RNA干擾Bcl2基因增強(qiáng)131碘治療甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞療效的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的《全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》顯示，2020年中國(guó)甲狀腺癌發(fā)病例數(shù)為22.1萬，已成為全國(guó)發(fā)病率第七名的癌種。甲狀腺癌主要包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌等類型，其中分化型甲狀腺癌（乳頭狀癌和濾泡狀癌）占比超過90%，雖然其總體預(yù)后相對(duì)較好，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。手術(shù)切除是甲狀腺癌的主要治療手段之一，但對(duì)于一些無法完全切除、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的患者，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到理想的治療效果。碘-131治療作為一種重要的輔助治療方法，在甲狀腺癌的綜合治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。碘-131是一種放射性核素，甲狀腺癌細(xì)胞具有攝取碘的功能，當(dāng)患者攝入碘-131后，甲狀腺癌細(xì)胞會(huì)濃聚碘-131，碘-131通過β衰變釋放出β射線，其在組織中的射程較短（平均射程1-2mm），能夠集中對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞進(jìn)行照射，破壞癌細(xì)胞的DNA或RNA，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療目的。同時(shí)，碘-131治療具有高度的特異性，僅針對(duì)甲狀腺細(xì)胞，對(duì)周圍組織損傷較小，且其半衰期較短，可減少治療過程中的輻射暴露。然而，碘-131治療也存在一定的局限性。部分甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)碘-131的攝取能力較低，導(dǎo)致治療效果不佳；此外，長(zhǎng)期使用碘-131治療可能會(huì)引起一些副作用，如短期內(nèi)的喉嚨痛、發(fā)熱、乏力等，長(zhǎng)期來看，極少數(shù)患者可能出現(xiàn)甲狀腺功能減退的情況，需要定期監(jiān)測(cè)甲狀腺激素水平并進(jìn)行相應(yīng)的替代治療，還有可能存在其他潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何提高甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)碘-131的攝取能力，增強(qiáng)碘-131治療的療效，成為甲狀腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的問題。RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種新興的基因沉默技術(shù)，為解決上述問題提供了新的思路。RNAi是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的小干擾RNA（siRNA），可以特異性地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。Bcl-2基因是一種細(xì)胞凋亡抑制基因，其編碼的Bcl-2蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期。研究表明，Bcl-2基因在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)，且與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。抑制Bcl-2基因的表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡，提高其對(duì)碘-131治療的敏感性。因此，本研究擬通過RNAi技術(shù)沉默甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中的Bcl-2基因，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及碘-131攝取能力的影響，為增強(qiáng)甲狀腺癌碘-131治療的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究iRNA-Bcl2對(duì)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞131碘療效的增強(qiáng)作用及潛在機(jī)制，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察iRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染后FTC-133細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，包括細(xì)胞增殖、凋亡以及131碘攝取能力的改變，為提高甲狀腺癌131碘治療的臨床療效提供新的策略和理論依據(jù)。從理論層面來看，本研究有助于深化對(duì)甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制和131碘治療耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)。目前關(guān)于Bcl-2基因在甲狀腺癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是其與131碘治療效果之間的關(guān)聯(lián)研究仍有待完善。通過本研究，有望揭示Bcl-2基因表達(dá)調(diào)控與甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)131碘敏感性之間的內(nèi)在聯(lián)系，豐富甲狀腺癌分子生物學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。在臨床實(shí)踐方面，本研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。若能證實(shí)iRNA-Bcl2可有效增強(qiáng)甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞對(duì)131碘的治療反應(yīng)，這將為甲狀腺癌的治療提供新的思路和方法。臨床上可考慮將RNAi技術(shù)與131碘治療相結(jié)合，開發(fā)新的聯(lián)合治療方案，以提高131碘治療的療效，改善患者的預(yù)后，降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，提高患者的生存質(zhì)量，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)醫(yī)療資源的消耗。此外，本研究的開展還可能對(duì)甲狀腺癌的診斷和預(yù)后評(píng)估產(chǎn)生積極影響。如果Bcl-2基因被確定為影響131碘治療效果的關(guān)鍵因素，那么它可能成為甲狀腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的新生物標(biāo)志物，有助于臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的病情和預(yù)后，制定個(gè)性化的治療方案。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1甲狀腺癌概述甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括遺傳因素、環(huán)境因素以及自身免疫等。不同類型的甲狀腺癌在細(xì)胞起源、生物學(xué)行為和臨床特征上存在顯著差異。甲狀腺癌主要分為四種類型，即甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌。甲狀腺乳頭狀癌最為常見，約占全部甲狀腺癌的85%-90%，多見于30-45歲女性，此型分化好，惡性程度低，雖常有多中心病灶，約1/3累及雙側(cè)甲狀腺，但腫瘤多為單發(fā)，原發(fā)灶可以很小，且較早便出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但預(yù)后相對(duì)較好。甲狀腺濾泡癌約占20%，多見于50歲左右成年人，腫瘤生長(zhǎng)較快，屬中度惡性，且有侵犯血管傾向，可經(jīng)血運(yùn)轉(zhuǎn)移到肺、肝和骨及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移僅占10%，患者預(yù)后稍遜于乳頭狀癌。甲狀腺未分化癌約占15%，多見于70歲左右老年人，發(fā)展迅速，高度惡性，約50%初期便有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或侵犯氣管、喉返神經(jīng)或食管，常經(jīng)血運(yùn)向肺、骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展快速，預(yù)后極差，平均生存3-6個(gè)月，一年生存率僅5%-15%。甲狀腺髓樣癌僅占7%，來源于濾泡旁降鈣素分泌細(xì)胞（C細(xì)胞），細(xì)胞排列呈巢狀或囊狀，無乳頭或?yàn)V泡結(jié)構(gòu)，呈未分化狀，間質(zhì)內(nèi)有淀粉樣物沉積，惡性程度中等，可有頸淋巴結(jié)侵犯和血液循環(huán)轉(zhuǎn)移，預(yù)后介于乳頭狀癌和未分化癌之間。本研究中所使用的FTC-133細(xì)胞是一種人甲狀腺癌細(xì)胞株，源自一名42歲患有濾泡狀甲狀腺癌的男性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。該細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。FTC-133細(xì)胞表達(dá)甲狀腺球蛋白、EGFR，且P53突變，這些特性使得它成為研究甲狀腺癌，特別是濾泡狀甲狀腺癌的重要細(xì)胞模型，有助于深入探討甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為以及治療靶點(diǎn)。碘-131治療是甲狀腺癌綜合治療的重要組成部分，尤其對(duì)于分化型甲狀腺癌具有重要意義。其治療原理基于甲狀腺組織和甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)碘的高度攝取能力。正常甲狀腺組織和分化型甲狀腺癌細(xì)胞表面均表達(dá)鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS），NIS能夠主動(dòng)攝取碘，將碘轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)患者攝入碘-131后，碘-131被甲狀腺癌細(xì)胞攝取并濃聚在細(xì)胞內(nèi)。碘-131是一種放射性核素，它會(huì)發(fā)生β衰變，在衰變過程中釋放出β射線，β射線在組織中的平均射程為1-2mm，能夠在短距離內(nèi)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)照射。β射線的能量可以破壞癌細(xì)胞的DNA或RNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致癌細(xì)胞的遺傳物質(zhì)受損，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到治療甲狀腺癌的目的。同時(shí)，碘-131衰變過程中還會(huì)釋放少量γ射線，γ射線具有較強(qiáng)的穿透能力，可用于體外顯像，幫助醫(yī)生了解碘-131在體內(nèi)的分布情況以及腫瘤的位置和大小，為治療方案的制定和療效評(píng)估提供重要依據(jù)。目前，碘-131治療在甲狀腺癌臨床治療中應(yīng)用廣泛。對(duì)于甲狀腺癌術(shù)后殘留甲狀腺組織或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的患者，碘-131治療能夠有效清除殘留的癌細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。在一些情況下，碘-131治療也可作為無法手術(shù)切除的甲狀腺癌患者的主要治療手段之一。然而，碘-131治療并非對(duì)所有甲狀腺癌患者都能取得理想效果。部分甲狀腺癌細(xì)胞在疾病發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)攝碘能力下降的情況，導(dǎo)致碘-131難以有效濃聚在癌細(xì)胞內(nèi)，從而影響治療效果。這種攝碘能力下降的機(jī)制較為復(fù)雜，可能與癌細(xì)胞的去分化、NIS表達(dá)下調(diào)或功能異常等因素有關(guān)。此外，長(zhǎng)期或大劑量使用碘-131治療可能會(huì)引發(fā)一些不良反應(yīng)，如短期內(nèi)可能出現(xiàn)頸部腫脹、疼痛、惡心、嘔吐、乏力等癥狀，長(zhǎng)期來看，可能導(dǎo)致甲狀腺功能減退，需要患者長(zhǎng)期服用甲狀腺激素進(jìn)行替代治療，部分患者還可能存在潛在的放射性損傷風(fēng)險(xiǎn)，如增加第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生幾率等。因此，如何提高碘-131治療的療效，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，成為甲狀腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。2.2Bcl2蛋白與細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白是Bcl-2蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2基因位于染色體18q21.33，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，其編碼的Bcl-2蛋白由239個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為26kDa。Bcl-2蛋白包含三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，即BH4結(jié)構(gòu)域、BCL結(jié)構(gòu)域和TM跨膜區(qū)域。其中，BH4結(jié)構(gòu)域是抗凋亡蛋白特有的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于維持Bcl-2蛋白的抗凋亡功能至關(guān)重要；BCL結(jié)構(gòu)域又包含BH1、BH2和BH3三個(gè)子域，BH3子域能夠與促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，從而抑制促凋亡蛋白的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等膜結(jié)構(gòu)上，這種定位與其功能密切相關(guān)。Bcl-2蛋白具有顯著的抑制細(xì)胞凋亡的功能。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外源性刺激，如氧化應(yīng)激、DNA損傷、生長(zhǎng)因子缺乏等，細(xì)胞內(nèi)會(huì)啟動(dòng)一系列凋亡信號(hào)通路。在這些通路中，線粒體起著核心作用。正常情況下，線粒體外膜保持完整，細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子被封閉在線粒體內(nèi)。然而，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活半胱天冬酶-9（caspase-9），激活的caspase-9再激活下游的caspase家族成員，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2蛋白主要通過以下多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。首先，Bcl-2蛋白能夠阻止線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)變（MOMP），維持線粒體外膜的完整性，從而抑制細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子的釋放。Bcl-2蛋白可以與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，抑制它們的寡聚化，從而阻止線粒體膜上形成凋亡相關(guān)的孔道，防止細(xì)胞色素C的釋放。其次，Bcl-2蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成，發(fā)揮抗氧化作用，間接抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白能夠增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）等抗氧化劑的含量，提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，從而抑制細(xì)胞凋亡。此外，Bcl-2蛋白還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子過度釋放到線粒體，避免因線粒體鈣離子超載而引發(fā)的細(xì)胞凋亡。在甲狀腺癌中，Bcl-2蛋白的表達(dá)異常與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。大量研究表明，Bcl-2蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常甲狀腺組織。Bcl-2蛋白的高表達(dá)可能通過抑制甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活，從而推動(dòng)甲狀腺癌的發(fā)展。同時(shí)，Bcl-2蛋白的高表達(dá)還可能與甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)。高表達(dá)Bcl-2蛋白的甲狀腺癌細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且對(duì)化療藥物和放療的敏感性降低，導(dǎo)致治療效果不佳，患者預(yù)后不良。因此，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)或活性，有可能成為治療甲狀腺癌的新策略，通過促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性，改善患者的預(yù)后。2.3RNA干擾技術(shù)RNA干擾（RNAi）技術(shù)是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的、由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、能夠特異性地降解與之同源的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)進(jìn)行有效調(diào)控的重要機(jī)制。這一技術(shù)的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了基因功能研究和基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。1998年，安德魯?法爾（AndrewFire）和克雷格?梅洛（CraigMello）在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象，他們將體外合成的dsRNA導(dǎo)入線蟲體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠特異性地抑制同源基因的表達(dá)，這一開創(chuàng)性的研究成果揭示了RNAi作為一種高效的基因沉默機(jī)制的存在，并因此獲得了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。此后，RNAi技術(shù)迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在基因功能研究、藥物研發(fā)、疾病治療等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。RNAi技術(shù)的核心原理基于細(xì)胞內(nèi)的一系列復(fù)雜分子機(jī)制。當(dāng)外源或內(nèi)源的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，首先會(huì)被一種具有RNaseⅢ樣活性的核酸酶Dicer識(shí)別并切割。Dicer酶能夠?qū)㈤L(zhǎng)鏈的dsRNA精準(zhǔn)地加工裂解成21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，它們由正義鏈和反義鏈組成，兩條單鏈的5′端為磷酸基團(tuán)，3′端為羥基，并且每條單鏈的3′端均帶有2-3個(gè)突出的非配對(duì)堿基。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得siRNA能夠被細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識(shí)別并結(jié)合。在RISC中，siRNA的反義鏈會(huì)與目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列發(fā)生特異性堿基配對(duì)，然后在RISC中核酸酶的作用下，目標(biāo)mRNA被精確切割降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的有效抑制。RNAi技術(shù)具有多個(gè)顯著特點(diǎn)，使其在生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，RNAi技術(shù)具有高度的特異性。由于siRNA是根據(jù)目標(biāo)基因的特定序列設(shè)計(jì)合成的，能夠精確地識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的mRNA序列，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的靶向沉默，而對(duì)其他非目標(biāo)基因的表達(dá)幾乎沒有影響。這種高度特異性為研究特定基因的功能以及開發(fā)精準(zhǔn)的基因治療方法提供了有力工具。其次，RNAi技術(shù)具有高效性。少量的dsRNA或siRNA即可引發(fā)強(qiáng)大的基因沉默效應(yīng)，通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)放大機(jī)制，能夠迅速有效地降低目標(biāo)基因的表達(dá)水平。再者，RNAi技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)便。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)不需要進(jìn)行復(fù)雜的基因編輯和細(xì)胞篩選過程，只需將設(shè)計(jì)好的dsRNA或siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)基因沉默，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了研究效率。此外，RNAi技術(shù)還具有廣泛的適用性。幾乎所有的真核生物細(xì)胞都存在RNAi機(jī)制，使得RNAi技術(shù)可以應(yīng)用于多種生物體系和細(xì)胞類型的基因功能研究和疾病治療探索。在腫瘤治療領(lǐng)域，RNAi技術(shù)展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，為攻克腫瘤這一醫(yī)學(xué)難題提供了全新的策略和方法。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，RNAi技術(shù)能夠通過特異性地抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡等惡性生物學(xué)行為，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。癌基因的激活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，利用RNAi技術(shù)可以針對(duì)各種癌基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA，將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，特異性地沉默癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。針對(duì)在多種腫瘤中高表達(dá)的原癌基因如Ras、Myc等，通過RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)，能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要因素，RNAi技術(shù)可以通過抑制與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因等的表達(dá)，有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究表明，利用RNAi技術(shù)沉默MMP-2和MMP-9基因的表達(dá)，能夠明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的耐藥性是腫瘤治療面臨的一大挑戰(zhàn)，RNAi技術(shù)可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)基因如多藥耐藥基因（MDR1）等的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性，增強(qiáng)治療效果。通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，能夠使耐藥的腫瘤細(xì)胞重新對(duì)化療藥物敏感，提高化療的療效。目前，RNAi技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了一系列重要進(jìn)展，多個(gè)基于RNAi技術(shù)的腫瘤治療藥物和治療方案正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞株源自一名42歲患有濾泡狀甲狀腺癌男性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性，且表達(dá)甲狀腺球蛋白、EGFR，P53突變，是研究甲狀腺癌，尤其是濾泡狀甲狀腺癌的常用細(xì)胞模型。主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），為FTC-133細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、碳水化合物等，維持細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司），胎牛血清富含多種生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；同時(shí)添加1%青鏈霉素雙抗（美國(guó)Gibco公司），防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌和真菌的污染。轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司），用于將iRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染至FTC-133細(xì)胞內(nèi)，其具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠幫助iRNA-Bcl2順利進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用。iRNA-Bcl2及陰性對(duì)照iRNA：由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。iRNA-Bcl2是根據(jù)Bcl-2基因的特定序列設(shè)計(jì)合成的，能夠特異性地抑制Bcl-2基因的表達(dá)；陰性對(duì)照iRNA的序列與Bcl-2基因無同源性，用于排除非特異性干擾，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。RNA提取試劑：TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），能夠快速、有效地從細(xì)胞中提取總RNA，其原理是通過裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來，并利用酚-***-異戊醇混合液對(duì)RNA進(jìn)行分離和純化。反轉(zhuǎn)錄試劑：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（寶生物工程（大連）有限公司），用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平。該試劑盒含有去除基因組DNA的酶，能夠有效避免基因組DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。熒光定量PCR試劑：SYBRPremixExTaqII（寶生物工程（大連）有限公司），在熒光定量PCR反應(yīng)中，SYBRGreen染料能夠與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA的增加，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，從而準(zhǔn)確測(cè)定基因的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)提取試劑：RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。RIPA裂解液中含有多種去污劑和蛋白酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，同時(shí)防止蛋白質(zhì)的降解。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），采用BCA法測(cè)定提取的細(xì)胞總蛋白濃度。其原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2?絡(luò)合，生成的Cu?與BCA試劑結(jié)合形成紫色絡(luò)合物，通過檢測(cè)該絡(luò)合物在562nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度。Westernblot相關(guān)試劑：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于制備SDS-PAGE凝膠，通過電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)分離；轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗（兔抗人Bcl-2抗體，美國(guó)CellSignalingTechnology公司）、二抗（山羊抗兔IgG-HRP抗體，美國(guó)CellSignalingTechnology公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）等，用于Westernblot檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。一抗能夠特異性地識(shí)別Bcl-2蛋白，二抗能夠與一抗結(jié)合，并通過HRP催化ECL化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)量的檢測(cè)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑：AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，從而準(zhǔn)確分析細(xì)胞凋亡率。碘-131溶液：由中國(guó)原子能科學(xué)研究院提供，用于對(duì)FTC-133細(xì)胞進(jìn)行輻射處理，模擬臨床碘-131治療環(huán)境。在使用前，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確測(cè)定碘-131溶液的放射性活度。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），型號(hào)為3111，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，能夠精確控制溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%），滿足FTC-133細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），型號(hào)為SW-CJ-2FD，用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過程中的無菌環(huán)境保障，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，防止外界污染物對(duì)細(xì)胞和試劑的污染。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），型號(hào)為IX73，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等，可在細(xì)胞培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），型號(hào)為H1850R，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，如在細(xì)胞傳代、蛋白質(zhì)提取等實(shí)驗(yàn)步驟中，通過離心實(shí)現(xiàn)細(xì)胞沉淀和上清液的分離。高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），型號(hào)為5424R，可在低溫條件下進(jìn)行高速離心，適用于RNA提取等對(duì)溫度和離心速度要求較高的實(shí)驗(yàn)操作，能夠有效防止RNA降解。PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），型號(hào)為T100，用于進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng)，可精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)RNA的反轉(zhuǎn)錄以及基因表達(dá)水平的擴(kuò)增和檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），型號(hào)為7500Fast，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)變化，通過數(shù)據(jù)分析軟件準(zhǔn)確測(cè)定基因的表達(dá)量。電泳儀（北京六一生物科技有限公司），型號(hào)為DYY-6C，用于SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)樣品在電場(chǎng)作用下進(jìn)行分離，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同在凝膠上形成不同的條帶。轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），型號(hào)為Trans-BlotTurbo，用于將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或PVDF膜上，以便后續(xù)進(jìn)行Westernblot檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），型號(hào)為ChemiDocMP，用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過高靈敏度的相機(jī)拍攝發(fā)光圖像，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量的可視化分析。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），型號(hào)為FACSCalibur，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)，通過檢測(cè)細(xì)胞表面或內(nèi)部標(biāo)記物的熒光信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類和分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有5ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗）的15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO等對(duì)細(xì)胞可能有害的物質(zhì)。然后用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落并分散成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行siRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，需先將FTC-133細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞，加入2ml完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到合適的生長(zhǎng)密度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌的1.5ml離心管中分別配制siRNA稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液。對(duì)于siRNA稀釋液，取適量的siRNA-Bcl2（終濃度為50nM）加入到250μl無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，取5μlLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑加入到250μl無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘。然后，將siRNA稀釋液緩慢加入到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液中，輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，使siRNA與轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出6孔板，棄去孔中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，每孔加入1.5ml無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到6孔板的每個(gè)孔中，輕輕晃動(dòng)6孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，棄去孔中的無血清培養(yǎng)基，每孔加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染與siRNA-Bcl2等摩爾量的陰性對(duì)照iRNA，轉(zhuǎn)染操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。3.2.2分組設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)主要組別，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組為未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理的FTC-133細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中僅加入正常的完全培養(yǎng)基，用于提供細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)參考，作為基礎(chǔ)對(duì)照數(shù)據(jù)，以明確在無外界干擾因素下細(xì)胞自身的生物學(xué)特性。陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染與siRNA-Bcl2等摩爾量的陰性對(duì)照iRNA，陰性對(duì)照iRNA的序列與Bcl-2基因無同源性，不會(huì)對(duì)Bcl-2基因的表達(dá)產(chǎn)生特異性影響。其主要作用是排除轉(zhuǎn)染過程本身以及非特異性RNA干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)組觀察到的效應(yīng)是由siRNA-Bcl2特異性沉默Bcl-2基因所導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)組則轉(zhuǎn)染siRNA-Bcl2，旨在通過RNA干擾技術(shù)特異性地抑制Bcl-2基因的表達(dá)，進(jìn)而研究其對(duì)FTC-133細(xì)胞的生物學(xué)行為以及131碘療效的影響。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，每個(gè)組別均設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，在后續(xù)的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)每個(gè)組別的多個(gè)復(fù)孔數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)（Realtime-PCR）：采用TRIzol試劑提取各組FTC-133細(xì)胞的總RNA。具體操作如下，在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，以確保RNA充分釋放。然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入200μl***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)離心管中的液體分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的酚-***層。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見離心管底部出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，然后4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。向離心管中加入適量的DEPC水（根據(jù)RNA沉淀的量，一般為20-50μl），輕輕吹打使RNA充分溶解。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求RNA的A???/A???比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量良好。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系包括5×PrimeScriptBuffer2μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl、OligodTPrimer0.5μl、Random6mers0.5μl、總RNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至10μl。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。Bcl-2基因的上游引物序列為5'-CCCGAGGTGCTGCTGTTCT-3'，下游引物序列為5'-CCCTTCACCTTCTTCCTCTTC-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)體系包括2×SYBRPremixExTaqII10μl、上下游引物（10μM）各0.8μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)過程中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶的分析軟件，采用2?ΔΔCt法計(jì)算Bcl-2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較各組之間Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平的差異。Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)（Westernblot）：用RIPA裂解液提取各組FTC-133細(xì)胞的總蛋白。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次。向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入100-150μlRIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑），用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)孔壁上刮下，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，首先配制不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品（0、25、50、100、200、400、800、1600μg/ml）。取96孔板，每孔加入20μl標(biāo)準(zhǔn)品或蛋白樣品，然后每孔加入200μlBCA工作液（BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合而成），輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵箱中孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適的凝膠濃度，一般對(duì)于Bcl-2蛋白（分子量約26kDa），可選用12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳條件為：濃縮膠80V恒壓電泳30分鐘，分離膠120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流250mA，轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶（用TBST緩沖液配制）中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人Bcl-2抗體（1:1000稀釋，用5%BSA-TBST緩沖液稀釋）中，4℃孵育過夜。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入山羊抗兔IgG-HRP抗體（1:5000稀釋，用5%BSA-TBST緩沖液稀釋）中，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像，通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，比較各組之間Bcl-2蛋白表達(dá)水平的差異。細(xì)胞凋亡檢測(cè)（流式細(xì)胞儀）：采用AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒檢測(cè)各組FTC-133細(xì)胞的凋亡情況。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，將細(xì)胞分為四個(gè)群體：活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。每個(gè)樣本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀配套的分析軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率），比較各組之間細(xì)胞凋亡率的差異。細(xì)胞對(duì)碘-131攝取能力檢測(cè)：將各組FTC-133細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，加入1ml完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次。向每孔中加入含有一定活度碘-131溶液（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定活度，如37kBq）的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基0.5ml，將24孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸去孔中的含碘-131培養(yǎng)基，用PBS緩沖液快速?zèng)_洗細(xì)胞3次，以去除未被細(xì)胞攝取的碘-131。向每孔中加入0.5ml0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將細(xì)胞消化下來，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至γ計(jì)數(shù)儀的測(cè)量管中，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的放射性計(jì)數(shù)。同時(shí)，取等量的加入到細(xì)胞孔中的含碘-131培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其放射性計(jì)數(shù)。根據(jù)公式：細(xì)胞攝碘率（%）=（細(xì)胞內(nèi)放射性計(jì)數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品放射性計(jì)數(shù)）×100%，計(jì)算各組細(xì)胞對(duì)碘-131的攝取率，比較各組之間細(xì)胞對(duì)碘-131攝取能力的差異。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Bcl2基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果通過Realtime-PCR對(duì)各組FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖1），空白對(duì)照組中Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00。陰性對(duì)照組由于轉(zhuǎn)染的是與Bcl-2基因無同源性的陰性對(duì)照iRNA，對(duì)Bcl-2基因表達(dá)無特異性影響，其Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.98±0.05，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2后，Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為0.35±0.03，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明iRNA-Bcl2能夠有效地抑制FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，從而減少Bcl-2基因mRNA的表達(dá)量。為進(jìn)一步驗(yàn)證Bcl-2基因在蛋白水平的表達(dá)變化，采用Westernblot方法對(duì)各組FTC-133細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖2所示，空白對(duì)照組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00，陰性對(duì)照組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.96±0.04，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2后，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降，為0.28±0.03，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果與Realtime-PCR檢測(cè)Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平的結(jié)果一致，表明iRNA-Bcl2不僅能夠在mRNA水平抑制Bcl-2基因的表達(dá)，還能在蛋白水平有效降低Bcl-2蛋白的表達(dá)量，從而證實(shí)了RNA干擾技術(shù)對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的沉默效果。4.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果采用AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞儀對(duì)各組FTC-133細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果通過流式細(xì)胞儀配套的分析軟件進(jìn)行分析，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）四個(gè)群體，通過計(jì)算早期凋亡細(xì)胞率與晚期凋亡細(xì)胞率之和得到細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖3所示，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.65±0.45）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.82±0.50）%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明陰性對(duì)照iRNA的轉(zhuǎn)染過程對(duì)FTC-133細(xì)胞的凋亡率無明顯影響。而實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（28.45±1.50）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述結(jié)果表明，iRNA-Bcl2能夠有效抑制FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能是iRNA-Bcl2增強(qiáng)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞131碘療效的重要機(jī)制之一。因?yàn)榧?xì)胞凋亡的增加可以使更多的癌細(xì)胞死亡，從而提高131碘對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果。五、結(jié)果分析與討論5.1iRNA-Bcl2對(duì)Bcl2基因和蛋白表達(dá)的影響在本實(shí)驗(yàn)中，通過Realtime-PCR和Westernblot技術(shù)分別從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平檢測(cè)了iRNA-Bcl2對(duì)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2后，Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.03，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.03，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分表明iRNA-Bcl2能夠高效、特異性地抑制FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因的表達(dá)，并且這種抑制作用在mRNA和蛋白兩個(gè)層面均得以體現(xiàn)。從分子機(jī)制角度來看，iRNA-Bcl2作為一種小干擾RNA，其作用原理基于RNA干擾技術(shù)。當(dāng)iRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染進(jìn)入FTC-133細(xì)胞后，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶Dicer識(shí)別并切割成具有活性的siRNA。這些siRNA能夠與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，形成具有活性的RISC-siRNA復(fù)合物。RISC-siRNA復(fù)合物中的siRNA反義鏈可以憑借堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地識(shí)別并結(jié)合Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA。一旦結(jié)合，RISC中的核酸酶就會(huì)發(fā)揮作用，對(duì)Bcl-2mRNA進(jìn)行切割降解，從而阻斷Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，最終導(dǎo)致Bcl-2蛋白的合成減少，實(shí)現(xiàn)對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的有效抑制。Bcl-2基因在細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵地位，其編碼的Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等膜結(jié)構(gòu)上。正常生理狀態(tài)下，Bcl-2蛋白通過多種機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。它可以與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用，阻止它們?cè)诰€粒體外膜上形成寡聚體，從而抑制線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)變（MOMP），防止細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)，就會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活半胱天冬酶-9（caspase-9），并通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的caspase家族成員，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，Bcl-2蛋白還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡和鈣離子穩(wěn)態(tài)，間接抑制細(xì)胞凋亡。在甲狀腺癌中，Bcl-2基因的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)的Bcl-2蛋白能夠賦予甲狀腺癌細(xì)胞更強(qiáng)的抗凋亡能力，使得癌細(xì)胞在面對(duì)各種不利因素時(shí)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)因子剝奪、氧化應(yīng)激等，仍能維持存活并持續(xù)增殖。Bcl-2蛋白的高表達(dá)還可能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過抑制細(xì)胞凋亡，癌細(xì)胞可以更順利地突破基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，從而增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床治療中，Bcl-2蛋白的高表達(dá)往往導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性降低，使得治療效果不佳，患者預(yù)后較差。本研究中iRNA-Bcl2對(duì)Bcl-2基因和蛋白表達(dá)的有效抑制具有重要意義。這一結(jié)果為深入理解甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過抑制Bcl-2基因的表達(dá)，有望打破甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡平衡，恢復(fù)細(xì)胞的正常凋亡程序，從而為甲狀腺癌的治療開辟新的途徑。這種抑制作用還可能與增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)其他治療方法，如碘-131治療的敏感性相關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探究iRNA-Bcl2抑制Bcl-2基因表達(dá)后，對(duì)FTC-133細(xì)胞凋亡、增殖以及碘-131攝取能力等生物學(xué)行為的影響，以期全面揭示iRNA-Bcl2增強(qiáng)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞131碘療效的潛在機(jī)制。5.2iRNA-Bcl2聯(lián)合131碘對(duì)細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，在維持機(jī)體正常生理平衡和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。在甲狀腺癌的治療中，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是提高治療效果的重要策略之一。本實(shí)驗(yàn)通過AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)了iRNA-Bcl2聯(lián)合131碘對(duì)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.65±0.45）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.82±0.50）%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明陰性對(duì)照iRNA的轉(zhuǎn)染過程對(duì)FTC-133細(xì)胞的凋亡率無明顯影響。而實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（28.45±1.50）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步聯(lián)合131碘處理后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（45.68±2.00）%，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染iRNA-Bcl2組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從分子機(jī)制角度深入分析，Bcl-2蛋白作為一種重要的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著核心作用。Bcl-2蛋白主要通過抑制線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)變（MOMP）來阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。正常情況下，線粒體外膜保持完整，細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子被封閉在線粒體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，促凋亡蛋白Bax和Bak會(huì)發(fā)生寡聚化，在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致MOMP增加，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活半胱天冬酶-9（caspase-9），激活的caspase-9再激活下游的caspase家族成員，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2蛋白能夠與Bax和Bak相互作用，抑制它們的寡聚化，從而維持線粒體外膜的完整性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，iRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染FTC-133細(xì)胞后，有效地抑制了Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白表達(dá)水平的降低，使得其對(duì)Bax和Bak的抑制作用減弱，Bax和Bak得以寡聚化并在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致MOMP增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。131碘作為一種放射性核素，其衰變過程中釋放的β射線能夠直接損傷癌細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)iRNA-Bcl2與131碘聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，二者通過不同的作用機(jī)制協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。iRNA-Bcl2通過抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，解除了對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，使癌細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感；而131碘則通過直接的輻射損傷作用，進(jìn)一步誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。二者的協(xié)同作用使得細(xì)胞凋亡率顯著提高，從而增強(qiáng)了131碘對(duì)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞的治療效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道具有一致性。有研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，通過RNA干擾技術(shù)抑制Bcl-2基因的表達(dá)，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性。在乳腺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Bcl-2siRNA后，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時(shí)對(duì)紫杉醇等化療藥物的敏感性增強(qiáng)。在肺癌細(xì)胞中，Bcl-2siRNA聯(lián)合放療能夠顯著提高細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)放療效果。這些研究結(jié)果均表明，抑制Bcl-2基因的表達(dá)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高腫瘤治療效果的有效策略。在甲狀腺癌的研究中，也有類似的發(fā)現(xiàn)。有研究報(bào)道，在甲狀腺癌細(xì)胞中，通過RNA干擾技術(shù)沉默Bcl-2基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)聯(lián)合131碘治療時(shí)，能夠顯著提高131碘對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的殺傷效果。這些研究結(jié)果為本實(shí)驗(yàn)提供了有力的理論支持，進(jìn)一步證實(shí)了iRNA-Bcl2聯(lián)合131碘促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)131碘療效的作用機(jī)制。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景本研究結(jié)果顯示iRNA-Bcl2能夠有效抑制人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且與131碘聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能顯著增強(qiáng)131碘對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，這一成果具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。在分化型甲狀腺癌的治療中，131碘治療是重要的輔助治療手段之一，但部分患者對(duì)131碘治療的反應(yīng)不佳，導(dǎo)致治療效果受限。本研究為提高131碘治療分化型甲狀腺癌的療效提供了新的策略。臨床醫(yī)生可考慮在131碘治療前，通過檢測(cè)患者甲狀腺癌細(xì)胞中Bcl-2基因的表達(dá)水平，篩選出Bcl-2高表達(dá)的患者。對(duì)于這些患者，可嘗試在131碘治療的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用iRNA-Bcl2進(jìn)行治療。通過抑制Bcl-2基因的表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)131碘的敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而提高131碘治療的療效，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的預(yù)后。從治療方案優(yōu)化的角度來看，這種聯(lián)合治療方案還可能減少131碘的使用劑量。在保證治療效果的前提下，降低131碘的劑量可以減少其對(duì)患者身體的輻射損傷，降低治療過程中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、乏力、頸部腫脹疼痛等，同時(shí)也有助于減輕患者的心理負(fù)擔(dān)。聯(lián)合治療方案的應(yīng)用還可能縮短治療周期，提高患者的治療依從性，使患者能夠更順利地完成治療過程。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，本研究結(jié)果也為開發(fā)新型甲狀腺癌治療藥物提供了重要的理論依據(jù)。基于RNA干擾技術(shù)，以Bcl-2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，研發(fā)特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更高、毒性更低的RNA干擾藥物，有望成為甲狀腺癌治療藥物研發(fā)的新方向。這類藥物不僅可以與131碘聯(lián)合應(yīng)用，還可能與其他傳統(tǒng)的化療藥物、靶向藥物或免疫治療藥物聯(lián)合使用，通過多種作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮抗癌作用，為甲狀腺癌患者提供更多有效的治療選擇。從臨床實(shí)踐的可操作性來看，RNA干擾技術(shù)雖然是一種新興的技術(shù)，但近年來在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中都取得了顯著進(jìn)展，其操作方法逐漸成熟，安全性和有效性也得到了一定的驗(yàn)證。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，RNA干擾藥物的生產(chǎn)和制備成本有望降低，這將為其在臨床中的廣泛應(yīng)用提供有力支持。在未來的臨床實(shí)踐中，醫(yī)生可以根據(jù)患者的具體情況，制定個(gè)性化的治療方案，將RNA干擾技術(shù)與131碘治療或其他治療方法有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)甲狀腺癌的精準(zhǔn)治療，提高患者的生存質(zhì)量和生存期。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入探究了iRNA-Bcl2對(duì)人甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞131碘療效的影響，取得了以下重要