第十章有機高分子基質(zhì)的填料第1頁，共38頁。優(yōu)選第十章有機高分子基質(zhì)的填料第2頁，共38頁。HPLC方法的主要特點分離效率高，選擇性好，適于各種多元組分復(fù)雜化合物的分離;應(yīng)用范圍廣：無機物—有機物，天然物質(zhì)—合成產(chǎn)物，小分子---大分子，一般化合物到生物活性物質(zhì);分離機理各異，色譜柱、淋洗體系和操作參數(shù)選擇廣泛;分離純化+分析檢測;樣品量從痕量到大規(guī)模制備，實現(xiàn)在線監(jiān)測和自動化操作。第3頁，共38頁。HPLC的關(guān)鍵設(shè)備專用的高壓輸液系統(tǒng);高靈敏檢測系統(tǒng);高效分離柱其中分離柱是色譜的中心,是最為關(guān)鍵的部分第4頁，共38頁。與經(jīng)典色譜的比較第5頁，共38頁。第6頁，共38頁。HPLC分離填料：有機基質(zhì)多糖型凝膠高聚物樹脂無機基質(zhì)硅膠氧化鋯氧化鋁多孔玻璃羥基磷灰石石墨化碳黑基質(zhì)微球——天然多糖或合成單體或交聯(lián)劑負(fù)載樣品的能力強，色譜容量高耐酸堿、具化學(xué)穩(wěn)定性，柱壽命長，易再生不易產(chǎn)生非特異性吸附作用第7頁，共38頁。一、HPLC色譜柱的關(guān)鍵在于填料物理結(jié)構(gòu)→色譜動力學(xué)（粒度與粒度分布、孔徑與孔徑分布、顆粒強度和表觀形態(tài)→柱效率、穿透性）化學(xué)結(jié)構(gòu)→色譜熱力學(xué)（連接在基質(zhì)上的官能團(tuán)或鏈段→樣品保留值、選擇性）第8頁，共38頁。1、HPLC色譜柱填料在物理結(jié)構(gòu)上的要求:顆粒大小合適，粒度分布較窄;顆粒強度適應(yīng)高速高壓操作;多孔型的填料孔徑大小和孔徑分布適宜,避免復(fù)雜的微孔結(jié)構(gòu);一定的溶脹及收縮水平。第9頁，共38頁。常見的液相色譜填料類型多孔型非多孔型薄殼型分：小孔（<10nm）、中孔（10-30nm）、大孔（>30nm）和超大孔（>100nm），應(yīng)用占主導(dǎo)地位整體顆粒無孔顆粒表面層多孔，內(nèi)部無孔。以合成樹脂為基質(zhì)的產(chǎn)品，顆粒在10μm左右以合成樹脂為基質(zhì)的產(chǎn)品，顆粒<7μm以多糖凝膠為基質(zhì)的產(chǎn)品，顆粒都>20μm左右同左第10頁，共38頁。目前的主要發(fā)展方向(研究熱點):顆粒單分散的填料;貫穿性超大孔結(jié)構(gòu)的填料;小顆粒的非多孔填料。第11頁，共38頁。2、HPLC色譜柱填料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的要求特定的選擇性;良好的化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性;避免不可逆吸附。不同填料的化學(xué)結(jié)構(gòu)是通過對基質(zhì)材料的化學(xué)改性而實現(xiàn)的。第12頁，共38頁。離子交換色譜填料顆粒表面攜帶季銨基、DEAE基、磺酸基、羧基等強弱陰陽離子集團(tuán)。反相色譜填料C18、C8烷基等疏水性集團(tuán)正相色譜填料羥基、氨基、氰基等弱疏水性集團(tuán)親和色譜填料蛋白質(zhì)、抗體、激素、抗菌素、酶等具有生物特異性的配基第13頁，共38頁。二、有機高分子類型的HPLC填料基質(zhì)樹脂

基質(zhì)材料決定填料物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu):顆粒大小與分布,顆粒強度,孔徑大小,孔結(jié)構(gòu)形態(tài),顆粒內(nèi)部的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性,直接影響對顆粒的表面(包括內(nèi)孔表面)的化學(xué)修飾。

可分為:多糖型聚合物型第14頁，共38頁。（一）多糖型基質(zhì)材料1.葡聚糖系:高交聯(lián)的羥丙基化葡聚糖,其顆粒剛性好,粒度小而且分布范圍窄（10~23μm）;SephasorbHPUitrafine用于中低壓色譜和高效色譜烯丙基葡聚糖與N,N`-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)共聚而成的凝膠。Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)屬于高效凝膠，較高流速下使用第15頁，共38頁。2.瓊脂糖系:Sepharose與2,3-二溴丙醇反應(yīng)生成瓊脂糖凝膠

SepharoseCL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶聯(lián)瓊脂糖凝膠SepharoseFastFlow(Sepharose6FF,Sepharose4FF)高效瓊脂糖凝膠SepharosehighPerformanceSuperdax(葡聚糖與交聯(lián)瓊脂糖的結(jié)合)：快流速Superose(珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián))：高效凝膠第16頁，共38頁。（二）聚合物型基質(zhì)材料交聯(lián)聚苯乙烯樹脂:

苯乙烯與二乙烯苯的交聯(lián)共聚物(PS-DVB)，是應(yīng)用最為廣泛的一類基質(zhì)樹脂。交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂:

以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羥基乙酯、環(huán)氧丙酯等化合物為單體制備的交聯(lián)高聚物。第17頁，共38頁。三、填料性能評價填料的物化性質(zhì)指標(biāo)填料的色譜性能表征第18頁，共38頁。1、物化性質(zhì)指標(biāo):a.顆粒大小及其分布(dp);b.比表面積S(m2/g)；c.骨架密度ρg(g/ml)、溶劑吸收量Sr(ml/g)、溶脹因子f;d.比孔體積Vp(ml/g);e.孔度Ψ；f.孔徑大小及分布；g.化學(xué)結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)。第19頁，共38頁。2、色譜性能表征:保留值：保留時間(TR),保留體積(VR),容量因子(K`)選擇性：相鄰二物質(zhì)保留時間之比,與固定相、流動相及溫度有關(guān)。柱效率：理論塔板數(shù)(N)，或理論塔板高度(H)表示。填充柱的總空隙度和穿透性：分離度(R)：相鄰兩色譜峰的保留值之差與各自峰底寬度一半之和的比值。第20頁，共38頁。四、反相HPLC高分子填料

ReversedPhaseChromatography,RPC

反相色譜（原理參照P237）：非極性固定相，極性流動相，強極性組分先洗脫出來。

1.目前RPC分離柱以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主，特別是鍵合C18，C8烷基以及苯基填料。特點：傳質(zhì)快，剛性好，柱效高，選擇性好。不足：pH2~8，容易使蛋白質(zhì)失活（殘留的硅羥基）第21頁，共38頁。廣泛使用的是微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹脂，另有帶C18烷基側(cè)鏈的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，C18烷基鍵合的聚乙烯醇。優(yōu)點：pH范圍較廣，表面有較強的疏水性第22頁，共38頁。主要廠家日本：東洋-曹達(dá)Tosoh----TSK瑞士：Hamilton,漢密爾頓,英國：高聚物實驗室PolymerLab美國：Bio-Rad伯樂瑞典：安捷倫Agilent詳見：P194表10－1第23頁，共38頁。被分離樣品的分子量大小與填料的孔徑選擇

如PLRP－S填料：孔徑＝10nm，適于分離15－20個氨基酸長度的肽類；孔徑＝30nm，適于分離中等分子量的球形蛋白質(zhì)；孔徑＝100nm，適于分離較大的球形蛋白質(zhì)或纖維狀結(jié)構(gòu)的化合物；孔徑＝400nm，適于分離很大分子量的蛋白質(zhì)。

第24頁，共38頁。三氟乙酸(TFA)第25頁，共38頁。第26頁，共38頁。第27頁，共38頁。在IEC中,高分子類型填料表現(xiàn)更大的優(yōu)越性。大致有3類：多糖基質(zhì)的離子交換層析介質(zhì)聚合物基質(zhì)的高效離子交換色譜填料高聚物型離子交換色譜填料五、離子交換HPLC填料

IonexchangechromatographyIEC第28頁，共38頁。1.多糖基質(zhì)的離子交換層析介質(zhì)傳統(tǒng)的多糖類軟質(zhì)凝膠制得強弱陰陽離子交換介質(zhì)：具有很好親水性和生物相容性；高交聯(lián)度多糖類凝膠填料：還適于較高壓力和流速下操作。第29頁，共38頁。第30頁，共38頁。2.聚合物基質(zhì)的高效離子交換色譜填料交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯苯聚甲基丙烯酸酯;4-乙烯吡啶共聚物特點：高交聯(lián)大孔結(jié)構(gòu),良好的剛性

和小而均勻的粒度第31頁，共38頁。a.多孔樹脂的IEC填料:柱效、穿透性、分離度、負(fù)載量、回收率的性能優(yōu)異MonoBeads系列：包括MonoQ,MonoS,MonoPSOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S貫流色譜填料POROS系列羥基化聚醚凝膠：如TSKgelDEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等交聯(lián)聚甲基丙烯酸羥基乙酯:親水,大孔第32頁，共38頁。b.非多孔樹脂的IEC填料:羥基化聚醚,交聯(lián)聚苯乙烯,交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯,交聯(lián)瓊脂糖等。優(yōu)點:顆粒小,均勻,剛性好,色譜穿透性強,流速適應(yīng)范圍寬。避免了固相內(nèi)的吸附與擴散，因此具有高柱效,高分離度和高樣品回收率的特點。第33頁，共38頁。c.薄殼型樹脂的IEC填料:優(yōu)點:柱效高,選擇性好,分離度高,穿透性好,回收高,流速快等第34頁，共38頁。六、有機高分子類型的疏水HPLC填料

Hydrophobicinteractionchromatography,HICHIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)與填料表面之間產(chǎn)生弱的疏水性相互作用。高濃度鹽條件下,蛋白質(zhì)與疏水固定相的吸附能力高,隨著鹽濃度的下降,吸附能力下降。當(dāng)淋洗液離子強度逐漸降低時,蛋白質(zhì)樣品按其疏水性的不同依次被洗脫。第35頁，共38頁。常見淋洗液有(NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl,磷酸鹽等,其中(NH4)2SO4是最廣泛應(yīng)用的。

第36頁，共38頁。疏水色譜