菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測(cè)定第1頁，共41頁。菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測(cè)定第2頁，共41頁。主要內(nèi)容菌落總數(shù)測(cè)定大腸菌群測(cè)定MPN法原理（拓展內(nèi)容）第3頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定掌握菌落總數(shù)測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)原理 不同稀釋度的樣品，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)第4頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定器材與試劑：樣品，無菌生理鹽水，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿第5頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定第6頁，共41頁。傾注培養(yǎng)第7頁，共41頁。培養(yǎng)結(jié)果第8頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

5.菌落計(jì)數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記必要時(shí)分區(qū)計(jì)數(shù)，菌落成片者作廢計(jì)算方法某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個(gè)稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)第9頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定計(jì)算方法：（2）有兩個(gè)稀釋度在30-300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結(jié)果單位：CFU/ml（g）第10頁，共41頁。菌落總數(shù)測(cè)定注意事項(xiàng)：

1.無菌操作

2.標(biāo)記

3.何時(shí)更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

6.安全常識(shí)第11頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理

36℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法：初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯

1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管第12頁，共41頁。初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球第13頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟：

1.初發(fā)酵

第14頁，共41頁。第15頁，共41頁。第16頁，共41頁。吸取樣品方法第17頁，共41頁。加注樣品第18頁，共41頁。初發(fā)酵結(jié)果右邊為陽性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。第19頁，共41頁。實(shí)驗(yàn)步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取產(chǎn)氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)：36℃，48h

（4）觀察指標(biāo)：若產(chǎn)氣則報(bào)告大腸菌群陽性。第20頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍(lán)平板：

45℃，無菌，傾注，15ml

（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍(lán)平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)：36℃，48h第21頁，共41頁。分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基第22頁，共41頁。分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第23頁，共41頁。分區(qū)劃線法操作要點(diǎn)

1.劃下一個(gè)區(qū)前必須滅菌接種環(huán)

2.劃線時(shí)接種環(huán)同平板呈30-40°角

3.每次劃線應(yīng)該壓到上一個(gè)區(qū)域的2-3條線

4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動(dòng)第24頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

2.分離培養(yǎng)：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落第25頁，共41頁。革蘭染色法器材與試劑結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙第26頁，共41頁。革蘭染色法涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：通過火焰若干次初染：結(jié)晶紫一滴，1min，水洗媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，30s或至無色為止復(fù)染：復(fù)紅一滴，30s第27頁，共41頁。涂片第28頁，共41頁。熱固定第29頁，共41頁。初染第30頁，共41頁。媒染第31頁，共41頁。脫色第32頁，共41頁。復(fù)染第33頁，共41頁。革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法第34頁，共41頁。復(fù)發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時(shí)后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管第35頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個(gè)（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（3）培養(yǎng)：37℃，24h

（4）觀察指標(biāo)：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣第36頁，共41頁。液體接種第37頁，共41頁。復(fù)發(fā)酵復(fù)發(fā)酵陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生第38頁，共41頁。大腸菌群數(shù)測(cè)定注意事項(xiàng)：

1.無菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養(yǎng)

5.液體接種第39頁，共