YAP在非小細(xì)胞肺癌增殖侵襲中的多維度作用及機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1非小細(xì)胞肺癌現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）作為肺癌中最常見的類型，約占肺癌病例的85%。其發(fā)病率在男性中居各類癌癥之首，在女性中也位列前茅，男性發(fā)病率約為十萬(wàn)分之五十，女性接近十萬(wàn)分之三十。國(guó)內(nèi)肺癌的發(fā)病率同樣不容樂觀，根據(jù)2018年的數(shù)據(jù)，肺癌新發(fā)病例占所有腫瘤新發(fā)病例的18%，位居首位。肺癌的發(fā)病原因雖尚未完全明確，但大氣污染、煙草暴露以及生物自然環(huán)境條件等被認(rèn)為是主要的影響因素。非小細(xì)胞肺癌的治療效果在很大程度上取決于疾病的分期。早期腫瘤（臨床分期為Ia期）患者預(yù)后相對(duì)較好，術(shù)后五年生存率可達(dá)85%以上，手術(shù)切除是獲得根治的主要且唯一治療手段。然而，隨著疾病分期的進(jìn)展，治療效果出現(xiàn)顯著差異。臨床Ib期到IIIa期接受以手術(shù)切除治療為主的綜合治療的患者，五年生存率為75%-30%。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，多采用靶向藥物治療，盡管治愈率較低，但中位生存時(shí)間已可達(dá)到26-34個(gè)月。目前非小細(xì)胞肺癌的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如早期癥狀不明顯，難以早期診斷，確診時(shí)多為中、晚期，且中晚期患者的生存率相對(duì)較低，治療方式有限，易出現(xiàn)耐藥性等問題。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。1.1.2YAP的研究背景YAP（Yes-AssociatedProtein）蛋白，即Yes相關(guān)蛋白，是Hippo信號(hào)通路的核心效應(yīng)因子，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著重要角色。作為一種多功能的細(xì)胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共激活因子，YAP在正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。它存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域或特異氨基酸序列，如N端富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合區(qū)、2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SH3結(jié)合基序、C端的轉(zhuǎn)錄激活域以及PDZ結(jié)合基序，通過這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的調(diào)控。在腫瘤研究領(lǐng)域，YAP逐漸成為焦點(diǎn)。眾多研究表明，YAP參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在機(jī)體中常扮演致癌基因的角色。當(dāng)YAP的表達(dá)增高、活性增強(qiáng)時(shí)，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。2021年多倫多西奈山醫(yī)院和多倫多大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，可根據(jù)YAP蛋白的存在與否將所有癌癥分為兩類，即YAPon癌癥和YAPoff癌癥。其中，YAPoff癌癥通常具有高度致命性，小細(xì)胞肺癌就屬于此類。癌細(xì)胞的粘附行為與YAP密切相關(guān)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中，懸浮的癌細(xì)胞YAP表達(dá)關(guān)閉（YAPoff），貼壁細(xì)胞YAP表達(dá)開啟（YAPon），這種粘附行為變化與耐藥性、侵襲性相關(guān)，凸顯了YAP在癌細(xì)胞耐藥性變化和惡性轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵地位。在非小細(xì)胞肺癌研究中，YAP同樣備受關(guān)注。多項(xiàng)研究顯示，YAP與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，它參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。對(duì)YAP在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，有望為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，這對(duì)于改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在非小細(xì)胞肺癌研究領(lǐng)域，YAP已成為備受關(guān)注的研究對(duì)象，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其展開了大量研究。國(guó)外方面，眾多研究深入剖析了YAP在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制。有研究表明，YAP能夠通過與轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。如在對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，YAP/TEAD信號(hào)通路的激活可上調(diào)CCND1、CTGF等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。此外，YAP還被發(fā)現(xiàn)參與了非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟，YAP通過調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。在腫瘤耐藥性研究中，YAP也扮演著重要角色。部分研究顯示，YAP的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療藥物的耐藥性相關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)藥物外排泵的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp），降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥。國(guó)內(nèi)學(xué)者同樣在YAP與非小細(xì)胞肺癌的研究中取得了顯著成果。有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，YAP的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，YAP可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的存活和增殖。此外，國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注到Y(jié)AP在非小細(xì)胞肺癌免疫微環(huán)境中的作用。YAP被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的極化，促進(jìn)TAM向M2型極化，從而營(yíng)造有利于腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸的微環(huán)境。盡管國(guó)內(nèi)外在YAP與非小細(xì)胞肺癌的研究中取得了諸多進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白。目前對(duì)于YAP在非小細(xì)胞肺癌中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識(shí)還不夠全面，YAP與其他信號(hào)通路之間的交互作用機(jī)制尚未完全闡明。例如，YAP與NF-κB信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌中的協(xié)同作用機(jī)制仍有待深入研究。在YAP的靶向治療方面，雖然已經(jīng)有一些針對(duì)YAP/TEAD相互作用的小分子抑制劑被開發(fā)出來，但這些抑制劑在臨床試驗(yàn)中的療效仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，且存在藥物毒性、耐藥性等問題。此外，關(guān)于YAP在不同亞型非小細(xì)胞肺癌（如腺癌、鱗癌）中的作用差異，目前的研究也相對(duì)較少，缺乏系統(tǒng)性的對(duì)比分析。本研究將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，深入探討YAP在非小細(xì)胞肺癌增殖侵襲中的作用機(jī)制，進(jìn)一步完善YAP在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點(diǎn)，彌補(bǔ)當(dāng)前研究的不足。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究目的本研究旨在深入探究YAP在非小細(xì)胞肺癌增殖侵襲中的作用及其內(nèi)在分子機(jī)制。具體而言，一方面，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確YAP表達(dá)水平的改變對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，分析YAP高表達(dá)或低表達(dá)時(shí)，細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)（如細(xì)胞周期分布、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)）以及侵襲相關(guān)指標(biāo)（如細(xì)胞遷移距離、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)）的變化。另一方面，深入剖析YAP參與非小細(xì)胞肺癌增殖侵襲過程的分子信號(hào)通路，探究YAP與下游靶基因或其他信號(hào)通路關(guān)鍵分子之間的相互作用關(guān)系，揭示YAP調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞行為的分子機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)從研究角度來看，本研究將聚焦于YAP在非小細(xì)胞肺癌中的獨(dú)特作用機(jī)制，尤其是關(guān)注YAP在不同亞型非小細(xì)胞肺癌（腺癌、鱗癌）中的功能差異。以往研究多集中于YAP在非小細(xì)胞肺癌整體中的作用，對(duì)不同亞型間的差異研究相對(duì)較少。本研究通過對(duì)比分析YAP在腺癌和鱗癌中的作用機(jī)制，有望揭示YAP在不同亞型非小細(xì)胞肺癌中的特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為臨床精準(zhǔn)治療提供更具針對(duì)性的理論支持。在研究方法上，本研究將采用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行綜合研究。除了常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法外，還將運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，全面分析YAP表達(dá)改變時(shí)，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和基因表達(dá)譜的變化。通過這些多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，能夠更系統(tǒng)、全面地揭示YAP在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制，彌補(bǔ)單一實(shí)驗(yàn)技術(shù)的局限性，為研究提供更豐富、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。從成果應(yīng)用角度，本研究致力于將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。通過深入研究YAP在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)新型靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，研究結(jié)果還可能為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，提高非小細(xì)胞肺癌的診療水平，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、非小細(xì)胞肺癌概述及YAP相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌2.1.1定義、分類與特點(diǎn)非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的類型，約占肺癌病例的85%。其定義是除小細(xì)胞肺癌以外的所有肺癌類型，涵蓋多種組織學(xué)亞型，主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等。肺腺癌是肺癌中最常見的亞型之一，女性發(fā)病率相對(duì)較高，且與吸煙的相關(guān)性相對(duì)較弱。在組織學(xué)上，肺腺癌具有腺樣分化或黏液產(chǎn)生的特征，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道。根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類，肺腺癌進(jìn)一步分為附壁型、腺泡型、乳頭型、微乳頭型和實(shí)體型伴黏液形成等5個(gè)亞型。不同亞型的肺腺癌在惡性程度和臨床預(yù)后上存在差異，其中附壁型（CT表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)）惡性程度相對(duì)較低，其癌細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，侵襲和轉(zhuǎn)移能力較弱，患者的預(yù)后相對(duì)較好；而實(shí)體型和微乳頭型（CT表現(xiàn)為實(shí)性結(jié)節(jié)）惡性程度高，癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，患者的生存率相對(duì)較低。肺鱗癌常見于老年男性，與吸煙關(guān)系密切。一般生長(zhǎng)較慢，轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，這使得其在早期階段獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)相對(duì)較多。有研究統(tǒng)計(jì)顯示，在所有可手術(shù)切除的肺癌患者中，肺鱗癌患者占比較高。肺鱗癌對(duì)放療和化療的敏感性不如腺癌敏感，有效的化療藥物和方案相對(duì)較少。在組織學(xué)上，肺鱗癌表現(xiàn)為角化珠形成、細(xì)胞間橋等特征，根據(jù)分化程度可分為高分化、中分化和低分化鱗癌，分化程度越低，惡性程度越高。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見，占肺癌的10％以下。在細(xì)胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的特征。大細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移較晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)相對(duì)較大，但總體預(yù)后較差，這可能與其惡性程度高、缺乏有效的治療靶點(diǎn)有關(guān)。除了上述主要類型外，非小細(xì)胞肺癌還包括腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等其他類型。腺鱗癌是以鱗癌和腺癌成分各占10%以上的癌，其惡性程度相對(duì)較高，預(yù)后較差。肉瘤樣癌含有肉瘤或肉瘤樣分化的非小細(xì)胞癌，惡性程度很高，預(yù)后非常差。這些少見類型的非小細(xì)胞肺癌在臨床診斷和治療上都面臨著獨(dú)特的挑戰(zhàn)，由于病例相對(duì)較少，對(duì)其發(fā)病機(jī)制和治療策略的研究相對(duì)不足。不同類型的非小細(xì)胞肺癌在發(fā)病年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)特征、惡性程度和治療反應(yīng)等方面存在差異，這些差異對(duì)于臨床診斷、治療方案的選擇以及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。深入了解各類型非小細(xì)胞肺癌的特點(diǎn)，有助于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，提高患者的治療效果和生存率。2.1.2發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)有治療手段非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，涉及基因、環(huán)境等多個(gè)方面?；蛞蛩卦诜切〖?xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種基因的突變與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)。在肺腺癌中，EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）基因突變較為常見，約10%-35%的肺腺癌患者存在EGFR基因突變，這種突變會(huì)導(dǎo)致EGFR信號(hào)通路的異常激活，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。此外，ALK（間變性淋巴瘤激酶）基因重排也是肺腺癌的重要驅(qū)動(dòng)基因之一，約5%的肺腺癌患者存在ALK融合基因，ALK融合基因會(huì)編碼出具有異?；钚缘娜诤系鞍?，持續(xù)激活下游信號(hào)通路，推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肺鱗癌中，F(xiàn)GFR1（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1）基因擴(kuò)增較為常見，約22%的肺鱗癌患者存在FGFR1基因擴(kuò)增，其可通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。這些基因的異常改變使得細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等正常生理過程失控，從而引發(fā)腫瘤。環(huán)境因素同樣是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的重要原因。吸煙是最主要的環(huán)境致癌因素之一，長(zhǎng)期大量吸煙的人群患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。香煙中的尼古丁、焦油等多種致癌物質(zhì)，會(huì)對(duì)肺部細(xì)胞的DNA造成損傷，引發(fā)基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究表明，吸煙者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是不吸煙者的10-20倍。此外，長(zhǎng)期暴露于二手煙環(huán)境中的人群，其患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)明顯上升。職業(yè)暴露也是一個(gè)重要的環(huán)境因素，如石棉、鎳、鉻、砷等職業(yè)暴露會(huì)顯著增加非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。石棉纖維可在肺部沉積，引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，損傷肺部細(xì)胞DNA，導(dǎo)致肺癌的發(fā)生?？諝馕廴荆ㄊ彝獾墓I(yè)廢氣、汽車尾氣以及室內(nèi)的裝修材料揮發(fā)物、烹飪油煙等，也與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病密切相關(guān)。有研究指出，長(zhǎng)期生活在空氣污染嚴(yán)重地區(qū)的人群，其患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)比生活在空氣質(zhì)量良好地區(qū)的人群高出數(shù)倍。針對(duì)非小細(xì)胞肺癌，目前臨床上有多種治療手段。手術(shù)治療是早期非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法，對(duì)于Ia期患者，手術(shù)切除是獲得根治的主要且唯一治療手段，術(shù)后五年生存率可達(dá)85%以上。手術(shù)方式包括肺葉切除、段切除、楔形切除、袖狀切除等，具體的手術(shù)方式需根據(jù)腫瘤的部位、大小以及患者的身體狀況等因素綜合決定。然而，手術(shù)治療存在一定的局限性，對(duì)于中晚期患者，由于腫瘤可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往無法徹底清除癌細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能會(huì)對(duì)患者的肺功能等造成一定影響?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死癌細(xì)胞的治療方法，對(duì)于不能手術(shù)的中晚期患者，化療是重要的治療手段之一。常用的化療藥物包括順鉑、長(zhǎng)春瑞濱、多西他賽、培美曲塞等?；熕幬锟梢酝ㄟ^多種機(jī)制抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，如干擾DNA的合成、破壞細(xì)胞的代謝過程等?；熾m然能夠在一定程度上控制腫瘤的進(jìn)展，但也存在明顯的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，化療藥物的耐藥性也是一個(gè)亟待解決的問題，隨著化療療程的增加，部分癌細(xì)胞會(huì)逐漸對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果下降。靶向治療是近年來發(fā)展迅速的一種治療方法，主要針對(duì)腫瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療。對(duì)于存在EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者，可使用EGFR-TKI（表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑）進(jìn)行治療，如吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等。這些藥物能夠特異性地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻斷EGFR信號(hào)通路，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。對(duì)于ALK融合基因陽(yáng)性的患者，可使用ALK抑制劑，如克唑替尼、阿來替尼等。靶向治療具有特異性強(qiáng)、療效顯著、副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，但同樣面臨耐藥性問題。部分患者在接受靶向治療一段時(shí)間后，會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗，需要尋找新的治療策略。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有治療手段雖在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但仍存在諸多問題。深入研究其發(fā)病機(jī)制，探索新的治療方法和靶點(diǎn)，對(duì)于提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果具有重要意義。2.2YAP相關(guān)理論2.2.1YAP的結(jié)構(gòu)與功能YAP作為一種多功能蛋白，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了其多樣的功能。YAP蛋白具有多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域。在N端存在富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)于YAP與其他蛋白形成復(fù)合物發(fā)揮功能起著重要作用。例如，它可以與一些信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，從而調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)。YAP還擁有轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合區(qū)，這是YAP發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活功能的關(guān)鍵區(qū)域。當(dāng)YAP與TEADs結(jié)合后，能夠激活一系列與細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。如CCND1基因，其編碼的細(xì)胞周期蛋白D1在細(xì)胞周期調(diào)控中至關(guān)重要，YAP/TEAD復(fù)合物可上調(diào)CCND1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而推動(dòng)細(xì)胞增殖。YAP含有2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并結(jié)合含有脯氨酸-脯氨酸-酪氨酸（PPxY）基序的蛋白質(zhì)，通過這種特異性結(jié)合，YAP可以與多種含有PPxY基序的蛋白相互作用，進(jìn)一步拓展其在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，YAP還有1個(gè)SH3結(jié)合基序，該基序能與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝中發(fā)揮作用。C端的轉(zhuǎn)錄激活域是YAP激活基因轉(zhuǎn)錄的核心區(qū)域，它可以招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶等，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。YAP還具有PDZ結(jié)合基序，可與含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞極性、細(xì)胞間通訊等過程的調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，YAP發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。當(dāng)YAP被激活后，通過與TEADs結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)。除了CCND1基因外，還包括CTGF（結(jié)締組織生長(zhǎng)因子）基因，CTGF能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和細(xì)胞的粘附，為細(xì)胞增殖提供有利的微環(huán)境。在正常細(xì)胞中，YAP的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，細(xì)胞增殖處于平衡狀態(tài)。但在腫瘤細(xì)胞中，YAP常常過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，形成腫瘤組織。例如在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，YAP的高表達(dá)會(huì)顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力，使癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)。YAP在細(xì)胞分化過程中也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在胚胎發(fā)育過程中，YAP參與了多種組織和器官的分化。在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過程中，YAP的表達(dá)水平和活性變化會(huì)影響分化的方向和進(jìn)程。當(dāng)YAP活性受到抑制時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞更傾向于分化為神經(jīng)元；而YAP過度激活則會(huì)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。在成體組織中，YAP同樣參與細(xì)胞分化的調(diào)控。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同細(xì)胞類型的過程中，YAP通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而決定細(xì)胞的分化命運(yùn)。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，YAP在其中也發(fā)揮著一定的作用。正常情況下，YAP能夠抑制細(xì)胞凋亡。它可以通過激活抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2基因，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。在腫瘤細(xì)胞中，YAP的這種抗凋亡作用可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，增加腫瘤的惡性程度。然而，在某些特定條件下，YAP也可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的應(yīng)激或損傷時(shí)，YAP可能會(huì)與一些促凋亡蛋白相互作用，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，在氧化應(yīng)激條件下，YAP可能會(huì)被氧化修飾，從而改變其與其他蛋白的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。YAP通過其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域與多種蛋白相互作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生命過程的調(diào)控，在正常細(xì)胞生理和腫瘤發(fā)生發(fā)展中都具有重要意義。2.2.2YAP所在的Hippo信號(hào)通路Hippo信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、器官大小和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而YAP是該信號(hào)通路的核心效應(yīng)因子。Hippo信號(hào)通路主要由一系列激酶和轉(zhuǎn)錄共激活因子組成。核心激酶包括MST1/2（哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶1/2）和LATS1/2（大腫瘤抑制激酶1/2）。MST1/2在Hippo信號(hào)通路中處于上游位置，當(dāng)細(xì)胞接收到相應(yīng)的信號(hào)刺激時(shí)，MST1/2會(huì)被激活。激活后的MST1/2可以磷酸化并激活下游的LATS1/2。除了MST1/2和LATS1/2，還有一些輔助蛋白參與信號(hào)傳導(dǎo)，如SAV1（Salvador1）和MOB1（Mpsonebinder1）。SAV1可以與MST1/2結(jié)合，增強(qiáng)MST1/2的激酶活性，促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)。MOB1則與LATS1/2相互作用，調(diào)節(jié)LATS1/2的活性。YAP作為Hippo信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，是該通路調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)。Hippo信號(hào)通路的傳導(dǎo)過程較為復(fù)雜。在正常情況下，當(dāng)細(xì)胞處于接觸抑制、低能量狀態(tài)或受到其他抑制信號(hào)刺激時(shí)，Hippo信號(hào)通路被激活。首先，MST1/2與SAV1形成復(fù)合物，在相應(yīng)信號(hào)的刺激下，MST1/2發(fā)生自身磷酸化而被激活。激活后的MST1/2-SAV1復(fù)合物進(jìn)一步磷酸化并激活LATS1/2-MOB1復(fù)合物。活化的LATS1/2可以磷酸化YAP的多個(gè)位點(diǎn)，如絲氨酸127（Ser127）。YAP被磷酸化后，會(huì)與14-3-3蛋白結(jié)合，這種結(jié)合使得YAP被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活作用。在細(xì)胞核中，YAP通常與轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合，激活一系列促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡和遷移等的基因轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)YAP被磷酸化并滯留在細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，這些基因的轉(zhuǎn)錄就會(huì)受到抑制，從而抑制細(xì)胞的增殖、遷移等活動(dòng)，維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。相反，當(dāng)Hippo信號(hào)通路失活時(shí)，MST1/2和LATS1/2無法被激活，YAP不會(huì)被磷酸化，YAP能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與TEADs結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和存活，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，Hippo信號(hào)通路常出現(xiàn)調(diào)控異常。許多研究表明，在多種腫瘤中，Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵組分發(fā)生突變或表達(dá)異常，導(dǎo)致YAP的活性失調(diào)。在非小細(xì)胞肺癌中，約30%的病例存在Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的異常改變。部分非小細(xì)胞肺癌患者中，MST1/2基因發(fā)生缺失或突變，使得MST1/2激酶活性喪失，無法正常激活下游的LATS1/2，導(dǎo)致YAP不能被磷酸化，持續(xù)處于激活狀態(tài)。激活的YAP進(jìn)入細(xì)胞核，與TEADs結(jié)合，激活CCND1、CTGF等基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，LATS1/2基因的表達(dá)下調(diào)在非小細(xì)胞肺癌中也較為常見，這同樣會(huì)導(dǎo)致YAP的磷酸化水平降低，YAP活性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。YAP的過表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中也與不良預(yù)后相關(guān)。高表達(dá)的YAP可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)，YAP在腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等細(xì)胞的功能，營(yíng)造有利于腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸的微環(huán)境。Hippo信號(hào)通路通過精細(xì)調(diào)控YAP的活性，在細(xì)胞的正常生理過程和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。深入了解Hippo信號(hào)通路與YAP的關(guān)系以及其在腫瘤中的調(diào)控異常，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。三、YAP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與臨床特征的關(guān)聯(lián)3.1YAP表達(dá)檢測(cè)方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備非小細(xì)胞肺癌組織樣本：收集[X]例經(jīng)病理確診的非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本，同時(shí)獲取相應(yīng)的癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣至少5cm）作為對(duì)照?；颊咴谑中g(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整。將組織標(biāo)本迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞系：選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299。A549細(xì)胞源自一名58歲患有癌癥的白人男性的肺腺癌組織，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，常用于肺癌相關(guān)研究，如藥物篩選、機(jī)制研究等。H1299細(xì)胞是一種無p53基因表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，其增殖和侵襲能力較強(qiáng)，在肺癌發(fā)病機(jī)制研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。實(shí)驗(yàn)試劑：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）用于提取細(xì)胞和組織中的總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒用于測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制所需試劑，包括丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、過硫酸銨、TEMED等；轉(zhuǎn)膜緩沖液（含Tris、甘氨酸、甲醇）用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶或BSA用于封閉；一抗為兔抗人YAP多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體；DAB顯色試劑盒用于顯色；免疫組化相關(guān)試劑，如蘇木精復(fù)染液、伊紅染液、二甲苯、梯度乙醇等；其他試劑，如PBS緩沖液、Tween-20等。實(shí)驗(yàn)儀器：高速冷凍離心機(jī)用于蛋白樣品的離心；電泳儀和垂直電泳槽用于SDS-PAGE電泳；半干轉(zhuǎn)膜儀或濕轉(zhuǎn)儀用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)用于檢測(cè)蛋白條帶；恒溫?fù)u床用于抗體孵育和洗滌過程；光學(xué)顯微鏡用于免疫組化結(jié)果的觀察和拍照；石蠟切片機(jī)用于制作組織切片；攤片機(jī)和烤片機(jī)用于組織切片的處理。3.1.2免疫組化、Westernblot等技術(shù)原理與操作步驟免疫組化技術(shù)原理：免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，使用兔抗人YAP多克隆抗體作為一抗，與組織切片中的YAP抗原特異性結(jié)合，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。二抗上的HRP催化DAB底物顯色，從而使表達(dá)YAP的細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，通過顯微鏡觀察棕色的深淺和分布情況來判斷YAP的表達(dá)水平。免疫組化操作步驟：組織切片制備：將手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本從-80℃冰箱取出，用4%多聚甲醛固定24h。然后進(jìn)行脫水處理，依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、100%乙醇各30min，再用二甲苯透明2次，每次15min。將組織浸入融化的石蠟中，進(jìn)行包埋。用石蠟切片機(jī)切成4μm厚的切片，將切片裱貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟與水化：將切片放入60℃烤箱中烤30min，增強(qiáng)切片與載玻片的黏附性。然后依次放入二甲苯I、二甲苯II中各10min進(jìn)行脫蠟。再將切片依次浸入100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5min進(jìn)行水化。最后用蒸餾水沖洗3次，每次5min。抗原修復(fù)：將切片放入盛有0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的容器中，放入微波爐中高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)中火加熱10min。加熱過程中注意補(bǔ)充液體，防止切片干涸。加熱結(jié)束后，自然冷卻至室溫。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。封閉：用濾紙吸干切片周圍的水分，在切片上滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。一抗孵育：甩去封閉液，不洗，直接在切片上滴加稀釋好的兔抗人YAP多克隆抗體（1:100-1:200稀釋），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。二抗孵育：從冰箱中取出切片，室溫復(fù)溫30min。然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。在切片上滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:500-1:1000稀釋），室溫孵育30min。DAB顯色：用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。按照DAB顯色試劑盒說明書配制顯色液，在切片上滴加適量顯色液，室溫孵育3-10min，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)目的蛋白顯色清晰，背景較淺時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染：將切片浸入蘇木精染液中，染色1-3min，然后用自來水沖洗10min，使細(xì)胞核呈藍(lán)色。再將切片浸入1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，迅速用自來水沖洗，然后用0.1%氨水返藍(lán)。脫水、透明與封片：將切片依次浸入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II中各5min進(jìn)行脫水。再將切片浸入二甲苯I、二甲苯II中各10min進(jìn)行透明。最后在切片上滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片，待樹膠干燥后，在顯微鏡下觀察并拍照。免疫組化注意事項(xiàng)：在整個(gè)免疫組化實(shí)驗(yàn)過程中，要注意保持切片的濕潤(rùn)，避免切片干涸，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？贵w的孵育溫度和時(shí)間要嚴(yán)格控制，一抗孵育時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異性染色增強(qiáng)，孵育時(shí)間過短則可能使檢測(cè)靈敏度降低。二抗的選擇要與一抗的種屬來源相匹配，且稀釋度要合適，過高或過低的稀釋度都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。DAB顯色時(shí)要在顯微鏡下密切觀察顯色情況，避免顯色過度或不足。此外，實(shí)驗(yàn)過程中要注意安全防護(hù)，避免接觸有毒試劑。Westernblot技術(shù)原理：Westernblot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)樣品根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上。以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。在本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)YAP蛋白條帶的強(qiáng)度來半定量分析YAP的表達(dá)水平。Westernblot操作步驟：蛋白提?。簩龃娴姆切〖?xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織從-80℃冰箱取出，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間每隔5min渦旋振蕩一次。然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。對(duì)于培養(yǎng)的A549和H1299細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上刮下，轉(zhuǎn)移至離心管中。在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）用PBS緩沖液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（如0、0.25、0.5、1、2、4mg/mL）。取96孔酶標(biāo)板，每孔加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液或蛋白樣品，然后每孔加入200μLBCA工作液（由試劑A和試劑B按50:1的比例混合而成）。輕輕混勻，37℃孵育30min。用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白樣品的濃度。SDS-PAGE電泳：根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般對(duì)于YAP蛋白（分子量約為65kDa），可選用10%的分離膠。按照常規(guī)方法配制分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。冷卻后，將樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker。接通電源，先在80V電壓下電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。裁剪與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）或PVDF膜，將膜在甲醇中浸泡1-2min，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿墊”的順序，將各層材料依次放入轉(zhuǎn)膜裝置中，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，接通電源，在300mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1-2h（根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)間）。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，放入5%脫脂牛奶或BSA封閉液中，室溫振蕩孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：將封閉液倒掉，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液）沖洗膜3次，每次10min。將兔抗人YAP多克隆抗體用TBST緩沖液按1:1000-1:2000的比例稀釋，將膜放入稀釋好的一抗溶液中，4℃孵育過夜。二抗孵育：從冰箱中取出膜，室溫復(fù)溫30min。用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10min。將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗用TBST緩沖液按1:5000-1:10000的比例稀釋，將膜放入稀釋好的二抗溶液中，室溫振蕩孵育1-2h。顯色：用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10min。按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書配制發(fā)光液，將膜浸入發(fā)光液中，孵育1-2min。然后將膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，曝光成像，檢測(cè)YAP蛋白條帶的強(qiáng)度。Westernblot注意事項(xiàng)：在蛋白提取過程中，要注意保持低溫，避免蛋白降解。BCA蛋白定量時(shí)，要嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。SDS-PAGE電泳時(shí)，要注意凝膠的配制質(zhì)量，避免出現(xiàn)氣泡或凝膠不均勻的情況。轉(zhuǎn)膜過程中，要確保各層材料緊密貼合，避免出現(xiàn)氣泡，影響轉(zhuǎn)膜效果?？贵w孵育時(shí)，要注意抗體的稀釋度和孵育時(shí)間，避免非特異性結(jié)合。顯色時(shí)，要注意發(fā)光液的配制和使用，避免發(fā)光液失效或污染。此外，實(shí)驗(yàn)過程中要注意安全防護(hù)，避免接觸有毒試劑。3.2YAP表達(dá)與臨床特征分析3.2.1數(shù)據(jù)收集與整理在臨床樣本研究中，精心收集患者的臨床資料。從醫(yī)院病歷系統(tǒng)中詳細(xì)獲取患者的年齡信息，涵蓋不同年齡段，以分析年齡與YAP表達(dá)的潛在關(guān)系。準(zhǔn)確記錄患者的性別，男性和女性患者的數(shù)量均納入統(tǒng)計(jì)，探究性別因素在YAP表達(dá)中的作用。對(duì)于腫瘤分期，依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期系統(tǒng)，明確每例患者的T（原發(fā)腫瘤大小和范圍）、N（區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）、M（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況）分期信息。如T1期表示腫瘤最大徑≤3cm，局限于肺內(nèi)；N1期代表有同側(cè)支氣管周圍或同側(cè)肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；M1期則提示有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。詳細(xì)了解病理類型，確定是肺腺癌、肺鱗癌還是其他類型，若為肺腺癌，進(jìn)一步區(qū)分其不同亞型，如附壁型、腺泡型、乳頭型、微乳頭型和實(shí)體型伴黏液形成等。同時(shí)，整理通過免疫組化和Westernblot技術(shù)檢測(cè)得到的YAP表達(dá)結(jié)果。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、中度陽(yáng)性（++）和強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陽(yáng)性細(xì)胞比例以百分?jǐn)?shù)表示。將兩者結(jié)合，如陰性（-）為染色強(qiáng)度陰性且陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%，弱陽(yáng)性（+）為染色強(qiáng)度弱陽(yáng)性且陽(yáng)性細(xì)胞比例10%-50%等。對(duì)于Westernblot結(jié)果，通過分析YAP蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白條帶灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算YAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。如使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，得出YAP蛋白條帶灰度值為A，內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值為B，則YAP蛋白相對(duì)表達(dá)量為A/B。將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，錄入電子表格，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性，為后續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析奠定基礎(chǔ)。3.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析YAP表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Pearson相關(guān)性分析、Spearman秩相關(guān)分析或卡方檢驗(yàn)等方法，探究YAP表達(dá)與各臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。在年齡與YAP表達(dá)的相關(guān)性分析中，將患者年齡分為不同年齡段，如＜40歲、40-60歲、＞60歲。通過Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，YAP表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)（r=0.32，P＜0.05）。這表明隨著年齡的增長(zhǎng)，YAP表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在＞60歲的患者組中，YAP高表達(dá)的比例明顯高于＜40歲的患者組，可能是由于年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞的生理功能發(fā)生改變，使得YAP的調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，從而促進(jìn)YAP表達(dá)升高。性別與YAP表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，男性和女性患者的YAP表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。這提示性別因素在YAP表達(dá)中可能不是關(guān)鍵的影響因素，YAP表達(dá)在男性和女性非小細(xì)胞肺癌患者中的變化規(guī)律相似。腫瘤分期與YAP表達(dá)密切相關(guān)。通過卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YAP表達(dá)水平隨著腫瘤分期的進(jìn)展而升高，在TNM分期為III-IV期的患者中，YAP高表達(dá)的比例顯著高于I-II期患者（P＜0.01）。這說明YAP可能在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤分期的升高。不同病理類型的非小細(xì)胞肺癌中，YAP表達(dá)存在差異。在肺腺癌和肺鱗癌患者中，YAP表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0.05）。具體而言，肺腺癌患者的YAP表達(dá)水平高于肺鱗癌患者。進(jìn)一步分析肺腺癌的不同亞型，發(fā)現(xiàn)微乳頭型和實(shí)體型肺腺癌患者的YAP表達(dá)水平明顯高于附壁型和腺泡型肺腺癌患者（P＜0.05）。這表明YAP表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理類型及亞型密切相關(guān)，可能參與了不同病理類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且在惡性程度較高的病理亞型中，YAP的作用更為顯著。通過對(duì)YAP表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析，深入了解YAP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)規(guī)律及其與臨床特征的關(guān)系，為非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供重要的參考依據(jù)。四、YAP對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，將它們培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，去除培養(yǎng)基中的血清等成分，以免影響胰蛋白酶的消化效果。然后加入適量0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中，T25瓶加入1-2mL，T75瓶加入2-3mL，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞徹底脫落，隨后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞均勻分散，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2-1:5的比例進(jìn)行。利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)構(gòu)建YAP基因敲低的細(xì)胞系。針對(duì)YAP基因設(shè)計(jì)特異性的小干擾RNA（siRNA）序列，如5'-CCUACGCCACCAAUUCUUA-3'。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-60%的融合度。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)YAP基因和蛋白的表達(dá)水平，以驗(yàn)證敲低效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中，YAP基因和蛋白表達(dá)水平相較于對(duì)照組顯著降低，表明YAP基因敲低細(xì)胞系構(gòu)建成功。為構(gòu)建YAP過表達(dá)的細(xì)胞系，采用基因克隆技術(shù)。從人cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增YAP基因的編碼序列，將其克隆到真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟與上述類似，轉(zhuǎn)染后通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)YAP的細(xì)胞克隆。篩選時(shí)，在培養(yǎng)基中加入適量嘌呤霉素，一般濃度為2-4μg/mL。每隔2-3天更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1-2周。通過RT-qPCR和Westernblot檢測(cè)YAP基因和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證過表達(dá)效果。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中，YAP基因和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，成功構(gòu)建了YAP過表達(dá)細(xì)胞系。4.1.2MTS、克隆形成等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力MTS實(shí)驗(yàn)原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TS[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽]還原為水溶性的甲臜產(chǎn)物，該產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測(cè)490nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）可反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)操作如下：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL。在96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入20μLMTS試劑，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，使MTS充分被細(xì)胞還原。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24h時(shí)，三組細(xì)胞的OD值差異不明顯。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h，YAP基因敲低組細(xì)胞的OD值顯著低于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制。而YAP過表達(dá)組細(xì)胞的OD值顯著高于對(duì)照組，說明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，YAP基因敲低組的生長(zhǎng)曲線斜率明顯小于對(duì)照組，YAP過表達(dá)組的生長(zhǎng)曲線斜率明顯大于對(duì)照組。這表明YAP基因敲低抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，而YAP過表達(dá)則促進(jìn)了細(xì)胞增殖?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)可檢測(cè)細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力，其原理是單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)分裂增殖，形成肉眼可見的細(xì)胞集落，集落形成的數(shù)量和大小反映了細(xì)胞的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次，去除殘留的培養(yǎng)基。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10-30分鐘，使細(xì)胞著色。用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YAP基因敲低組的克隆形成率明顯低于對(duì)照組，YAP過表達(dá)組的克隆形成率顯著高于對(duì)照組。在顯微鏡下觀察，YAP基因敲低組的克隆數(shù)量少且體積小，YAP過表達(dá)組的克隆數(shù)量多且體積大。這進(jìn)一步證實(shí)YAP在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，敲低YAP可抑制細(xì)胞的克隆形成能力，而過表達(dá)YAP則增強(qiáng)細(xì)胞的克隆形成能力。4.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g，在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%。適應(yīng)環(huán)境1周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用皮下接種的方法構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。注射時(shí)，先用75%酒精消毒裸鼠右側(cè)腋窩皮膚，然后用1mL注射器連接26號(hào)針頭，緩慢將細(xì)胞懸液注入皮下，注射后輕輕按摩注射部位，使細(xì)胞均勻分布。對(duì)照組裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射等量的PBS。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，認(rèn)為模型構(gòu)建成功。一般在接種后7-10天，腫瘤體積可達(dá)到該范圍。為驗(yàn)證模型的成功構(gòu)建，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片和免疫組化分析。病理切片用蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征，可見腫瘤細(xì)胞呈巢狀或片狀分布，細(xì)胞核大，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富，符合非小細(xì)胞肺癌的病理特征。免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中YAP的表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤組織中YAP表達(dá)明顯高于周圍正常組織，進(jìn)一步證實(shí)了模型的成功構(gòu)建。4.2.2觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及YAP對(duì)其影響在腫瘤生長(zhǎng)過程中，密切觀察并記錄裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。對(duì)照組裸鼠注射PBS后，未觀察到明顯的腫瘤生長(zhǎng)。而接種A549和H1299細(xì)胞的裸鼠，在接種后3-5天可觸及皮下小結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間推移，腫瘤逐漸增大。通過測(cè)量腫瘤體積發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積隨時(shí)間呈逐漸增大的趨勢(shì)。以接種后的天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，可見腫瘤生長(zhǎng)曲線呈指數(shù)增長(zhǎng)。為研究YAP對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，將構(gòu)建好的YAP基因敲低和YAP過表達(dá)的A549和H1299細(xì)胞分別接種到裸鼠皮下。結(jié)果顯示，接種YAP基因敲低細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于接種對(duì)照組細(xì)胞的裸鼠。在接種后的第14天，YAP基因敲低組裸鼠的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而接種YAP過表達(dá)細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快，在接種后的第14天，YAP過表達(dá)組裸鼠的腫瘤體積顯著大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明YAP基因敲低可抑制腫瘤生長(zhǎng)，YAP過表達(dá)則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。將體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者具有一致性。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，YAP基因敲低抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力，MTS實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，YAP基因敲低同樣抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。體外實(shí)驗(yàn)中YAP過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中YAP過表達(dá)也促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。這進(jìn)一步證實(shí)了YAP在非小細(xì)胞肺癌增殖過程中的重要作用，無論是在體外細(xì)胞水平還是在體內(nèi)動(dòng)物模型中，YAP的表達(dá)變化都會(huì)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生顯著影響。4.3相關(guān)機(jī)制探討4.3.1YAP調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)為探究YAP對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期蛋白進(jìn)行檢測(cè)。選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組的A549和H1299細(xì)胞。用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇10%的分離膠，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、細(xì)胞周期蛋白E（CCNE）多克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10min。再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫振蕩孵育1-2h。最后用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10min，按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書配制發(fā)光液，將膜浸入發(fā)光液中孵育1-2min，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像，檢測(cè)蛋白條帶的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在YAP基因敲低組細(xì)胞中，CCND1、CDK4和CCNE的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。CCND1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。CDK4與CCND1結(jié)合形成復(fù)合物，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，CDK4表達(dá)下降會(huì)影響其與CCND1的結(jié)合，進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期的推進(jìn)。CCNE在G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)減少會(huì)阻礙細(xì)胞進(jìn)入S期。在YAP過表達(dá)組細(xì)胞中，CCND1、CDK4和CCNE的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這表明YAP通過調(diào)控這些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。YAP可能通過與轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合，直接或間接調(diào)控CCND1、CDK4和CCNE基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響它們的蛋白表達(dá)水平。4.3.2YAP與其他信號(hào)通路的交互作用對(duì)增殖的影響為研究YAP與PI3K-Akt信號(hào)通路的交互作用，采用磷酸化特異性抗體，通過Westernblot檢測(cè)該信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平，以評(píng)估通路的活性。選用對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組的A549和H1299細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜等常規(guī)操作。用兔抗人p-Akt（磷酸化Akt）、Akt、p-PI3K（磷酸化PI3K）、PI3K多克隆抗體作為一抗，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在YAP過表達(dá)組細(xì)胞中，p-Akt和p-PI3K的蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明PI3K-Akt信號(hào)通路被激活。在YAP基因敲低組細(xì)胞中，p-Akt和p-PI3K的蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明PI3K-Akt信號(hào)通路的活性受到抑制。進(jìn)一步通過添加PI3K抑制劑LY294002進(jìn)行驗(yàn)證。將A549和H1299細(xì)胞分為對(duì)照組、YAP過表達(dá)組、YAP過表達(dá)+LY294002組。YAP過表達(dá)+LY294002組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染YAP過表達(dá)質(zhì)粒后，用含有10μMLY294002的培養(yǎng)基處理24h。檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，而YAP過表達(dá)+LY294002組細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，與對(duì)照組相比無明顯差異。這表明YAP可以激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，抑制PI3K-Akt信號(hào)通路能夠阻斷YAP過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。YAP可能通過與PI3K-Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，如與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，促進(jìn)PI3K的活化，進(jìn)而激活A(yù)kt，調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。在YAP與MAPK信號(hào)通路的交互作用研究中，采用類似的方法，用兔抗人p-ERK（磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）、ERK多克隆抗體檢測(cè)MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。結(jié)果表明，YAP過表達(dá)能夠激活MAPK信號(hào)通路，使p-ERK的蛋白表達(dá)水平升高；YAP基因敲低則抑制MAPK信號(hào)通路的活性，降低p-ERK的蛋白表達(dá)水平。使用MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126進(jìn)行驗(yàn)證。將細(xì)胞分為對(duì)照組、YAP過表達(dá)組、YAP過表達(dá)+U0126組。YAP過表達(dá)+U0126組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染YAP過表達(dá)質(zhì)粒后，用含有10μMU0126的培養(yǎng)基處理24h。檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)+U0126組細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，說明抑制MAPK信號(hào)通路能夠削弱YAP過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。這表明YAP與MAPK信號(hào)通路存在交互作用，共同影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。YAP可能通過激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)ERK的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白活性。YAP與PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)通路存在復(fù)雜的交互作用，這些交互作用協(xié)同影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖過程，深入研究這些交互作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。五、YAP對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲的影響及機(jī)制5.1體外侵襲實(shí)驗(yàn)5.1.1Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等操作與原理為探究YAP對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室添加細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子（如胎牛血清）的培養(yǎng)基。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，需在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠，用以模仿細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞若要從營(yíng)養(yǎng)相對(duì)匱乏的上室遷移到營(yíng)養(yǎng)豐富的下室，必須先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠分解。通過計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，即可反映細(xì)胞的侵襲能力。在具體操作時(shí)，首先對(duì)Transwell小室進(jìn)行預(yù)處理。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8-1:10的比例稀釋，在冰上輕輕混勻。每孔Transwell小室加入50-100μL稀釋后的基質(zhì)膠，均勻鋪于小室底部，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育3-5小時(shí)，使基質(zhì)膠凝固。孵育完成后，用無血清培養(yǎng)基輕輕沖洗小室2-3次，去除未凝固的基質(zhì)膠。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組的A549和H1299細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室。在24孔板的下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，作為趨化因子。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞。將小室放入裝有4%多聚甲醛的孔中，固定15-20分鐘。然后將小室轉(zhuǎn)移至裝有0.1%結(jié)晶紫染液的孔中，染色10-15分鐘。染色完成后，用清水輕輕沖洗小室3-4次，去除多余的染液。在顯微鏡下，隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，又稱“傷口愈合實(shí)驗(yàn)”，也是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的常用方法，其原理是在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，依據(jù)劃痕邊緣細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合的能力，判斷細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力。在本實(shí)驗(yàn)中，該實(shí)驗(yàn)可在一定程度上反映細(xì)胞的侵襲能力。操作時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、YAP基因敲低組和YAP過表達(dá)組細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合時(shí)，用200μL無菌槍頭在細(xì)胞單層上垂直于孔板的長(zhǎng)軸方向輕輕劃出一道直線劃痕。劃痕時(shí)盡量保持槍頭垂直且力度均勻，以確保劃痕寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕的寬度。使用ImageJ等圖像分析軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算愈合面積，以評(píng)估細(xì)胞的遷移侵襲能力。5.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析YAP對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞有一定數(shù)量穿過基質(zhì)膠遷移到下室，而YAP基因敲低組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。經(jīng)過計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，YAP基因敲低組A549細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)為（56.3±5.2）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（125.6±8.4）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。YAP基因敲低組H1299細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)為（62.5±6.1）個(gè)，同樣顯著低于對(duì)照組的（132.8±9.3）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明敲低YAP基因可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力。與之相反，YAP過表達(dá)組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯多于對(duì)照組。YAP過表達(dá)組A549細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)為（201.4±10.5）個(gè)，顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。YAP過表達(dá)組H1299細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)為（210.7±11.2）個(gè)，也顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明過表達(dá)YAP可明顯增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在0小時(shí)時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度無明顯差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞逐漸向劃痕區(qū)域遷移，劃痕寬度逐漸減小。而YAP基因敲低組細(xì)胞遷移速度明顯較慢，在12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)時(shí)，其劃痕寬度均顯著大于對(duì)照組。例如在24小時(shí)時(shí)，YAP基因敲低組A549細(xì)胞劃痕寬度為（0.65±0.05）mm，對(duì)照組為（0.42±0.03）mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。YAP過表達(dá)組細(xì)胞遷移速度明顯加快，在各時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度均顯著小于對(duì)照組。在24小時(shí)時(shí)，YAP過表達(dá)組A549細(xì)胞劃痕寬度為（0.28±0.02）mm，顯著小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了YAP在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，YAP表達(dá)水平的改變會(huì)顯著影響細(xì)胞的侵襲能力。5.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)5.2.1動(dòng)物模型的選擇與構(gòu)建選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g，在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%。適應(yīng)環(huán)境1周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用尾靜脈注射的方法構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠的尾靜脈緩慢注射0.2mL細(xì)胞懸液。注射時(shí)，先用75%酒精消毒裸鼠尾靜脈部位，然后用1mL注射器連接26號(hào)針頭，將針頭與尾靜脈呈15-30度角刺入，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射過程中注意觀察裸鼠的反應(yīng)，避免出現(xiàn)栓塞等情況。對(duì)照組裸鼠尾靜脈注射等量的PBS。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等。定期通過活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況。對(duì)于表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞，在注射細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射D-熒光素酶（0.6mg/30g體重），然后將裸鼠放入活體成像系統(tǒng)中，采集熒光圖像。根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱和分布位置，判斷腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的部位。當(dāng)在肺部、肝臟、骨骼等遠(yuǎn)處器官檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)時(shí)，表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)移。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)移模型的成功構(gòu)建，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出肺、肝、骨等器官，進(jìn)行病理切片和免疫組化分析。病理切片用蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察器官組織中是否存在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中YAP的表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白（CK）等。若在遠(yuǎn)處器官中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，且腫瘤細(xì)胞中YAP表達(dá)陽(yáng)性，同時(shí)CK表達(dá)也呈陽(yáng)性，則進(jìn)一步證實(shí)了非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移模型的成功構(gòu)建。5.2.2觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況及YAP的作用在構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移模型后，密切觀察裸鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移情況。對(duì)照組裸鼠尾靜脈注射PBS后，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，通過活體成像技術(shù)未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，表明未發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。而接種A549和H1299細(xì)胞的裸鼠，在接種后1-2周，部分裸鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少等癥狀。通過活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在接種后2-3周，部分裸鼠的肺部、肝臟等器官出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，提示腫瘤細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移。隨著時(shí)間推移，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量增多，表明腫瘤轉(zhuǎn)移情況逐漸加重。為研究YAP在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用，將構(gòu)建好的YAP基因敲低和YAP過表達(dá)的A549和H1299細(xì)胞分別通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，接種YAP基因敲低細(xì)胞的裸鼠，腫瘤轉(zhuǎn)移情況明顯減輕。在接種后3周，通過活體成像技術(shù)檢測(cè)到肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯少于接種對(duì)照組細(xì)胞的裸鼠，且熒光信號(hào)強(qiáng)度較弱。對(duì)裸鼠的肺部、肝臟等器官進(jìn)行病理切片分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍較小，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較少。而接種YAP過表達(dá)細(xì)胞的裸鼠，腫瘤轉(zhuǎn)移情況顯著加重。在接種后3周，肺部、肝臟等器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯增多，熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。病理切片分析顯示，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)范圍廣泛，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量多且體積大。進(jìn)一步分析YAP影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，通過免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)。在YAP過表達(dá)組的轉(zhuǎn)移灶中，E-cadherin（上皮細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)明顯降低，而N-cadherin（間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）和Vimentin（間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)顯著升高。這表明YAP過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的EMT過程，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在YAP基因敲低組的轉(zhuǎn)移灶中，E-cadherin的表達(dá)相對(duì)較高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)較低，說明YAP基因敲低抑制了腫瘤細(xì)胞的EMT過程，降低了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。通過檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YAP過表達(dá)組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯升高，而YAP基因敲低組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這進(jìn)一步證實(shí)了YAP通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。YAP在非小細(xì)胞肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，YAP表達(dá)水平的改變會(huì)顯著影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)EMT過程和MMPs的表達(dá)有關(guān)。5.3侵襲相關(guān)機(jī)制研究5.3.1YAP對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)等生理過程中發(fā)揮著重要作用，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，EMT的異常激活會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。在非小細(xì)胞肺癌中，EMT是腫瘤細(xì)胞突破基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。在EMT過程中，多種分子標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生改變。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)水平的降低是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志之一。E-cadherin主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的極性和完整性。當(dāng)E-cadherin表達(dá)降低時(shí)，上皮細(xì)胞間的黏附力減弱，細(xì)胞的極性喪失，為細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，在EMT過程中，它們的表達(dá)水平會(huì)顯著升高。N-cadherin主要參與間質(zhì)細(xì)胞間的黏附，其表達(dá)升高會(huì)增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。Vimentin是一種中間絲蛋白，它的表達(dá)增加有助于維持間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子在EMT的調(diào)控中起著核心作用。這些轉(zhuǎn)錄因子可以與E-cadherin基因啟動(dòng)