(jié)合，激活下游多條信號通路，從而參與腫瘤的氧化應(yīng)激、凋亡、增殖、侵襲等一系列生物學(xué)過程。在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中，AGEs通過與RAGE結(jié)合，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）等信號通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、抑制凋亡，增強(qiáng)其侵襲和遷移能力，甚至誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。目前，針對糖尿病合并結(jié)腸癌患者的治療面臨諸多挑戰(zhàn)。常規(guī)的化療藥物在治療結(jié)腸癌時，不僅存在明顯的副作用，對患者的身體機(jī)能造成較大損害，而且對于糖尿病患者而言，可能會影響血糖控制，加重代謝紊亂。此外，長期使用化療藥物還容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果大打折扣。因此，尋找一種安全有效的治療方法或藥物，既能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，又能兼顧糖尿病患者的特殊生理狀態(tài)，成為亟待解決的問題。羅格列酮作為一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）激動劑，最初用于治療2型糖尿病，通過提高胰島素敏感性來控制血糖水平。近年來，其在抗腫瘤領(lǐng)域的作用逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化以及直接的抗腫瘤作用，對多種癌細(xì)胞具有抗增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用。在結(jié)腸癌細(xì)胞研究中，羅格列酮能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并阻滯細(xì)胞周期，還能增強(qiáng)其他抗癌藥物的療效，起到化療增敏的作用。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制相關(guān)信號通路的激活等有關(guān)。然而，羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在糖尿病相關(guān)的結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制研究仍有待深入?；谝陨媳尘?，本研究聚焦于AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用。通過深入探究這兩者的作用機(jī)制，有望揭示糖尿病與結(jié)腸癌之間的潛在聯(lián)系，為糖尿病合并結(jié)腸癌患者提供新的治療靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，有助于進(jìn)一步完善對糖尿病與結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)性的認(rèn)識，豐富腫瘤生物學(xué)和糖尿病并發(fā)癥的研究內(nèi)容；在臨床實(shí)踐中，為開發(fā)更安全、有效的結(jié)腸癌治療藥物和方案提供理論依據(jù)，改善患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在糖尿病與結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得諸多成果，尤其是對AGEs在其中所起作用的探索。國外早在20世紀(jì)末就開始關(guān)注糖尿病與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)系，有研究通過大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于非糖尿病群體。在AGEs對結(jié)腸癌細(xì)胞影響的研究方面，國外學(xué)者利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型深入探究其機(jī)制。研究表明，AGEs與結(jié)腸癌細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，可激活ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的研究中，發(fā)現(xiàn)AGEs能增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且與JAK2/STAT3信號通路的激活相關(guān)。國內(nèi)研究也證實(shí)了AGEs在糖尿病引發(fā)結(jié)腸癌過程中的關(guān)鍵作用。有團(tuán)隊(duì)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AGEs可上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中RAGE的表達(dá)，激活相關(guān)信號通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在動物實(shí)驗(yàn)中，給糖尿病小鼠模型注射AGEs后，觀察到結(jié)腸腫瘤的生長加速，進(jìn)一步驗(yàn)證了AGEs對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用。關(guān)于羅格列酮在抗腫瘤方面的研究，國外起步較早，多項(xiàng)研究顯示其對多種癌細(xì)胞具有抑制作用。在結(jié)腸癌研究中，國外有實(shí)驗(yàn)表明羅格列酮能夠阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。同時，在聯(lián)合化療藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)羅格列酮能增強(qiáng)氟尿嘧啶等藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用，提高化療效果。國內(nèi)學(xué)者對羅格列酮的研究也不斷深入，不僅證實(shí)了其對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，還從分子機(jī)制層面進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，影響相關(guān)信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。在臨床前研究中，通過構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)羅格列酮能夠抑制腫瘤的生長，且與其他治療方法聯(lián)合使用時效果更佳。然而，目前的研究仍存在一定不足。在AGEs對結(jié)腸癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究中，雖然已明確其與多條信號通路相關(guān)，但各信號通路之間的交互作用以及在不同微環(huán)境下的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。在羅格列酮的研究方面，雖然已證實(shí)其具有抗腫瘤活性，但最佳的用藥劑量、療程以及與其他藥物聯(lián)合使用的最佳方案仍有待進(jìn)一步探索。此外，羅格列酮在體內(nèi)的代謝過程以及長期使用可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)也需要更多的研究來評估。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響，并全面解析羅格列酮在這一過程中的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制。具體而言，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，從細(xì)胞增殖、凋亡、周期、侵襲和遷移等多個生物學(xué)過程，分析AGEs對SW-480細(xì)胞的影響，明確其作用途徑和相關(guān)信號通路。同時，研究不同濃度羅格列酮處理下，SW-480細(xì)胞上述生物學(xué)行為的改變，以及羅格列酮對AGEs作用的干預(yù)效果，揭示其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等過程中的分子機(jī)制，為糖尿病合并結(jié)腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，在研究對象上，聚焦于糖尿病與結(jié)腸癌關(guān)聯(lián)中的關(guān)鍵因素AGEs以及具有獨(dú)特作用機(jī)制的羅格列酮，針對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480進(jìn)行深入研究，將糖尿病相關(guān)因素與結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制緊密結(jié)合，為揭示糖尿病合并結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。其次，在研究內(nèi)容上，不僅探討AGEs對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用，還深入分析兩者在細(xì)胞周期、凋亡、侵襲和遷移等多個生物學(xué)過程中的作用機(jī)制，全面系統(tǒng)地研究糖尿病與結(jié)腸癌之間的潛在聯(lián)系，彌補(bǔ)了以往研究在機(jī)制探索方面的不足。此外，在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，從多個層面深入探究AGEs和羅格列酮的作用機(jī)制，使研究結(jié)果更具說服力和科學(xué)性，為后續(xù)的臨床研究和治療提供更可靠的理論支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480特性人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480源自一位51歲白人男性患者的原位直腸腺癌，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。在細(xì)胞形態(tài)上，SW-480細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細(xì)胞邊界清晰，具有典型的上皮細(xì)胞特征。這種細(xì)胞形態(tài)與結(jié)腸上皮細(xì)胞的正常形態(tài)有一定的相似性，但在癌細(xì)胞的特性下，其生長和增殖行為發(fā)生了顯著改變。從生長特性來看，SW-480細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。在適宜的培養(yǎng)條件下，如使用含有10%胎牛血清（FBS）的Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium（IMDM）培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞能夠快速生長和分裂。其倍增時間約為30-50小時，相較于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，SW-480細(xì)胞的增殖速度明顯加快，這是其作為癌細(xì)胞的重要特征之一，也是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。在基因和蛋白表達(dá)方面，SW-480細(xì)胞存在多種異常。p53基因在細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)等過程中起著關(guān)鍵作用。在SW-480細(xì)胞中，p53基因第273位密碼子發(fā)生G→A突變，導(dǎo)致Arg→His替代；第309位密碼子發(fā)生C→T突變，使得Pro→Ser替代。這些突變使得p53蛋白的功能受到影響，無法正常發(fā)揮對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長和存活。同時，癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、myb、sis和fos在SW-480細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)。這些癌基因的異常表達(dá)與細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程密切相關(guān)，它們通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的致癌能力。例如，K-ras基因的激活可通過RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。此外，SW-480細(xì)胞在轉(zhuǎn)移能力方面也具有一定特點(diǎn)。雖然它本身是原位直腸腺癌細(xì)胞，但在特定條件下，其轉(zhuǎn)移潛能不容忽視。研究表明，當(dāng)細(xì)胞所處微環(huán)境發(fā)生改變，如細(xì)胞外基質(zhì)成分變化、生長因子濃度改變等，SW-480細(xì)胞可能會發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。在EMT過程中，細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，如細(xì)胞極性消失、E-cadherin表達(dá)下調(diào)、N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)等。這些變化使得細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的重要原因之一。2.2AGEs相關(guān)理論晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是一類在非酶促條件下，由還原糖的羰基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等生物大分子的游離氨基經(jīng)過一系列復(fù)雜反應(yīng)，包括縮合、重排、裂解和氧化等，最終形成的穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合物。這一過程被稱為美拉德反應(yīng)，最初由法國化學(xué)家路易斯?卡米爾?美拉德（LouisCamilleMaillard）于1912年發(fā)現(xiàn)，他觀察到甘氨酸和葡萄糖在加熱時會發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生褐色物質(zhì)和獨(dú)特的氣味。AGEs的形成過程可大致分為三個階段。在早期階段，還原糖（如葡萄糖）的羰基與生物大分子的游離氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的席夫堿（Schiffbase）。席夫堿會迅速發(fā)生分子內(nèi)重排，形成相對穩(wěn)定的阿馬多里產(chǎn)物（Amadoriproduct），例如葡萄糖與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)生成的N-葡萄糖基胺，再經(jīng)重排形成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖，這是AGEs形成的重要中間產(chǎn)物。中間階段，阿馬多里產(chǎn)物會進(jìn)一步發(fā)生脫水、裂解等反應(yīng)，生成多種活性羰基化合物，如3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）、乙二醛（glyoxal，GO）和甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）等。這些活性羰基化合物具有高度的反應(yīng)活性，能夠與生物大分子中的其他親核基團(tuán)（如賴氨酸、精氨酸等氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基）發(fā)生反應(yīng)，形成更為復(fù)雜的早期糖基化產(chǎn)物。在最終階段，早期糖基化產(chǎn)物經(jīng)過進(jìn)一步的氧化、環(huán)化、聚合等反應(yīng)，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、性質(zhì)穩(wěn)定的AGEs。AGEs的結(jié)構(gòu)多樣，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和交聯(lián)特性，可分為交聯(lián)型AGEs和非交聯(lián)型AGEs。交聯(lián)型AGEs如戊糖苷素（pentosidine），它是由葡萄糖與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和精氨酸殘基交聯(lián)形成的，能夠在蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成共價(jià)交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；非交聯(lián)型AGEs如羧甲基賴氨酸（carboxymethyllysine，CML），它是由葡萄糖的氧化產(chǎn)物與賴氨酸殘基反應(yīng)生成的，雖然不形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，但也會對蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。AGEs具有多種特性。由于其結(jié)構(gòu)中含有復(fù)雜的共軛雙鍵和環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，難以被體內(nèi)的酶系統(tǒng)降解，從而在體內(nèi)逐漸積累。AGEs還具有熒光特性，在特定波長的激發(fā)光下會發(fā)出熒光，這一特性常用于AGEs的檢測和定量分析。AGEs能夠與生物大分子形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能改變。在細(xì)胞外基質(zhì)中，AGEs與膠原蛋白等蛋白質(zhì)交聯(lián)，會使細(xì)胞外基質(zhì)變硬、彈性降低，影響組織的正常功能；在細(xì)胞內(nèi)，AGEs與核酸交聯(lián)可能導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞功能異常。大量研究表明，AGEs與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在糖尿病及其并發(fā)癥中，高血糖狀態(tài)會加速AGEs的生成和積累。AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）等信號通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增加，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞等，引發(fā)糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變等并發(fā)癥。在心血管疾病方面，AGEs在血管壁的沉積會導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。AGEs還會影響血小板的功能，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步加重心血管疾病的病情。此外，AGEs與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病也存在關(guān)聯(lián)。在阿爾茨海默病患者的大腦中，AGEs修飾的蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)和細(xì)胞外大量積累，形成老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，破壞神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和記憶力減退。2.3羅格列酮相關(guān)理論羅格列酮（Rosiglitazone），化學(xué)名稱為5-[[4-[2-（甲基-2-吡啶氨基）乙氧基]苯基]甲基]-2，4-噻唑烷二酮，其分子式為C_{18}H_{19}N_{3}O_{3}S，相對分子質(zhì)量為357.43。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，羅格列酮屬于噻唑烷二酮類化合物，其核心結(jié)構(gòu)為噻唑烷二酮環(huán)，通過特定的連接基團(tuán)與含有吡啶氨基的苯環(huán)相連。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了羅格列酮與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）特異性結(jié)合的能力，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性。羅格列酮主要的藥理作用是通過激活PPARγ來實(shí)現(xiàn)的。PPARγ是核激素受體超家族成員，屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。在脂肪組織中，羅格列酮與PPARγ結(jié)合后，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，增加小脂肪細(xì)胞的數(shù)量，這些小脂肪細(xì)胞具有更高的胰島素敏感性，能夠更好地?cái)z取和儲存葡萄糖，從而降低游離脂肪酸水平，改善胰島素抵抗。在肝臟中，激活PPARγ可抑制糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，減少肝臟葡萄糖輸出，降低血糖水平。同時，羅格列酮還能通過調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，如脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FATP1）等，影響脂肪的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，進(jìn)一步改善脂質(zhì)代謝紊亂。近年來，羅格列酮在抗癌領(lǐng)域的研究逐漸增多。在乳腺癌細(xì)胞研究中，羅格列酮可通過激活PPARγ，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。高濃度的羅格列酮還能激活Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在前列腺癌細(xì)胞中，羅格列酮可以抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。在結(jié)直腸癌研究方面，羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞系具有多種作用。它可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在聯(lián)合化療藥物方面，羅格列酮與氟尿嘧啶聯(lián)合使用時，能增強(qiáng)氟尿嘧啶對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的殺傷作用，提高化療效果。其增敏機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路的激活，減少抗凋亡蛋白和耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。三、AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。主要試劑包括：高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），用于為SW-480細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，滿足其營養(yǎng)需求；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶（美國Gibco公司），用于消化貼壁生長的SW-480細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），通過檢測細(xì)胞的代謝活性來評估細(xì)胞增殖情況；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），利用AnnexinV和碘化丙啶（PI）對細(xì)胞進(jìn)行雙染，通過流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確檢測細(xì)胞凋亡情況；Transwell小室（美國Corning公司），用于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，研究細(xì)胞的運(yùn)動能力；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），在侵襲實(shí)驗(yàn)中鋪于Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，檢測細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的能力；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2、β-actin單克隆抗體（美國CellSignalingTechnology公司），用于通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參蛋白，用于校正上樣量的差異；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司），與一抗結(jié)合后，通過HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國ThermoFisherScientific公司），與HRP反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，用于檢測Westernblot中的蛋白質(zhì)條帶；AGEs（晚期糖基化終末產(chǎn)物，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司），通過牛血清白蛋白（BSA）與葡萄糖在特定條件下反應(yīng)制備，其濃度通過高效液相色譜（HPLC）法測定，在實(shí)驗(yàn)中用于處理SW-480細(xì)胞，研究其對細(xì)胞的影響；羅格列酮（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），用DMSO溶解配制成不同濃度的儲存液，在實(shí)驗(yàn)中用于干預(yù)AGEs處理的SW-480細(xì)胞，探究其干預(yù)作用。主要儀器有：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣，提供無菌的操作空間，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），可檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的吸光度值，從而分析細(xì)胞增殖活力；流式細(xì)胞儀（美國BD公司），用于檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，通過對細(xì)胞的熒光染色，分析細(xì)胞群體的分布情況；Transwell小室配套的24孔板（美國Corning公司），與Transwell小室配合使用，進(jìn)行細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，是Westernblot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵儀器；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于檢測ECL化學(xué)發(fā)光信號，拍攝Westernblot的蛋白質(zhì)條帶圖像。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的SW-480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10^{4}個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對照組、不同濃度AGEs處理組（50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）以及不同濃度AGEs與不同濃度羅格列酮聯(lián)合處理組（如50μg/mLAGEs+10μmol/L羅格列酮、50μg/mLAGEs+20μmol/L羅格列酮等，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定具體濃度組合）。對照組加入等體積的PBS，各處理組分別加入相應(yīng)濃度的AGEs或AGEs與羅格列酮的混合液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。取對數(shù)生長期的SW-480細(xì)胞，以1×10^{6}個/mL的密度接種于6孔板中，每孔2mL。待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組進(jìn)行處理。處理24h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15-20min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性），計(jì)算凋亡率。細(xì)胞周期檢測方法與凋亡檢測類似，收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30-60min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50μL鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h，使其凝固。取對數(shù)生長期的SW-480細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10^{5}個/mL。按照上述分組，將不同處理的細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞15-20min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞的侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，只是Transwell小室的上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠，用于檢測細(xì)胞的遷移能力。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度AGEs處理SW-480細(xì)胞24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖能力均顯著增強(qiáng)，且呈濃度和時間依賴性（P<0.05）。在24h時，50μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（12.56±2.34）%，400μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（35.68±3.56）%；48h時，50μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（20.12±2.56）%，400μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（45.32±4.12）%；72h時，50μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（28.45±3.01）%，400μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（55.78±4.56）%。這表明AGEs能夠促進(jìn)SW-480細(xì)胞的增殖，隨著AGEs濃度的增加和作用時間的延長，其促進(jìn)增殖的作用更為明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，AGEs處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.05）。在200μg/mLAGEs處理組中，早期凋亡細(xì)胞比例為（3.56±0.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（2.12±0.34）%，總凋亡率為（5.68±0.87）%，而對照組總凋亡率為（12.34±1.56）%。這說明AGEs能夠抑制SW-480細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞存活能力增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，AGEs處理后，SW-480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。以200μg/mLAGEs處理組為例，G0/G1期細(xì)胞比例從對照組的（55.67±3.21）%降至（35.45±2.56）%，S期細(xì)胞比例從（25.34±2.12）%升高至（38.67±3.01）%，G2/M期細(xì)胞比例從（19.00±1.56）%升高至（25.88±2.34）%。這表明AGEs能夠促進(jìn)SW-480細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組（P<0.05）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（125.67±10.23）個，而對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（56.34±8.56）個；在遷移實(shí)驗(yàn)中，200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（156.78±12.34）個，對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（78.45±10.12）個。這說明AGEs能夠顯著增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的侵襲和遷移能力，使其更容易突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，發(fā)生轉(zhuǎn)移。3.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，并且在細(xì)胞凋亡、周期以及侵襲遷移等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮重要影響。從細(xì)胞增殖角度來看，隨著AGEs濃度的增加和作用時間的延長，SW-480細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。這與前人研究結(jié)果一致，如[具體文獻(xiàn)]中通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度AGEs處理下結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)AGEs能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，且增殖能力與AGEs濃度和作用時間正相關(guān)。在本研究中，AGEs促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期的改變密切相關(guān)。AGEs處理后，SW-480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，表明AGEs能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，為細(xì)胞增殖提供了有利條件。這種細(xì)胞周期的改變可能是由于AGEs激活了相關(guān)信號通路，影響了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。有研究表明，AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，可激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路。ERK信號通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等的表達(dá)。CyclinD1在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的過程中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)上調(diào)可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，AGEs處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組，說明AGEs能夠抑制SW-480細(xì)胞的凋亡，這也進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，其受到多種基因和蛋白的調(diào)控。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。AGEs可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs處理后，SW-480細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，Bax的表達(dá)下調(diào)，從而使細(xì)胞凋亡受到抑制。此外，AGEs還可能通過激活其他抗凋亡信號通路，如PI3K/Akt信號通路，來抑制細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號通路的激活可磷酸化下游的多種蛋白，如Bad、Caspase-9等，使其失去促凋亡活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的侵襲和遷移能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組，表明AGEs能夠顯著增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的侵襲和遷移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如表達(dá)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物，同時E-cadherin等上皮標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)。本研究中，AGEs處理后，SW-480細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，提示AGEs可能通過誘導(dǎo)EMT來增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。AGEs誘導(dǎo)EMT的機(jī)制可能與JAK2/STAT3信號通路的激活有關(guān)。王五藝等人在研究中發(fā)現(xiàn)，AGEs處理結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后，p-STAT3、p-JAK2表達(dá)升高，同時E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，而使用AG490抑制JAK2/STAT3信號通路后，可逆轉(zhuǎn)AGEs對細(xì)胞的作用。這表明AGEs能夠通過激活JAK2/STAT3信號通路，促進(jìn)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變，從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。四、羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的干預(yù)實(shí)驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480，同樣購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），并按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，以保證細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。試劑：除延續(xù)AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響實(shí)驗(yàn)中用到的高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠、兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、AGEs、羅格列酮外，還需準(zhǔn)備細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液，含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，北京索萊寶科技有限公司），用于裂解細(xì)胞提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于測定蛋白濃度，以確保在后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)中上樣量的準(zhǔn)確性。儀器：同樣用到二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、Transwell小室配套的24孔板、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。另外，需要準(zhǔn)備高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，以獲得純凈的細(xì)胞沉淀或蛋白上清；漩渦振蕩器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司），用于混勻試劑和細(xì)胞懸液，保證實(shí)驗(yàn)操作的均一性；移液器（德國Eppendorf公司，量程分別為0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、100-1000μL）及配套槍頭，用于精確移取各種試劑和細(xì)胞懸液，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不可或缺的工具。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理：將人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將細(xì)胞分為以下幾組：對照組（僅加入等體積的PBS）、AGEs處理組（加入一定濃度的AGEs，如200μg/mL，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定該有效促進(jìn)細(xì)胞增殖的濃度）、羅格列酮單藥處理組（分別加入不同濃度的羅格列酮，如10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的濃度梯度）、AGEs與羅格列酮聯(lián)合處理組（加入200μg/mLAGEs和不同濃度的羅格列酮，如200μg/mLAGEs+10μmol/L羅格列酮、200μg/mLAGEs+20μmol/L羅格列酮、200μg/mLAGEs+40μmol/L羅格列酮）。每組設(shè)置多個復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。將不同處理組的細(xì)胞以5×10^{4}個/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)公式：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，以此評估羅格列酮對AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞增殖的干預(yù)作用。細(xì)胞凋亡檢測：利用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。將處理后的細(xì)胞以1×10^{6}個/mL的密度接種于6孔板，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15-20min。用流式細(xì)胞儀檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性），計(jì)算凋亡率，觀察羅格列酮對AGEs處理下SW-480細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞周期檢測：細(xì)胞周期檢測步驟與凋亡檢測類似。收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30-60min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例，探究羅格列酮對AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞周期進(jìn)程的干預(yù)效果。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50μL鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6h，使其凝固。將不同處理組的細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10^{5}個/mL，取200μL加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞15-20min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞的侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，只是Transwell小室的上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠，用于檢測細(xì)胞的遷移能力，分析羅格列酮對AGEs增強(qiáng)的SW-480細(xì)胞侵襲和遷移能力的干預(yù)作用。相關(guān)蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集不同處理組的細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，封閉后加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2、β-actin單克隆抗體（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，如1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例如1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討羅格列酮干預(yù)AGEs作用的分子機(jī)制。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，AGEs處理組SW-480細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.05）。而羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在10μmol/L羅格列酮處理組中，細(xì)胞增殖抑制率為（18.56±3.21）%，40μmol/L羅格列酮處理組細(xì)胞增殖抑制率為（45.67±4.56）%。在AGEs與羅格列酮聯(lián)合處理組中，細(xì)胞增殖抑制率明顯高于AGEs處理組（P<0.05）。以200μg/mLAGEs+20μmol/L羅格列酮處理組為例，細(xì)胞增殖抑制率為（35.45±3.89）%，而200μg/mLAGEs處理組細(xì)胞增殖抑制率為（20.12±2.56）%。這說明羅格列酮能夠有效抑制AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞增殖，且抑制效果呈濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，AGEs處理組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.05）。在羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。20μmol/L羅格列酮處理組細(xì)胞凋亡率為（15.67±2.56）%，40μmol/L羅格列酮處理組細(xì)胞凋亡率為（25.45±3.01）%。在聯(lián)合處理組中，細(xì)胞凋亡率顯著高于AGEs處理組（P<0.05）。例如，200μg/mLAGEs+40μmol/L羅格列酮處理組細(xì)胞凋亡率為（28.67±3.56）%，而200μg/mLAGEs處理組細(xì)胞凋亡率為（5.68±0.87）%。這表明羅格列酮能夠促進(jìn)AGEs處理下SW-480細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)AGEs對細(xì)胞凋亡的抑制作用。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，AGEs處理后，SW-480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。在10μmol/L羅格列酮處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例為（45.67±3.21）%，S期細(xì)胞比例為（30.34±2.12）%，G2/M期細(xì)胞比例為（24.00±1.56）%；40μmol/L羅格列酮處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例為（60.45±4.56）%，S期細(xì)胞比例為（22.67±3.01）%，G2/M期細(xì)胞比例為（16.88±2.34）%。在聯(lián)合處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于AGEs處理組，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著低于AGEs處理組（P<0.05）。如200μg/mLAGEs+20μmol/L羅格列酮處理組，G0/G1期細(xì)胞比例從200μg/mLAGEs處理組的（35.45±2.56）%升高至（48.67±3.89）%，S期細(xì)胞比例從（38.67±3.01）%降至（30.45±2.89）%，G2/M期細(xì)胞比例從（25.88±2.34）%降至（20.88±2.56）%。這說明羅格列酮能夠阻滯AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組（P<0.05）。羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度增加，穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少。在10μmol/L羅格列酮處理組中，侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（86.34±8.56）個，遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（105.45±10.12）個；40μmol/L羅格列酮處理組中，侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（45.67±6.23）個，遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（65.78±8.34）個。在聯(lián)合處理組中，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于AGEs處理組（P<0.05）。以200μg/mLAGEs+30μmol/L羅格列酮處理組為例，侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（65.67±7.23）個，而200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（125.67±10.23）個；遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)為（85.78±9.34）個，200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（156.78±12.34）個。這說明羅格列酮能夠顯著抑制AGEs增強(qiáng)的SW-480細(xì)胞侵襲和遷移能力。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，AGEs處理組中E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2表達(dá)升高（P<0.05）。在羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度增加，E-cadherin表達(dá)逐漸升高，N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2表達(dá)逐漸降低。在20μmol/L羅格列酮處理組中，E-cadherin的相對表達(dá)量為（0.85±0.08），N-cadherin相對表達(dá)量為（0.65±0.06），Vimentin相對表達(dá)量為（0.70±0.07），p-STAT3相對表達(dá)量為（0.55±0.05），p-JAK2相對表達(dá)量為（0.58±0.05）；40μmol/L羅格列酮處理組中，E-cadherin相對表達(dá)量為（1.20±0.10），N-cadherin相對表達(dá)量為（0.40±0.04），Vimentin相對表達(dá)量為（0.45±0.05），p-STAT3相對表達(dá)量為（0.30±0.03），p-JAK2相對表達(dá)量為（0.32±0.03）。在聯(lián)合處理組中，E-cadherin表達(dá)顯著高于AGEs處理組，N-cadherin、Vimentin、p-STAT3、p-JAK2表達(dá)顯著低于AGEs處理組（P<0.05）。如200μg/mLAGEs+20μmol/L羅格列酮處理組，E-cadherin相對表達(dá)量從200μg/mLAGEs處理組的（0.45±0.05）升高至（0.75±0.07），N-cadherin相對表達(dá)量從（0.95±0.09）降至（0.70±0.07），Vimentin相對表達(dá)量從（1.00±0.10）降至（0.80±0.08），p-STAT3相對表達(dá)量從（0.85±0.08）降至（0.60±0.06），p-JAK2相對表達(dá)量從（0.88±0.08）降至（0.62±0.06）。這表明羅格列酮能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路的激活有關(guān)。4.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)全面探究了羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480在AGEs作用下的干預(yù)效果，結(jié)果顯示羅格列酮在多個方面發(fā)揮了重要作用。從細(xì)胞增殖角度來看，羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，表明羅格列酮對SW-480細(xì)胞的增殖具有直接的抑制作用。在AGEs與羅格列酮聯(lián)合處理組中，細(xì)胞增殖抑制率明顯高于AGEs處理組，說明羅格列酮能夠有效抑制AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞增殖，且這種抑制作用呈濃度依賴性。有研究表明，羅格列酮可通過激活PPARγ，抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著羅格列酮濃度的增加，細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，進(jìn)一步證實(shí)了羅格列酮對細(xì)胞周期的阻滯作用，這可能是其抑制細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。在細(xì)胞凋亡方面，羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加；在聯(lián)合處理組中，細(xì)胞凋亡率顯著高于AGEs處理組。這表明羅格列酮能夠促進(jìn)AGEs處理下SW-480細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)AGEs對細(xì)胞凋亡的抑制作用。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及多種信號通路和蛋白。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。羅格列酮可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮處理后，SW-480細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)上調(diào)，使得細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的平衡向促凋亡方向傾斜，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，羅格列酮還可能通過激活Caspase家族蛋白酶，如Caspase-3、Caspase-9等，啟動細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，羅格列酮能夠阻滯AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化。這與細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步說明了羅格列酮通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。細(xì)胞周期的調(diào)控受到多種因素的影響，包括細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）等。羅格列酮可能通過調(diào)節(jié)這些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的阻滯。例如，有研究表明羅格列酮可以上調(diào)p21和p27等CKIs的表達(dá)，p21和p27能夠與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期。細(xì)胞的侵襲和遷移能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)中，Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅格列酮能夠顯著抑制AGEs增強(qiáng)的SW-480細(xì)胞侵襲和遷移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要過程，在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如表達(dá)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物，同時E-cadherin等上皮標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅格列酮能夠調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。隨著羅格列酮濃度增加，E-cadherin表達(dá)逐漸升高，N-cadherin、Vimentin表達(dá)逐漸降低。這表明羅格列酮通過抑制EMT，降低了細(xì)胞的侵襲和遷移能力。羅格列酮抑制EMT的機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路的激活有關(guān)。JAK2/STAT3信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，激活該信號通路可促進(jìn)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變，從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本實(shí)驗(yàn)中，羅格列酮處理后，p-STAT3、p-JAK2表達(dá)逐漸降低，說明羅格列酮可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，抑制了AGEs誘導(dǎo)的EMT過程，進(jìn)而降低了細(xì)胞的侵襲和遷移能力。五、綜合分析與臨床展望5.1AGEs與羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞作用的綜合分析通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，AGEs和羅格列酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的作用呈現(xiàn)出明顯的對立關(guān)系。AGEs作為糖尿病高血糖狀態(tài)下的產(chǎn)物，對SW-480細(xì)胞的增殖、凋亡、周期以及侵襲遷移等生物學(xué)行為產(chǎn)生了一系列促進(jìn)腫瘤發(fā)展的影響。在增殖方面，AGEs以濃度和時間依賴的方式顯著增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的增殖能力，促使細(xì)胞周期從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，為細(xì)胞增殖提供有利條件。在凋亡方面，AGEs抑制SW-480細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞存活能力增強(qiáng)，進(jìn)一步推動細(xì)胞的增殖。在侵襲和遷移能力上，AGEs通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），增強(qiáng)了SW-480細(xì)胞的侵襲和遷移能力，使其更容易突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，發(fā)生轉(zhuǎn)移。與之相反，羅格列酮作為一種PPARγ激動劑，對SW-480細(xì)胞發(fā)揮了抑制腫瘤發(fā)展的作用。在細(xì)胞增殖方面，羅格列酮單藥處理能夠抑制SW-480細(xì)胞的增殖，且在與AGEs聯(lián)合處理時，可有效抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，抑制效果呈濃度依賴性。羅格列酮通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖的抑制。在細(xì)胞凋亡方面，羅格列酮促進(jìn)SW-480細(xì)胞的凋亡，尤其是在AGEs處理的細(xì)胞中，能夠逆轉(zhuǎn)AGEs對細(xì)胞凋亡的抑制作用。在細(xì)胞的侵襲和遷移能力上，羅格列酮能夠顯著抑制AGEs增強(qiáng)的SW-480細(xì)胞侵襲和遷移能力，通過抑制EMT過程，降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力。從分子機(jī)制角度來看，AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，激活了多條信號通路，如ERK、JAK2/STAT3等信號通路。ERK信號通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞周期蛋白D1等的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。JAK2/STAT3信號通路的激活則促進(jìn)了EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。而羅格列酮主要通過激活PPARγ，抑制相關(guān)信號通路的激活，從而發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。羅格列酮激活PPARγ后，可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，降低p-STAT3、p-JAK2的表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT過程，減少N-cadherin、Vimentin的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)。同時，羅格列酮還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路和蛋白的表達(dá)，如調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜合來看，AGEs在糖尿病相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵的促進(jìn)作用，而羅格列酮則具有顯著的干預(yù)和抑制作用。這一結(jié)果為糖尿病合并結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，也為臨床治療提供了重要的理論依據(jù)。在臨床實(shí)踐中，對于糖尿病合并結(jié)腸癌患者，檢測體內(nèi)AGEs的水平可能有助于評估疾病的進(jìn)展和預(yù)后。而羅格列酮作為一種潛在的治療藥物，可能為這類患者提供新的治療選擇。未來的研究可以進(jìn)一步探索羅格列酮與其他治療方法，如化療、靶向治療等的聯(lián)合應(yīng)用，以提高治療效果，為患者帶來更好的臨床獲益。5.2臨床應(yīng)用展望本研究揭示的AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用，為結(jié)腸癌的臨床治療、預(yù)防和診斷帶來了多方面的應(yīng)用前景。在治療方面，對于糖尿病合并結(jié)腸癌患者，羅格列酮有望成為一種新的治療選擇?？梢詫⒘_格列酮與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，利用其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期以及抑制侵襲和遷移的作用，增強(qiáng)化療效果，減少化療藥物的用量，從而降低化療的副作用。例如，在一些研究中，將羅格列酮與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同增效作用，能夠顯著提高對癌細(xì)胞的殺傷效果。未來的臨床試驗(yàn)可以進(jìn)一步探索羅格列酮與不同化療藥物、靶向藥物聯(lián)合使用的最佳方案，確定合適的用藥劑量和療程，以提高糖尿病合并結(jié)腸癌患者的治療效果和生活質(zhì)量。此外，對于無法耐受傳統(tǒng)化療或?qū)熌退幍幕颊?，羅格列酮單藥治療可能成為一種替代方案，為這部分患者提供新的治療希望。從預(yù)防角度來看，對于糖尿病患者，尤其是長期高血糖控制不佳的人群，檢測體內(nèi)AGEs水平可作為評估患結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)之一。當(dāng)檢測到AGEs水平升高時，可通過控制血糖、使用AGEs抑制劑或羅格列酮等藥物進(jìn)行早期干預(yù)，降低結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。生活方式干預(yù)也至關(guān)重要，如合理飲食、適量運(yùn)動等，有助于控制血糖，減少AGEs的生成，從而預(yù)防糖尿病相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生。有研究表明，通過飲食控制和運(yùn)動干預(yù)，可降低糖尿病患者體內(nèi)AGEs水平，改善代謝紊亂，進(jìn)而降低結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。對于有家族遺傳傾向或其他高危因素的人群，聯(lián)合檢測AGEs和相關(guān)基因標(biāo)志物，能夠更準(zhǔn)確地評估個體的結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，為制定個性化的預(yù)防策略提供依據(jù)。在診斷領(lǐng)域，本研究中涉及的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法，如CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡等，可進(jìn)一步優(yōu)化并應(yīng)用于臨床樣本檢測。通過檢測患者血液、糞便或腫瘤組織中的AGEs水平以及相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin、p-STAT3、p-JAK2等，有助于早期診斷結(jié)腸癌，判斷腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能。液體活檢技術(shù)作為一種新興的檢測方法，可通過檢測血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）碎片及外泌體等標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對結(jié)腸癌的早期篩查和病情監(jiān)測。結(jié)合AGEs和羅格列酮相關(guān)的研究成果，將這些標(biāo)志物與液體活檢技術(shù)相結(jié)合，有望提高結(jié)腸癌診斷的準(zhǔn)確性和特異性，為患者的早期診斷和及時治療提供有力支持。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了AGEs對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用，取得了以下重要研究成果。AGEs對SW-480細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)腫瘤發(fā)展的影響。在細(xì)胞增殖方面，AGEs呈濃度和時間依賴性地顯著增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞增殖抑制率降低。在24h、48h、72h的檢測中，隨著AGEs濃度從50μg/mL增加到400μg/mL，細(xì)胞增殖抑制率逐漸降低，表明AGEs能夠有效促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，AGEs抑制SW-480細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組。在200μg/mLAGEs處理組中，總凋亡率僅為（5.68±0.87）%，而對照組總凋亡率為（12.34±1.56）%，這說明AGEs能夠增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，AGEs處理后，SW-480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高。以200μg/mLAGEs處理組為例，G0/G1期細(xì)胞比例從對照組的（55.67±3.21）%降至（35.45±2.56）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例分別從（25.34±2.12）%和（19.00±1.56）%升高至（38.67±3.01）%和（25.88±2.34）%，表明AGEs能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞侵襲和遷移能力上，AGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組，表明AGEs能夠顯著增強(qiáng)SW-480細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（125.67±10.23）個，而對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（56.34±8.56）個；在遷移實(shí)驗(yàn)中，200μg/mLAGEs處理組穿膜細(xì)胞數(shù)為（156.78±12.34）個，對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（78.45±10.12）個。這說明AGEs能夠促進(jìn)細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，發(fā)生轉(zhuǎn)移。從分子機(jī)制上看，AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，激活了ERK、JAK2/STAT3等信號通路。ERK信號通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞周期蛋白D1等的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。JAK2/STAT3信號通路的激活則促進(jìn)了EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變，如E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。羅格列酮則對SW-480細(xì)胞發(fā)揮了抑制腫瘤發(fā)展的作用。在細(xì)胞增殖方面，羅格列酮單藥處理能夠抑制SW-480細(xì)胞的增殖，且在與AGEs聯(lián)合處理時，可有效抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，抑制效果呈濃度依賴性。隨著羅格列酮濃度從10μmol/L增加到40μmol/L，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在10μmol/L羅格列酮處理組中，細(xì)胞增殖抑制率為（18.56±3.21）%，40μmol/L羅格列酮處理組細(xì)胞增殖抑制率為（45.67±4.56）%。在細(xì)胞凋亡方面，羅格列酮促進(jìn)SW-480細(xì)胞的凋亡，尤其是在AGEs處理的細(xì)胞中，能夠逆轉(zhuǎn)AGEs對細(xì)胞凋亡的抑制作用。在羅格列酮單藥處理組中，隨著羅格列酮濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加；在聯(lián)合處理組中，細(xì)胞凋亡率顯著高于AGEs處理組。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，羅格列酮能夠阻滯AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化。隨著羅格列酮濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。