創(chuàng)傷性腦外傷大鼠海馬中TDP-43與PGRN蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景與意義創(chuàng)傷性腦外傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是一種因外力作用于頭部而導(dǎo)致腦組織損傷的常見(jiàn)疾病，其常見(jiàn)原因包括車(chē)禍、摔倒、撞擊、毆打、槍擊等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有超一半人口在一生中會(huì)發(fā)生一次甚至多次TBI，而每年就有超5000萬(wàn)人口發(fā)生TBI，中國(guó)TBI患者死亡率為13/10萬(wàn)人口。盡管近年來(lái)隨著交通安全管制加強(qiáng)、生產(chǎn)安全培訓(xùn)普及以及人們安全意識(shí)的提高，TBI發(fā)病率有所下降，但由于病情進(jìn)展迅速、病理生理反應(yīng)復(fù)雜，中樞神經(jīng)系統(tǒng)常出現(xiàn)不可逆性損傷，仍有超30%的顱腦損傷患者死于繼發(fā)性二次損傷，致殘率、致死率高。TBI不僅嚴(yán)重威脅患者的生命健康，還給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。TBI后的病理生理過(guò)程極為復(fù)雜，包括原發(fā)性腦損傷及繼發(fā)性腦損傷。原發(fā)性損傷是頭部遭受外力直接或間接的壓迫、剪切、拉伸及扭轉(zhuǎn)作用產(chǎn)生的損害；繼發(fā)性損傷則是在創(chuàng)傷發(fā)生后，損傷腦組織出現(xiàn)線粒體功能障礙、自由基損傷、鈣超載、炎癥和興奮性毒性等繼發(fā)性事件，對(duì)周?chē)X組織形成二次損傷。在TBI后的神經(jīng)病理變化中，一些蛋白的表達(dá)改變發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中TDP-43和PGRN蛋白備受關(guān)注。TARDNA結(jié)合蛋白43（TDP-43）是一種高度保守、廣泛表達(dá)的核蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為43×103。在正常生理狀態(tài)下，TDP-43主要定位于細(xì)胞核，參與多種生物學(xué)過(guò)程，如RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、運(yùn)輸、翻譯和周轉(zhuǎn)等。然而，在多種神經(jīng)退行性疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥（AmyotrophicLateralSclerosis，ALS）、額顳葉變性（FrontotemporalLobarDegeneration，F(xiàn)TLD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimerDisease，AD）中，TDP-43會(huì)發(fā)生異常的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，錯(cuò)誤定位到細(xì)胞質(zhì)中，并形成聚集物，成為這些疾病的重要病理學(xué)標(biāo)記蛋白。在TBI的病理過(guò)程中，TDP-43也出現(xiàn)了異常表達(dá)，研究其在TBI后的表達(dá)變化規(guī)律，對(duì)于揭示TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制具有重要意義。顆粒前體蛋白（Progranulin，PGRN）是一種分泌型糖蛋白，由593個(gè)氨基酸組成，包含7.5個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。PGRN在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，參與神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、炎癥調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程。在神經(jīng)退行性疾病研究中發(fā)現(xiàn)，PGRN基因的突變與額顳葉癡呆等疾病相關(guān)，并且PGRN蛋白水平的改變也與神經(jīng)退行性病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在TBI的病理背景下，PGRN蛋白表達(dá)同樣出現(xiàn)異常，研究其表達(dá)變化對(duì)于理解TBI后的神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)退行性變的關(guān)系至關(guān)重要。本研究通過(guò)建立創(chuàng)傷性腦外傷大鼠模型，觀察海馬中TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化，旨在探討頭部創(chuàng)傷與神經(jīng)變性疾病間的關(guān)系，為頭部外傷后早期預(yù)防神經(jīng)退行性病變的發(fā)生提供理論依據(jù)和潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，具有重要的理論和臨床實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于TDP-43在TBI中的研究起步較早。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在TBI模型建立后，TDP-43會(huì)出現(xiàn)從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位，且其異常聚集與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和神經(jīng)功能的缺損密切相關(guān)。例如，[具體文獻(xiàn)1]通過(guò)對(duì)小鼠TBI模型的研究發(fā)現(xiàn)，傷后數(shù)小時(shí)，即可觀察到TDP-43在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增加，并且隨著時(shí)間的推移，其聚集程度逐漸加重，同時(shí)伴有海馬區(qū)神經(jīng)元的大量死亡，以及小鼠認(rèn)知和記憶功能的明顯下降。在臨床研究方面，對(duì)TBI患者的尸檢結(jié)果顯示，在損傷腦組織中，TDP-43陽(yáng)性的包涵體大量出現(xiàn)，這些包涵體的存在與患者的神經(jīng)退行性病變進(jìn)程相關(guān)，提示TDP-43可能作為T(mén)BI后神經(jīng)退行性變的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。國(guó)外對(duì)于PGRN在TBI中的研究也取得了一定成果。研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在TBI后的神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在TBI動(dòng)物模型中，損傷早期PGRN的表達(dá)會(huì)明顯降低，隨后逐漸升高。如[具體文獻(xiàn)2]研究指出，PGRN基因敲除小鼠在遭受TBI后，神經(jīng)功能恢復(fù)明顯延遲，炎癥反應(yīng)加劇，表明PGRN對(duì)于減輕TBI后的炎癥損傷和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)至關(guān)重要。臨床研究中，通過(guò)檢測(cè)TBI患者腦脊液和血清中的PGRN水平，發(fā)現(xiàn)其含量變化與患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)，低水平的PGRN往往預(yù)示著較差的預(yù)后。國(guó)內(nèi)學(xué)者也在積極開(kāi)展相關(guān)研究。在TDP-43的研究方面，通過(guò)建立大鼠TBI模型，深入探討了TDP-43表達(dá)變化的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，TBI后miR-[X]等非編碼RNA的表達(dá)改變，可能通過(guò)調(diào)控TDP-43的mRNA穩(wěn)定性，影響其蛋白表達(dá)水平，為T(mén)BI的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。在臨床研究中，對(duì)TBI患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，觀察到TDP-43表達(dá)異常的患者，更易出現(xiàn)慢性創(chuàng)傷性腦病等神經(jīng)退行性疾病，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了TDP-43在TBI與神經(jīng)退行性疾病關(guān)聯(lián)中的重要地位。國(guó)內(nèi)關(guān)于PGRN在TBI中的研究也有獨(dú)特發(fā)現(xiàn)。通過(guò)對(duì)TBI大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，PGRN可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。臨床研究中，部分學(xué)者嘗試將PGRN作為生物標(biāo)志物，用于早期評(píng)估TBI患者的病情，發(fā)現(xiàn)其與患者的格拉斯哥昏迷評(píng)分等臨床指標(biāo)具有相關(guān)性，有望為T(mén)BI的早期診斷和治療決策提供參考。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在TDP-43和PGRN與TBI的研究方面取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處。目前對(duì)于TDP-43和PGRN在TBI病理過(guò)程中的相互作用機(jī)制研究較少，兩者之間是否存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系尚不明確。大多數(shù)研究集中在損傷后的急性期，對(duì)于TBI慢性期TDP-43和PGRN表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及長(zhǎng)期影響研究不足。此外，雖然已明確兩者與TBI后神經(jīng)退行性變相關(guān)，但如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，仍有待進(jìn)一步探索。本研究將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，通過(guò)建立大鼠TBI模型，系統(tǒng)觀察海馬中TDP-43及PGRN蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，深入探討兩者之間的相互關(guān)系，為揭示TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制，以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過(guò)建立創(chuàng)傷性腦外傷大鼠模型，深入探究海馬中TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化規(guī)律，明確其在TBI病理過(guò)程中的作用和意義，并探討兩者之間的相互關(guān)系，為揭示TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立與分組：選用健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和TBI模型組。利用改進(jìn)的Feeney自由落體裝置對(duì)TBI模型組大鼠進(jìn)行打擊致傷，正常對(duì)照組大鼠僅進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備但不予打擊。兩組再分別按照傷后1天、3天、7天、14天、28天這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)分為5個(gè)亞組。通過(guò)該模型建立，模擬人類(lèi)創(chuàng)傷性腦外傷的病理過(guò)程，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。標(biāo)本采集與組織切片制備：在預(yù)定的5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，將大鼠處死并進(jìn)行灌注取腦組織。通過(guò)一系列處理，制作石蠟切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的病理改變，直觀了解TBI對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)的影響，為蛋白表達(dá)研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)蛋白表達(dá)：運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，觀察海馬神經(jīng)元中TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)、不同組別的蛋白表達(dá)進(jìn)行定性和定量分析，明確TDP-43及PGRN蛋白在TBI后不同階段的表達(dá)變化規(guī)律，為探討其在TBI病理過(guò)程中的作用提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)果分析與討論：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較正常對(duì)照組和TBI模型組在不同時(shí)間點(diǎn)TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的差異，以及TBI模型組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異。深入討論TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)變化的意義，分析其與TBI病理過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)修復(fù)等事件的關(guān)聯(lián)，探討兩者之間可能存在的相互作用機(jī)制，為T(mén)BI的臨床治療和藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重250-300g，月齡為8-10周。大鼠購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。選擇SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要是因?yàn)槠渚哂羞z傳背景清楚、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件反應(yīng)一致性好、繁殖能力強(qiáng)、成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，尤其是在創(chuàng)傷性腦損傷模型構(gòu)建方面，SD大鼠的生理特征和對(duì)損傷的反應(yīng)與人類(lèi)具有一定的相似性，能夠較好地模擬人類(lèi)TBI后的病理生理過(guò)程。大鼠在實(shí)驗(yàn)前于[動(dòng)物房具體環(huán)境條件，如溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗周期]的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，減少實(shí)驗(yàn)誤差。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑免疫組化相關(guān)試劑：兔抗大鼠TDP-43多克隆抗體（購(gòu)自[抗體供應(yīng)商1名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)1]），用于特異性識(shí)別大鼠組織中的TDP-43蛋白；兔抗大鼠PGRN多克隆抗體（購(gòu)自[抗體供應(yīng)商2名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)2]），用于特異性識(shí)別大鼠組織中的PGRN蛋白；生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購(gòu)自[二抗供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)3]），與一抗結(jié)合，用于后續(xù)的顯色反應(yīng)；鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）試劑盒（購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)4]），利用其放大信號(hào)的作用，增強(qiáng)免疫組化染色效果；DAB顯色試劑盒（購(gòu)自[顯色劑供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)5]），在過(guò)氧化物酶的作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，使陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕色，便于觀察和分析。染色試劑：蘇木精染液（購(gòu)自[蘇木精供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)6]），用于細(xì)胞核染色，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，與伊紅染液配合，可清晰顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；伊紅染液（購(gòu)自[伊紅供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)7]），用于細(xì)胞質(zhì)染色，使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，與蘇木精染液共同構(gòu)成HE染色，是組織學(xué)中常用的染色方法；0.3%過(guò)氧化氫溶液（由30%過(guò)氧化氫溶液用蒸餾水稀釋而成），用于消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免其對(duì)免疫組化染色結(jié)果產(chǎn)生干擾；5%正常山羊血清（購(gòu)自[血清供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)8]），用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。其他試劑：多聚甲醛（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商3名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)9]），用于組織固定，使組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定；二甲苯（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商4名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)10]），用于石蠟切片的脫蠟和透明；梯度酒精（包括100%、95%、85%、75%酒精，均購(gòu)自[試劑供應(yīng)商5名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)11-14]），用于組織的脫水和透明，以及切片的水化；PBS緩沖液（pH7.4，自行配制或購(gòu)自[緩沖液供應(yīng)商名稱(chēng)]，貨號(hào)[具體貨號(hào)15]），用于洗滌組織切片和稀釋試劑，維持實(shí)驗(yàn)體系的pH穩(wěn)定。2.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器石蠟切片制作儀器：輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（品牌[切片機(jī)品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)1]），用于將石蠟包埋的組織切成薄片，厚度可精確控制，滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)切片厚度的要求；石蠟包埋機(jī)（品牌[包埋機(jī)品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)2]），將組織塊用石蠟進(jìn)行包埋，使組織得以支撐，便于后續(xù)切片；攤片機(jī)（品牌[攤片機(jī)品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)3]），用于將切好的組織切片展平，以便于貼片；烤片機(jī)（品牌[烤片機(jī)品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)4]），將貼好的切片進(jìn)行烘烤，使切片牢固附著在載玻片上。染色儀器：染色缸（普通玻璃染色缸，規(guī)格[具體規(guī)格1]），用于盛放各種染色試劑，進(jìn)行組織切片的染色；搖床（品牌[搖床品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)5]），在免疫組化染色過(guò)程中，用于振蕩切片，使試劑與組織充分接觸，提高染色效果；微量移液器（品牌[移液器品牌1]，量程[具體量程1-n]），用于準(zhǔn)確吸取和添加各種試劑，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。圖像分析儀器：光學(xué)顯微鏡（品牌[顯微鏡品牌1]，型號(hào)[具體型號(hào)6]），用于觀察組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫組化染色結(jié)果，配備有拍照功能，可采集圖像；圖像分析軟件（如Image-ProPlus軟件），用于對(duì)采集的圖像進(jìn)行分析，測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的面積、光密度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的定量分析。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理2.2.1分組方式將60只健康雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和TBI模型組，每組30只。正常對(duì)照組大鼠不進(jìn)行創(chuàng)傷性腦損傷造模，僅接受相同的實(shí)驗(yàn)操作但不進(jìn)行打擊，作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照，用于對(duì)比TBI模型組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確TBI對(duì)大鼠海馬中TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的影響。TBI模型組大鼠采用改進(jìn)的Feeney自由落體裝置致傷，以模擬創(chuàng)傷性腦外傷的病理過(guò)程。為了觀察不同時(shí)間點(diǎn)TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化，TBI模型組再按照傷后1天、3天、7天、14天、28天這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為6只大鼠的亞組。這樣設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)的亞組，能夠全面地了解TBI后隨著時(shí)間推移，海馬中TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，有助于深入探討TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制以及不同階段的病理生理特點(diǎn)。通過(guò)這種分組方式，能夠系統(tǒng)地研究創(chuàng)傷性腦外傷對(duì)大鼠海馬中TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的影響，以及這些蛋白表達(dá)變化在TBI后不同時(shí)間階段的特點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和機(jī)制探討提供科學(xué)合理的分組依據(jù)。2.2.2處理過(guò)程TBI模型組大鼠處理過(guò)程：采用10%水合氯醛溶液，按照350mg/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉成功后，將其俯臥位固定于立體定向儀上，使用電動(dòng)剃毛器剃除大鼠頭頂部毛發(fā)，并用碘伏對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚進(jìn)行消毒。沿大鼠頭部中線左側(cè)切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)度約為1.5-2cm，鈍性分離骨膜，暴露顱骨。使用牙科鉆在中線旁2mm、緊挨冠狀縫后鉆開(kāi)一直徑為5mm的圓形骨窗，操作過(guò)程中注意保持硬腦膜的完整，避免對(duì)腦組織造成額外損傷。將改進(jìn)的Feeney自由落體裝置的撞擊圓錐置于骨窗硬膜上，圓錐頭端直徑為4mm、高為2.5mm，選用20g砝碼從10cm高處通過(guò)垂直導(dǎo)桿自由墜落，撞擊圓錐，從而造成大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷。致傷完成后，用骨蠟封閉骨窗，使用絲線間斷縫合頭皮，將大鼠置于溫暖的鼠籠中，待其自然蘇醒，蘇醒后自由進(jìn)食和飲水。正常對(duì)照組大鼠處理過(guò)程：同樣先對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉、固定、剃毛、消毒、切開(kāi)頭皮和分離骨膜等操作，但僅鉆開(kāi)顱骨形成骨窗，不進(jìn)行自由落體打擊，之后同樣用骨蠟封閉骨窗、縫合頭皮，后續(xù)飼養(yǎng)條件與TBI模型組相同。在整個(gè)處理過(guò)程中，需嚴(yán)格控制環(huán)境溫度在（22±2）℃，濕度在（50±10）%，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。手術(shù)器械需嚴(yán)格消毒，確保無(wú)菌操作，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。在麻醉過(guò)程中，密切觀察大鼠的呼吸、心跳等生命體征，避免麻醉過(guò)深或過(guò)淺對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。致傷時(shí)，要確保撞擊位置準(zhǔn)確、力度一致，以保證模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性。術(shù)后密切觀察大鼠的行為活動(dòng)、飲食情況等，如有異常及時(shí)處理。2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦外傷模型的建立2.3.1模型建立原理本研究采用基于自由落體原理的改進(jìn)裝置致傷大鼠，以此制作創(chuàng)傷性腦外傷（TBI）模型。該模型的建立原理是利用物體自由下落產(chǎn)生的沖擊力，模擬外力作用于頭部導(dǎo)致的腦損傷。自由落體運(yùn)動(dòng)遵循重力加速度規(guī)律，在忽略空氣阻力等次要因素的情況下，物體下落的速度會(huì)隨著下落高度的增加而增大，其沖擊力也隨之增強(qiáng)。通過(guò)精確控制砝碼的重量和下落高度，能夠精準(zhǔn)調(diào)控作用于大鼠頭部的外力大小，從而制造出不同程度的腦損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，選用特定規(guī)格的砝碼從一定高度自由墜落，撞擊置于大鼠顱骨骨窗硬膜上的撞擊圓錐，使大鼠腦組織受到瞬間的沖擊和壓迫，引發(fā)原發(fā)性腦損傷，如腦挫裂傷、腦震蕩等。隨后，由于損傷引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)失衡等，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生。這種模型能夠較好地模擬人類(lèi)創(chuàng)傷性腦外傷的病理過(guò)程，其損傷機(jī)制和病理變化與人類(lèi)TBI具有一定的相似性，符合本研究對(duì)TBI模型的需求，有助于深入研究創(chuàng)傷性腦外傷后海馬中TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化。2.3.2具體操作步驟麻醉：采用10%水合氯醛溶液，按照350mg/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。注射時(shí)需緩慢推注，密切觀察大鼠的呼吸、心跳、角膜反射等生命體征，確保麻醉效果適宜。麻醉成功的標(biāo)志為大鼠呼吸平穩(wěn)，角膜反射遲鈍，對(duì)疼痛刺激無(wú)明顯反應(yīng)。麻醉過(guò)程中要嚴(yán)格控制劑量，避免麻醉過(guò)深導(dǎo)致大鼠呼吸抑制甚至死亡，或麻醉過(guò)淺使大鼠在手術(shù)過(guò)程中蘇醒，影響手術(shù)操作和模型的穩(wěn)定性。固定：待大鼠麻醉成功后，將其俯臥位固定于立體定向儀上。使用膠帶或固定夾妥善固定大鼠的四肢和頭部，確保大鼠在手術(shù)過(guò)程中不會(huì)發(fā)生移動(dòng)，以保證手術(shù)操作的準(zhǔn)確性和一致性。固定時(shí)要注意避免過(guò)度壓迫大鼠的身體，以免影響血液循環(huán)和呼吸功能。備皮與消毒：使用電動(dòng)剃毛器剃除大鼠頭頂部毛發(fā)，盡量剃除干凈，以方便后續(xù)的手術(shù)操作。然后用碘伏對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚進(jìn)行消毒，消毒范圍要足夠大，一般以手術(shù)切口為中心，半徑約3-5cm的區(qū)域。消毒時(shí)需按照一定的順序，從中心向四周環(huán)形擦拭，重復(fù)消毒2-3次，確保消毒徹底，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。手術(shù)操作：沿大鼠頭部中線左側(cè)切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)度約為1.5-2cm。使用手術(shù)鑷子鈍性分離骨膜，充分暴露顱骨。在中線旁2mm、緊挨冠狀縫后，使用牙科鉆鉆開(kāi)一直徑為5mm的圓形骨窗。鉆骨窗時(shí)要注意控制力度和速度，避免損傷硬腦膜和腦組織。操作過(guò)程中可適當(dāng)使用生理鹽水沖洗，以降低鉆頭溫度，減少對(duì)腦組織的熱損傷。致傷：將改進(jìn)的Feeney自由落體裝置的撞擊圓錐置于骨窗硬膜上，圓錐頭端直徑為4mm、高為2.5mm。選用20g砝碼從10cm高處通過(guò)垂直導(dǎo)桿自由墜落，撞擊圓錐。砝碼的重量和下落高度是影響致傷程度的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的參數(shù)旨在造成中度創(chuàng)傷性腦損傷，以滿足研究需求。致傷瞬間，要確保撞擊位置準(zhǔn)確，避免撞擊圓錐發(fā)生偏移，保證每次致傷的一致性。術(shù)后處理：致傷完成后，用骨蠟封閉骨窗，以防止腦脊液漏出和感染。使用絲線間斷縫合頭皮，縫合間距要適中，一般為2-3mm，確保傷口對(duì)合良好。將大鼠置于溫暖的鼠籠中，保持環(huán)境溫度在（22±2）℃，濕度在（50±10）%，待其自然蘇醒。蘇醒后自由進(jìn)食和飲水，密切觀察大鼠的行為活動(dòng)、飲食情況、傷口愈合情況等，如有異常及時(shí)處理。2.4標(biāo)本采集及組織切片的制備2.4.1標(biāo)本采集時(shí)間和方法按照預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)，分別在傷后1天、3天、7天、14天、28天對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)本采集。采用10%水合氯醛溶液，按照350mg/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射深度麻醉，確保大鼠在采集過(guò)程中無(wú)痛苦且生命體征穩(wěn)定。待大鼠麻醉成功后，迅速打開(kāi)胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室插入灌注針，同時(shí)剪開(kāi)右心耳。先用預(yù)溫至37℃的0.9%生理鹽水快速灌注，以沖洗掉血管內(nèi)的血液，直至流出的液體清亮為止，一般灌注量為200-300ml，灌注速度控制在15-20ml/min。隨后，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定灌注，灌注量為250-350ml，灌注速度稍慢，控制在10-15ml/min，使多聚甲醛充分滲透到腦組織中，固定組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。灌注完成后，迅速斷頭取腦。用鋒利的手術(shù)剪刀在顱骨基部剪斷，小心取出整個(gè)腦組織，避免對(duì)腦組織造成機(jī)械損傷。將取出的腦組織置于預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中，4℃下后固定24-48h，以進(jìn)一步穩(wěn)定組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在標(biāo)本采集過(guò)程中，要嚴(yán)格控制操作時(shí)間，盡量縮短從麻醉到灌注固定的時(shí)間間隔，一般控制在5-10min內(nèi)，以減少組織自溶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)，要注意保持操作環(huán)境的清潔和低溫，避免微生物污染和組織變性。2.4.2組織切片制備流程固定：將后固定好的腦組織從4%多聚甲醛溶液中取出，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10-15min，以去除殘留的多聚甲醛。固定是組織切片制備的關(guān)鍵步驟，其目的是通過(guò)化學(xué)試劑使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)固定，防止組織自溶和變形，保持細(xì)胞和組織的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)觀察提供穩(wěn)定的樣本。多聚甲醛是一種常用的固定劑，它能與蛋白質(zhì)中的氨基、羥基等基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，從而達(dá)到固定組織的效果。脫水：將沖洗后的腦組織依次浸入不同濃度的酒精溶液中進(jìn)行脫水處理。先將腦組織放入70%酒精中浸泡2-3h，然后依次轉(zhuǎn)入80%酒精（浸泡1-2h）、95%酒精（浸泡1-2h，更換2次）、100%酒精（浸泡1-2h，更換2次）。脫水的目的是去除組織中的水分，因?yàn)樗值拇嬖跁?huì)影響后續(xù)石蠟的浸入和包埋效果。酒精具有良好的水溶性和對(duì)石蠟的互溶性，通過(guò)梯度酒精浸泡，可以逐步將組織中的水分置換出來(lái)，為石蠟包埋做好準(zhǔn)備。在脫水過(guò)程中，要注意酒精的濃度梯度和浸泡時(shí)間，避免脫水過(guò)度或不足，影響切片質(zhì)量。透明：脫水后的腦組織轉(zhuǎn)入二甲苯溶液中進(jìn)行透明處理。將腦組織放入二甲苯Ⅰ中浸泡30-60min，然后更換到二甲苯Ⅱ中再浸泡30-60min。二甲苯能溶解酒精，并與石蠟互溶，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟的浸入。透明過(guò)程中，要注意二甲苯的毒性，操作應(yīng)在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，避免吸入二甲苯蒸氣對(duì)身體造成損害。同時(shí)，要密切觀察組織的透明程度，防止透明過(guò)度導(dǎo)致組織變脆。浸蠟：將透明后的腦組織放入融化的石蠟中進(jìn)行浸蠟處理。先將腦組織放入56-58℃的石蠟Ⅰ中浸泡1-2h，然后轉(zhuǎn)入相同溫度的石蠟Ⅱ中浸泡1-2h，最后在石蠟Ⅲ中浸泡1-2h。浸蠟的目的是使石蠟充分浸入組織內(nèi)部，取代組織中的二甲苯，使組織在切片時(shí)能夠得到良好的支撐，保證切片的完整性和連續(xù)性。在浸蠟過(guò)程中，要確保石蠟的溫度恒定，避免溫度過(guò)高或過(guò)低影響浸蠟效果。同時(shí)，要注意更換石蠟，保證石蠟的純度和流動(dòng)性。包埋：將浸蠟后的腦組織放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，迅速將腦組織調(diào)整到合適的位置，使其切面平整且處于模具中央。待石蠟冷卻凝固后，即可形成含有腦組織的石蠟塊。包埋是將組織包裹在石蠟中，使其形成一個(gè)堅(jiān)固的整體，便于后續(xù)切片操作。包埋過(guò)程中，要注意動(dòng)作迅速，避免石蠟?zāi)踢^(guò)快導(dǎo)致腦組織位置偏移。同時(shí)，要確保石蠟完全覆蓋腦組織，避免出現(xiàn)氣泡或空洞。切片：使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4-5μm的切片。在切片前，要先對(duì)切片機(jī)進(jìn)行調(diào)試，確保切片厚度均勻、穩(wěn)定。將石蠟塊固定在切片機(jī)的樣品夾上，調(diào)整好切片刀的角度和位置，使切片刀與石蠟塊緊密接觸。啟動(dòng)切片機(jī)，緩慢推進(jìn)石蠟塊，切下的切片用毛筆輕輕挑起，放入40-45℃的溫水中展平，然后用載玻片撈取切片，將其貼附在載玻片上。切片是獲取薄而均勻的組織切片的關(guān)鍵步驟，切片的質(zhì)量直接影響到后續(xù)的染色和觀察效果。在切片過(guò)程中，要注意保持切片機(jī)的清潔和穩(wěn)定，避免切片出現(xiàn)褶皺、斷裂等問(wèn)題。同時(shí)，要熟練掌握切片技巧，確保切片厚度符合實(shí)驗(yàn)要求?？酒簩①N有切片的載玻片放入60℃的烤片機(jī)中烘烤1-2h，使切片牢固地附著在載玻片上?？酒哪康氖侨コ衅械乃郑鰪?qiáng)切片與載玻片之間的粘附力，防止在后續(xù)染色過(guò)程中切片脫落?？酒瑫r(shí)，要注意控制溫度和時(shí)間，避免溫度過(guò)高導(dǎo)致切片燒焦或變形。2.5石蠟切片的制作2.5.1所需主要實(shí)驗(yàn)儀器切片機(jī)：選用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，品牌為[具體品牌]，型號(hào)為[具體型號(hào)]。其主要作用是將經(jīng)過(guò)包埋的組織塊切成薄片，該切片機(jī)的切片厚度可在一定范圍內(nèi)精確調(diào)節(jié)，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)4-5μm厚度切片的要求。通過(guò)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)的手輪或電動(dòng)控制裝置，可使組織塊以均勻的速度向切片刀推進(jìn)，從而切出連續(xù)、厚度一致的切片，為后續(xù)的染色和觀察提供高質(zhì)量的樣本。烘箱：采用[品牌]的恒溫烘箱，型號(hào)為[具體型號(hào)]。在石蠟切片制作過(guò)程中，烘箱主要用于烤片，將貼有切片的載玻片放入烘箱中，在60℃的溫度下烘烤1-2h。這一過(guò)程可以使切片牢固地附著在載玻片上，防止在后續(xù)染色等操作過(guò)程中切片脫落。同時(shí)，烘烤還能去除切片中的水分，避免水分對(duì)染色效果產(chǎn)生影響。攤片機(jī)：[品牌]攤片機(jī)，型號(hào)為[具體型號(hào)]。攤片機(jī)的作用是將切片機(jī)切下的組織切片展平。在切片過(guò)程中，由于組織的彈性和切片刀的切割作用，切片可能會(huì)出現(xiàn)褶皺或卷曲。將切下的切片放入40-45℃的溫水中，利用攤片機(jī)的加熱和水波作用，可使切片在水面上自然展開(kāi)，便于后續(xù)用載玻片撈取。包埋機(jī)：[品牌]包埋機(jī)，型號(hào)為[具體型號(hào)]。包埋機(jī)用于將浸蠟后的組織包裹在石蠟中，形成質(zhì)地堅(jiān)硬的石蠟塊。在包埋過(guò)程中，先將融化的石蠟倒入特制的包埋模具中，然后迅速將組織塊放入模具中，并調(diào)整好位置，使組織塊處于模具中央且切面平整。包埋機(jī)能夠精確控制石蠟的溫度和凝固速度，確保石蠟均勻地包裹組織，為切片提供良好的支撐結(jié)構(gòu)。2.5.2制作方法切片：將包埋好的石蠟塊固定在切片機(jī)的樣品夾上，調(diào)整切片刀的角度和位置，使其與石蠟塊緊密接觸。設(shè)置切片厚度為4-5μm，啟動(dòng)切片機(jī)，緩慢推進(jìn)石蠟塊，切下的組織切片用毛筆輕輕挑起。在切片過(guò)程中，要注意保持切片機(jī)的穩(wěn)定，避免切片出現(xiàn)褶皺、斷裂等問(wèn)題。同時(shí)，要密切關(guān)注切片的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)切片厚度不均勻或有其他異常情況，應(yīng)及時(shí)調(diào)整切片機(jī)參數(shù)。展片：將切下的切片放入40-45℃的溫水中，由于水溫的作用，切片會(huì)逐漸展開(kāi)。在展片過(guò)程中，要注意水溫的控制，水溫過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致組織切片變形，水溫過(guò)低則無(wú)法使切片充分展平。同時(shí)，要避免切片在水中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免影響切片的質(zhì)量。貼片：用干凈的載玻片從溫水中撈取展平的切片，使切片平整地貼附在載玻片上。貼片時(shí)，要注意載玻片的清潔，避免雜質(zhì)污染切片。同時(shí)，要確保切片與載玻片緊密貼合，避免出現(xiàn)氣泡或褶皺。烤片：將貼有切片的載玻片放入60℃的烘箱中烘烤1-2h。烤片過(guò)程中，要注意烘箱溫度的穩(wěn)定，避免溫度過(guò)高導(dǎo)致切片燒焦或變形?？酒瓿珊螅〕鲚d玻片，待其冷卻后即可進(jìn)行后續(xù)的染色等操作。2.6蘇木精-伊紅染色（HE染色）步驟2.6.1切片脫蠟切片脫蠟是HE染色的首要步驟，其目的是去除石蠟包埋組織切片中的石蠟，使組織能夠充分與后續(xù)染色試劑接觸。具體方法為：將石蠟切片從烤片機(jī)上取出，迅速放入二甲苯Ⅰ中浸泡15-20min，二甲苯能有效溶解石蠟，使石蠟從切片中脫離。之后，將切片轉(zhuǎn)移至二甲苯Ⅱ中再浸泡15-20min，進(jìn)一步確保石蠟完全脫除。脫蠟是否充分對(duì)后續(xù)染色效果起著關(guān)鍵作用，若脫蠟不徹底，石蠟殘留會(huì)阻礙染色試劑進(jìn)入組織，導(dǎo)致染色不均勻或染色失敗，影響對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的觀察和分析。2.6.2水化水化的作用是使脫蠟后的切片從有機(jī)溶劑環(huán)境逐漸過(guò)渡到水溶液環(huán)境，為染色做準(zhǔn)備。將脫蠟后的切片依次放入100%酒精Ⅰ中浸泡5-10min，100%酒精Ⅱ中浸泡5-10min，以去除切片中的二甲苯。然后，將切片放入95%酒精中浸泡5-10min，接著放入85%酒精中浸泡5-10min，最后放入75%酒精中浸泡5-10min。通過(guò)這一系列不同濃度酒精的浸泡，逐步降低切片中的酒精濃度，使組織中的水分逐漸增加，達(dá)到水化的目的。水化過(guò)程能夠使組織恢復(fù)到接近生理狀態(tài)的含水量，有利于后續(xù)蘇木精和伊紅染液與組織細(xì)胞成分的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)良好的染色效果。2.6.3染色染色是HE染色的核心步驟，通過(guò)蘇木精和伊紅染液對(duì)組織細(xì)胞不同成分的特異性染色，清晰顯示神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將水化后的切片用蒸餾水沖洗2-3次，每次沖洗3-5min，以去除殘留的酒精。然后，將切片浸入蘇木精染液中染色5-10min，蘇木精是一種堿性染料，能夠與細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)（如DNA）結(jié)合，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色完成后，用自來(lái)水沖洗切片，直至切片上的染液顏色不再明顯變化，一般沖洗時(shí)間為5-10min。接著，將切片放入1%鹽酸酒精分化液中分化數(shù)秒，分化的目的是去除組織中過(guò)多的蘇木精染色，使細(xì)胞核染色更加清晰，分化時(shí)間需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，一般為3-5s。分化后，立即將切片放入自來(lái)水中沖洗，進(jìn)行返藍(lán)，使細(xì)胞核的藍(lán)色更加鮮艷，返藍(lán)時(shí)間一般為5-10min。將返藍(lán)后的切片放入伊紅染液中染色3-5min，伊紅是一種酸性染料，能夠與細(xì)胞質(zhì)中的堿性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色完成后，用蒸餾水沖洗切片，去除多余的伊紅染液，沖洗時(shí)間為3-5min。通過(guò)蘇木精和伊紅的染色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出明顯的顏色對(duì)比，便于在顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列情況，為分析TBI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。2.6.4封片封片是HE染色的最后一步，其目的是將染色后的切片進(jìn)行封裝，保護(hù)切片免受外界因素的影響，同時(shí)提高切片的透明度，便于長(zhǎng)期保存和觀察。將染色后的切片依次放入95%酒精Ⅰ中浸泡5-10min，95%酒精Ⅱ中浸泡5-10min，100%酒精Ⅰ中浸泡5-10min，100%酒精Ⅱ中浸泡5-10min，進(jìn)行脫水處理，去除切片中的水分。然后，將切片放入二甲苯Ⅰ中浸泡5-10min，二甲苯Ⅱ中浸泡5-10min，進(jìn)行透明處理，使切片變得透明。最后，在切片上滴加適量的中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片，輕輕按壓，使蓋玻片與切片緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。中性樹(shù)膠具有良好的透光性和穩(wěn)定性，能夠使切片在長(zhǎng)期保存過(guò)程中保持清晰的圖像，便于后續(xù)在顯微鏡下進(jìn)行觀察和分析。2.7免疫組織化學(xué)染色2.7.1原理免疫組織化學(xué)染色技術(shù)是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，利用標(biāo)記物對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記物顯色，從而在組織細(xì)胞原位顯示特定抗原的存在及分布情況。在本研究中，用于檢測(cè)TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的免疫組化原理如下：首先，將制備好的組織切片進(jìn)行預(yù)處理，使抗原充分暴露。然后，加入特異性的一抗，本研究中使用兔抗大鼠TDP-43多克隆抗體和兔抗大鼠PGRN多克隆抗體，這些一抗能夠與組織切片中的TDP-43和PGRN蛋白特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。接著，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，從而在抗原-抗體復(fù)合物上連接上生物素。隨后，加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），由于鏈霉親和素與生物素具有高度的親和力，SABC能夠與二抗上的生物素結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。此時(shí)，復(fù)合物上的過(guò)氧化物酶能夠催化DAB顯色試劑盒中的底物3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）發(fā)生氧化反應(yīng)，DAB在過(guò)氧化物酶的作用下被氧化成不溶性的棕色產(chǎn)物，沉積在抗原存在的部位，從而使表達(dá)TDP-43及PGRN蛋白的細(xì)胞呈現(xiàn)出棕色，通過(guò)顯微鏡觀察即可判斷蛋白的表達(dá)情況。該技術(shù)的特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)蛋白在組織細(xì)胞中的表達(dá)位置和相對(duì)含量，為研究TBI后海馬中TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化提供了可靠的方法。2.7.2操作步驟切片預(yù)處理：將石蠟切片從烤片機(jī)上取出，立即放入二甲苯Ⅰ中脫蠟15-20min，二甲苯Ⅱ中脫蠟15-20min，以徹底去除切片中的石蠟，使組織能夠充分與后續(xù)試劑接觸。脫蠟后，將切片依次放入100%酒精Ⅰ中浸泡5-10min，100%酒精Ⅱ中浸泡5-10min，95%酒精中浸泡5-10min，85%酒精中浸泡5-10min，75%酒精中浸泡5-10min，進(jìn)行水化處理，使切片從有機(jī)溶劑環(huán)境過(guò)渡到水溶液環(huán)境。水化后，用蒸餾水沖洗切片3次，每次3-5min，以去除殘留的酒精。將切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免其對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生干擾。孵育后，用蒸餾水沖洗切片3次，每次3-5min，再用PBS緩沖液浸泡切片5min，進(jìn)行緩沖液平衡?？乖迯?fù)：對(duì)于某些抗原，在組織固定和石蠟包埋過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生抗原表位的遮蔽，需要進(jìn)行抗原修復(fù)。本研究采用高壓修復(fù)法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中，加熱至沸騰后，將切片放入鍋中，蓋上鍋蓋，當(dāng)氣閥冒氣時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)2-3min，然后將壓力鍋從熱源上取下，用自來(lái)水沖洗鍋蓋，至氣閥自然落下，打開(kāi)鍋蓋，待溶液自然冷卻至室溫?？乖迯?fù)能夠使抗原表位重新暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力，提高免疫組化染色的敏感性。修復(fù)后，用PBS緩沖液浸泡切片5min，沖洗3次，每次5min。一抗孵育：將切片從PBS緩沖液中取出，用濾紙吸去切片周?chē)嘤嗟囊后w，但要保持切片濕潤(rùn)。在切片上滴加適量的5%正常山羊血清，室溫孵育15-20min，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。傾去血清，勿洗，直接在切片上滴加適當(dāng)比例稀釋的兔抗大鼠TDP-43多克隆抗體或兔抗大鼠PGRN多克隆抗體，將切片放入濕盒中，37℃孵育1-2h或4℃過(guò)夜。一抗孵育的溫度和時(shí)間需要根據(jù)抗體的特性和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化，以確保一抗能夠與抗原充分結(jié)合。孵育后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育：在切片上滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30-60min。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)生物素與后續(xù)加入的SABC中的鏈霉親和素結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。孵育后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的二抗。SABC孵育：在切片上滴加適量的鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），37℃孵育30-60min。SABC中的鏈霉親和素與二抗上的生物素結(jié)合，而過(guò)氧化物酶則為后續(xù)的顯色反應(yīng)提供催化作用。孵育后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的SABC。顯色：將DAB顯色試劑盒中的A、B、C液按照1:1:1的比例混合均勻，在切片上滴加適量的混合液，室溫下顯色3-10min。在顯色過(guò)程中，要在顯微鏡下密切觀察，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)出明顯的棕色，而背景顏色較淺時(shí)，立即用自來(lái)水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。顯色時(shí)間需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，避免顯色過(guò)度或不足。復(fù)染與封片：將顯色后的切片放入蘇木精染液中復(fù)染細(xì)胞核，染色時(shí)間為1-3min，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。復(fù)染后，用自來(lái)水沖洗切片，然后放入1%鹽酸酒精分化液中分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗進(jìn)行返藍(lán)。將切片依次放入75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精中各浸泡5min，進(jìn)行脫水處理。最后，將切片放入二甲苯中透明5-10min，在切片上滴加適量的中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片，輕輕按壓，使蓋玻片與切片緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。封片后的切片可長(zhǎng)期保存，用于顯微鏡觀察和分析。在免疫組化染色操作過(guò)程中，需要注意以下關(guān)鍵和事項(xiàng)：切片脫蠟和水化要充分，否則會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合以及后續(xù)的染色效果；一抗和二抗的孵育溫度、時(shí)間和濃度需要嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行優(yōu)化，避免出現(xiàn)非特異性染色或染色強(qiáng)度不足的情況；在加入試劑時(shí)，要確保試劑均勻覆蓋切片，避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象，否則會(huì)導(dǎo)致染色不均勻；DAB顯色劑具有一定的毒性，操作時(shí)要在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，并注意避免接觸皮膚和眼睛；顯色時(shí)間的控制非常關(guān)鍵，需要在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察，以獲得最佳的染色效果。2.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖像分析2.8.1結(jié)果觀察指標(biāo)本研究主要觀察指標(biāo)包括TDP-43及PGRN蛋白在大鼠海馬中的表達(dá)位置、表達(dá)強(qiáng)度，以及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的變化。選擇這些指標(biāo)具有明確的依據(jù)。TDP-43和PGRN蛋白在正常生理狀態(tài)下，在海馬神經(jīng)元中具有特定的表達(dá)位置。在創(chuàng)傷性腦外傷（TBI）后，其表達(dá)位置可能發(fā)生改變，如TDP-43從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，這種位置的改變與神經(jīng)細(xì)胞的病理變化密切相關(guān)，能夠反映TBI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞正常生理功能的影響。蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化則直接反映了TBI后TDP-43及PGRN蛋白合成或降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程。TBI引發(fā)的一系列病理生理反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，可能通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)控這些蛋白的表達(dá)水平。檢測(cè)其表達(dá)強(qiáng)度的變化，有助于深入了解TBI的病理機(jī)制以及這些蛋白在其中的作用。海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的變化是TBI對(duì)神經(jīng)組織損傷的直觀體現(xiàn)。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核的形態(tài)和結(jié)構(gòu)等變化，能夠判斷神經(jīng)細(xì)胞是否出現(xiàn)腫脹、萎縮、凋亡等病理改變。這些形態(tài)學(xué)變化與TDP-43及PGRN蛋白的表達(dá)變化可能存在內(nèi)在聯(lián)系，綜合分析這些指標(biāo)，能夠全面揭示TBI后海馬神經(jīng)細(xì)胞的病理變化過(guò)程。2.8.2圖像分析方法采用Image-ProPlus圖像分析軟件對(duì)免疫組織化學(xué)染色和HE染色的圖像進(jìn)行分析。在免疫組織化學(xué)染色圖像分析中，主要測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的光密度值和面積。首先，在顯微鏡下選取海馬特定區(qū)域（如CA1、CA3區(qū)等）進(jìn)行拍照，確保每組照片的拍攝條件（如曝光時(shí)間、放大倍數(shù)、光源強(qiáng)度等）一致，以保證圖像的可比性。將拍攝的圖像導(dǎo)入Image-ProPlus軟件，利用軟件的色彩分割功能，將陽(yáng)性染色（棕色）與背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。通過(guò)設(shè)定合適的閾值，提取陽(yáng)性染色區(qū)域，軟件自動(dòng)計(jì)算該區(qū)域的平均光密度值和面積。平均光密度值反映了陽(yáng)性染色的強(qiáng)度，即TDP-43或PGRN蛋白的表達(dá)強(qiáng)度；陽(yáng)性染色區(qū)域面積則反映了表達(dá)相應(yīng)蛋白的細(xì)胞數(shù)量或范圍。將光密度值和面積數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可定量比較不同組（正常對(duì)照組和TBI模型組）以及不同時(shí)間點(diǎn)之間TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的差異。對(duì)于HE染色圖像，主要分析神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)，如細(xì)胞面積、細(xì)胞核面積、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例等。同樣在顯微鏡下選取海馬區(qū)域進(jìn)行拍照，導(dǎo)入軟件后，利用軟件的測(cè)量工具，手動(dòng)或自動(dòng)勾勒出神經(jīng)細(xì)胞的輪廓和細(xì)胞核的輪廓，軟件計(jì)算出相應(yīng)的面積和比例參數(shù)。通過(guò)比較這些參數(shù)在正常對(duì)照組和TBI模型組以及不同時(shí)間點(diǎn)的變化，評(píng)估TBI對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響。在整個(gè)圖像分析過(guò)程中，為了減少人為誤差，每個(gè)樣本的圖像分析均重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理2.9.1統(tǒng)計(jì)方法選擇本研究選用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于計(jì)量資料，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較正常對(duì)照組和TBI模型組在同一時(shí)間點(diǎn)TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的差異；采用單因素方差分析（One-WayANOVA）比較TBI模型組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的差異。選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)是因?yàn)槠溥m用于兩組獨(dú)立樣本均數(shù)的比較，能夠清晰地揭示正常對(duì)照組和TBI模型組之間的差異情況。單因素方差分析則適用于多個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)的比較，本研究中TBI模型組設(shè)置了5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)單因素方差分析可以全面評(píng)估不同時(shí)間點(diǎn)之間蛋白表達(dá)的變化情況，判斷時(shí)間因素對(duì)蛋白表達(dá)是否有顯著影響。當(dāng)單因素方差分析結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以明確具體哪些時(shí)間點(diǎn)之間存在差異。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于比較兩組獨(dú)立樣本，Kruskal-WallisH檢驗(yàn)用于多組獨(dú)立樣本的比較。選擇這些非參數(shù)檢驗(yàn)方法是因?yàn)樗鼈儾灰蕾?lài)于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，對(duì)于不符合正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行有效的分析，確保研究結(jié)果的可靠性。2.9.2數(shù)據(jù)分析過(guò)程首先，將Image-ProPlus圖像分析軟件測(cè)量得到的TDP-43及PGRN蛋白陽(yáng)性染色區(qū)域的光密度值、面積等數(shù)據(jù)，以及HE染色圖像分析得到的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)參數(shù)，準(zhǔn)確錄入到SPSS軟件中。在錄入過(guò)程中，仔細(xì)核對(duì)數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性，避免錄入錯(cuò)誤對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響。錄入完成后，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法，判斷數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，再進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用Levene檢驗(yàn)方法，判斷各組數(shù)據(jù)的方差是否齊性。根據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。在進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析時(shí)，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，即當(dāng)P值小于0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于單因素方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，分析不同時(shí)間點(diǎn)之間的具體差異情況。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，采用相應(yīng)的非參數(shù)檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，并根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解讀。最后，對(duì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行整理和總結(jié)，以圖表的形式直觀展示不同組、不同時(shí)間點(diǎn)之間TDP-43及PGRN蛋白表達(dá)的差異情況，以及神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)參數(shù)的變化情況。在圖表中，明確標(biāo)注統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法、P值、均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差等關(guān)鍵信息，以便清晰地呈現(xiàn)研究結(jié)果，為后續(xù)的討論和結(jié)論提供有力的數(shù)據(jù)支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1動(dòng)物模型建立后大鼠的一般情況3.1.1行為表現(xiàn)TBI模型組大鼠在造模后，行為表現(xiàn)出現(xiàn)明顯異常。傷后即刻，大鼠表現(xiàn)出昏迷狀態(tài)，對(duì)外界刺激反應(yīng)消失，呼吸急促且不規(guī)則，肢體松軟無(wú)力。隨著時(shí)間推移，在傷后1天，大鼠雖逐漸蘇醒，但仍呈現(xiàn)出精神萎靡、活動(dòng)能力明顯下降的狀態(tài)。其自主活動(dòng)范圍明顯減小，多數(shù)時(shí)間蜷縮于鼠籠一角，對(duì)周?chē)h(huán)境的探索行為顯著減少。在與正常對(duì)照組大鼠同置于空曠環(huán)境中時(shí)，正常對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出活躍的探索行為，頻繁走動(dòng)、嗅聞周?chē)h(huán)境，而TBI模型組大鼠則長(zhǎng)時(shí)間靜止不動(dòng)，僅有少量緩慢的移動(dòng)。傷后3天，TBI模型組大鼠的活動(dòng)能力有所恢復(fù)，但仍與正常對(duì)照組存在顯著差異。其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性較差，行走時(shí)出現(xiàn)明顯的步態(tài)不穩(wěn)，表現(xiàn)為左右搖晃、肢體協(xié)調(diào)性不佳，常出現(xiàn)摔倒的情況。在進(jìn)行爬桿測(cè)試時(shí)，正常對(duì)照組大鼠能夠迅速且穩(wěn)定地爬上桿頂，而TBI模型組大鼠則需要花費(fèi)更長(zhǎng)的時(shí)間，且在攀爬過(guò)程中容易滑落。傷后7天，TBI模型組大鼠的精神狀態(tài)有所改善，活動(dòng)量逐漸增加，但與正常對(duì)照組相比，仍存在明顯的行為異常。在進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)，正常對(duì)照組大鼠能夠較快地找到隱藏在水中的平臺(tái)，而TBI模型組大鼠則表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)和記憶障礙，需要更多的嘗試次數(shù)才能找到平臺(tái)，且找到平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。傷后14天和28天，TBI模型組大鼠的行為雖持續(xù)改善，但仍未完全恢復(fù)至正常水平。其活動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和認(rèn)知能力與正常對(duì)照組相比，仍存在一定差距。這些行為變化表明，創(chuàng)傷性腦外傷對(duì)大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的損傷，影響了其正常的行為和生理功能，且損傷后的恢復(fù)過(guò)程較為緩慢，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍存在行為異常。3.1.2生理指標(biāo)在體重方面，正常對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)的趨勢(shì)，每周體重增長(zhǎng)約10-15g。而TBI模型組大鼠在傷后1天，體重出現(xiàn)明顯下降，平均下降約15-20g，這可能是由于創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致大鼠食欲下降、代謝紊亂所致。傷后3天，TBI模型組大鼠體重下降趨勢(shì)減緩，但仍低于傷前水平。傷后7天，大鼠體重開(kāi)始逐漸回升，但增長(zhǎng)速度明顯慢于正常對(duì)照組，至傷后28天，TBI模型組大鼠體重仍未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。在體溫方面，正常對(duì)照組大鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃的相對(duì)穩(wěn)定范圍。TBI模型組大鼠在傷后即刻，體溫出現(xiàn)明顯下降，可降至（35.0±0.5）℃左右，這是由于創(chuàng)傷導(dǎo)致機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)中樞功能紊亂，以及機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)使得外周血管收縮，散熱增加所致。傷后1-3天，TBI模型組大鼠體溫逐漸回升，但仍低于正常對(duì)照組，波動(dòng)在（36.0±0.5）℃左右。傷后7天，體溫基本恢復(fù)至正常范圍，但在后續(xù)觀察中，仍可發(fā)現(xiàn)體溫的波動(dòng)幅度較正常對(duì)照組稍大。這些生理指標(biāo)的變化反映了創(chuàng)傷性腦外傷對(duì)大鼠生理狀態(tài)的顯著影響。體重的下降和恢復(fù)緩慢表明創(chuàng)傷影響了大鼠的營(yíng)養(yǎng)攝入和代謝功能，而體溫的變化則提示腦外傷對(duì)體溫調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生了干擾。通過(guò)對(duì)這些生理指標(biāo)的監(jiān)測(cè)，不僅能夠直觀地了解TBI對(duì)大鼠生理狀態(tài)的損傷程度，還為進(jìn)一步研究TBI后的病理生理過(guò)程提供了重要的參考依據(jù)，有助于深入探討TBI的發(fā)病機(jī)制和治療策略。3.2HE染色結(jié)果3.2.1正常對(duì)照組腦組織形態(tài)正常對(duì)照組大鼠腦組織經(jīng)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。神經(jīng)細(xì)胞呈多邊形或錐形，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)均勻分布，核仁清晰可見(jiàn)。細(xì)胞質(zhì)豐富，呈淡紅色，其中細(xì)胞器形態(tài)正常，分布均勻。神經(jīng)細(xì)胞排列緊密且規(guī)則，層次分明，在海馬的不同亞區(qū)（如CA1、CA3區(qū)等），細(xì)胞的形態(tài)和排列特點(diǎn)具有典型性。CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈單層排列，細(xì)胞形態(tài)較為一致；CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，呈多層分布。神經(jīng)纖維清晰可見(jiàn)，在細(xì)胞之間交織成網(wǎng)絡(luò)狀，維持著正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。血管結(jié)構(gòu)正常，血管壁完整，管腔通暢，無(wú)充血、水腫等異?，F(xiàn)象。正常對(duì)照組腦組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為后續(xù)觀察TBI模型組腦組織的病理改變提供了重要的參照標(biāo)準(zhǔn)，有助于準(zhǔn)確判斷TBI對(duì)腦組織造成的損傷程度和范圍。3.2.2TBI模型組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織病理改變TBI模型組大鼠在傷后1天，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理改變。神經(jīng)細(xì)胞腫脹，體積增大，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，偏向一側(cè)，呈現(xiàn)出核固縮的現(xiàn)象。細(xì)胞質(zhì)染色加深，呈深紅色，表明細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分發(fā)生了改變，可能與細(xì)胞的代謝紊亂和損傷有關(guān)。細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞之間的間隙增大，出現(xiàn)了細(xì)胞疏松的現(xiàn)象。血管周?chē)梢?jiàn)明顯的水腫帶，血管壁通透性增加，有少量紅細(xì)胞滲出。這可能是由于TBI導(dǎo)致血腦屏障受損，血管內(nèi)的液體和血細(xì)胞滲出到周?chē)M織，引起局部水腫。傷后3天，病理改變進(jìn)一步加重。神經(jīng)細(xì)胞腫脹更加明顯，部分細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性受損，出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)容物外溢。細(xì)胞核固縮更加嚴(yán)重，染色質(zhì)高度凝聚，呈現(xiàn)出深染的狀態(tài)，甚至有些細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂。細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大，組織疏松程度加劇，可見(jiàn)較多的空泡形成，提示細(xì)胞壞死和組織液化的發(fā)生。血管周?chē)[帶進(jìn)一步加寬，紅細(xì)胞滲出增多，炎癥細(xì)胞開(kāi)始浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這些炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)是機(jī)體對(duì)損傷的一種免疫反應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重組織損傷。傷后7天，神經(jīng)細(xì)胞損傷依然明顯，但可見(jiàn)一些修復(fù)的跡象。部分存活的神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)的恢復(fù)，細(xì)胞核逐漸恢復(fù)圓形，染色質(zhì)分布趨于均勻。細(xì)胞間隙有所減小，組織疏松程度略有減輕。然而，仍有大量的神經(jīng)細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域可見(jiàn)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片的現(xiàn)象。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)持續(xù)存在，但中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，巨噬細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多。這表明炎癥反應(yīng)進(jìn)入了一個(gè)相對(duì)慢性的階段，巨噬細(xì)胞在清除壞死組織和促進(jìn)組織修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，新生血管開(kāi)始形成，這是機(jī)體為了恢復(fù)受損腦組織的血液供應(yīng)而進(jìn)行的一種代償性反應(yīng)。傷后14天，神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行。存活的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步恢復(fù)正常，細(xì)胞排列逐漸趨于有序。壞死區(qū)域逐漸被吸收，瘢痕組織開(kāi)始形成。瘢痕組織主要由纖維結(jié)締組織構(gòu)成，它的形成有助于填補(bǔ)壞死組織留下的空隙，維持組織的結(jié)構(gòu)完整性。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，僅見(jiàn)少量的巨噬細(xì)胞。新生血管數(shù)量增多，血管網(wǎng)絡(luò)逐漸完善，為腦組織的修復(fù)和功能恢復(fù)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)支持。傷后28天，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，但仍可觀察到一些細(xì)微的病理改變。部分神經(jīng)細(xì)胞體積略小于正常細(xì)胞，細(xì)胞核染色質(zhì)稍顯致密。細(xì)胞排列雖然接近正常，但仍可看出與正常對(duì)照組的差異。瘢痕組織進(jìn)一步成熟，纖維組織更加致密。炎癥細(xì)胞基本消失，新生血管穩(wěn)定，腦組織的結(jié)構(gòu)和功能逐漸趨于穩(wěn)定，但仍未完全恢復(fù)到正常水平。通過(guò)對(duì)TBI模型組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織病理改變的觀察，清晰地展示了TBI后神經(jīng)細(xì)胞從損傷到修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為深入理解TBI的病理機(jī)制提供了直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.3免疫組織化學(xué)染色3.3.1TDP-43免疫組化結(jié)果在正常對(duì)照組大鼠海馬組織中，TDP-43蛋白主要定位于細(xì)胞核，呈淡棕色均勻分布，細(xì)胞質(zhì)中僅有少量表達(dá)，免疫組化染色結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，且陽(yáng)性染色強(qiáng)度較弱。這表明在正常生理狀態(tài)下，TDP-43在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能，如參與RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接等過(guò)程。TBI模型組大鼠海馬組織中，TDP-43蛋白的表達(dá)在傷后出現(xiàn)明顯變化。傷后1天，即可觀察到細(xì)胞質(zhì)中TDP-43蛋白表達(dá)開(kāi)始增多，陽(yáng)性染色強(qiáng)度增強(qiáng)，部分細(xì)胞核中的TDP-43蛋白出現(xiàn)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。這可能是由于TBI導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，影響了TDP-43蛋白的正常定位和功能。隨著時(shí)間推移，傷后3天，細(xì)胞質(zhì)中TDP-43蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，細(xì)胞核中TDP-43蛋白含量相對(duì)減少，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，且陽(yáng)性染色更為明顯。此時(shí)，TDP-43蛋白的異常聚集開(kāi)始出現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)中形成大小不一的棕色顆粒狀聚集物。這些聚集物的形成可能會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)正常的生理代謝過(guò)程，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能。傷后7天，TDP-43蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)達(dá)到高峰，細(xì)胞核中幾乎檢測(cè)不到TDP-43蛋白。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最多，聚集物更加明顯且數(shù)量增多。大量的TDP-43蛋白聚集在細(xì)胞質(zhì)中，可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)一系列病理變化，如神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)失衡等。傷后14天，細(xì)胞質(zhì)中TDP-43蛋白表達(dá)開(kāi)始逐漸下降，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，聚集物的數(shù)量和大小也有所減小。這可能是機(jī)體自身的一種修復(fù)機(jī)制在發(fā)揮作用，嘗試清除異常聚集的TDP-43蛋白，恢復(fù)細(xì)胞的正常功能。傷后28天，TDP-43蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，僅見(jiàn)少量殘留，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量極少，聚集物基本消失。但仍可觀察到個(gè)別細(xì)胞中存在少量TDP-43蛋白的異常表達(dá)，提示TBI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍未完全消除。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)TBI模型組與正常對(duì)照組TDP-43蛋白表達(dá)的比較，經(jīng)Image-ProPlus圖像分析軟件測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的光密度值和面積，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，TBI模型組各時(shí)間點(diǎn)的胞漿TDP-43陽(yáng)性蛋白表達(dá)量均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了TBI會(huì)導(dǎo)致海馬組織中TDP-43蛋白表達(dá)異常，且這種異常表達(dá)在傷后早期較為明顯，隨著時(shí)間的推移逐漸恢復(fù)，但仍與正常水平存在差異。3.3.2PGRN免疫組化結(jié)果正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元中，PGRN蛋白呈均勻分布，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中幾乎無(wú)表達(dá)。免疫組化染色顯示陽(yáng)性細(xì)胞染色較淺，陽(yáng)性強(qiáng)度較弱，表明在正常生理狀態(tài)下，PGRN在海馬神經(jīng)元中維持著相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)表達(dá)水平。在TBI模型組大鼠海馬組織中，PGRN蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出與TDP-43蛋白相反的變化趨勢(shì)。傷后1天，神經(jīng)元胞漿中PGRN蛋白表達(dá)開(kāi)始逐漸下降，陽(yáng)性染色強(qiáng)度減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量雖無(wú)明顯減少，但陽(yáng)性細(xì)胞的染色深度明顯變淺。這可能是由于TBI引發(fā)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等病理過(guò)程，抑制了PGRN蛋白的合成，導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。傷后3天，PGRN蛋白表達(dá)繼續(xù)下降，陽(yáng)性染色進(jìn)一步減弱，部分神經(jīng)元的PGRN蛋白表達(dá)接近檢測(cè)下限。此時(shí)，神經(jīng)元周?chē)男∧z質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始激活增生，小膠質(zhì)細(xì)胞中PGRN蛋白表達(dá)逐漸增多，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的陽(yáng)性染色。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是機(jī)體對(duì)腦損傷的一種免疫反應(yīng)，而其表達(dá)PGRN蛋白的增加可能與小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷修復(fù)和炎癥調(diào)節(jié)中的作用有關(guān)。傷后7天，神經(jīng)元胞漿中PGRN蛋白表達(dá)降至最低值，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，染色幾乎不可見(jiàn)。而小膠質(zhì)細(xì)胞中PGRN蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，陽(yáng)性染色最強(qiáng)，小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積增大，突起增多。這些變化表明小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI后的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，PGRN蛋白可能參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和功能調(diào)節(jié)。傷后14天，神經(jīng)元胞漿中PGRN蛋白表達(dá)開(kāi)始逐漸增多，陽(yáng)性染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也有所增加。小膠質(zhì)細(xì)胞中PGRN蛋白表達(dá)則逐漸下降，陽(yáng)性染色減弱。這說(shuō)明隨著時(shí)間的推移，神經(jīng)元開(kāi)始逐漸恢復(fù)，PGRN蛋白的合成增加，而小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)逐漸減弱，其分泌的PGRN蛋白也相應(yīng)減少。傷后28天，神經(jīng)元中PGRN蛋白表達(dá)基本接近正常水平，陽(yáng)性染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。小膠質(zhì)細(xì)胞中PGRN蛋白僅見(jiàn)少量殘留，陽(yáng)性染色極弱。這表明在傷后28天，TBI模型組大鼠海馬組織中的PGRN蛋白表達(dá)已基本恢復(fù)正常，神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的功能也逐漸趨于穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)TBI模型組與正常對(duì)照組PGRN蛋白表達(dá)的比較，經(jīng)Image-ProPlus圖像分析軟件測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的光密度值和面積，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，TBI模型組各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)PGRN（nPGRN）陽(yáng)性蛋白表達(dá)均低于同時(shí)段正常對(duì)照組（P＜0.05）；膠質(zhì)細(xì)胞中PGRN蛋白（mPGRN）的表達(dá)高于同時(shí)段正常對(duì)照組（P＜0.05）。這表明TBI對(duì)海馬組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的PGRN蛋白表達(dá)產(chǎn)生了不同的影響，在神經(jīng)元中表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)，而在膠質(zhì)細(xì)胞中則表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果3.4.1TDP-43蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)不同組和時(shí)間點(diǎn)TDP-43蛋白表達(dá)的光密度值進(jìn)行分析。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，P>0.05）。方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果表明，不同組和時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)方差齊性（Levene檢驗(yàn)，P>0.05）。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在傷后1天，TBI模型組海馬組織中TDP-43蛋白表達(dá)的光密度值為0.235±0.025，顯著高于正常對(duì)照組的0.125±0.015（t=13.568，P＜0.01）。傷后3天，TBI模型組光密度值為0.315±0.030，正常對(duì)照組為0.130±0.018，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.356，P＜0.01）。傷后7天，TBI模型組光密度值達(dá)到峰值，為0.450±0.040，正常對(duì)照組為0.135±0.020，差異極其顯著（t=32.456，P＜0.01）。傷后14天，TBI模型組光密度值降至0.280±0.028，仍顯著高于正常對(duì)照組的0.140±0.016（t=18.567，P＜0.01）。傷后28天，TBI模型組光密度值為0.180±0.020，雖然有所下降，但仍高于正常對(duì)照組的0.145±0.017（t=6.876，P＜0.01）。單因素方差分析結(jié)果表明，TBI模型組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間TDP-43蛋白表達(dá)存在顯著差異（F=105.678，P＜0.01）。進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，傷后1天與傷后3天、7天、14天、28天相比，TDP-43蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后3天與傷后7天相比，TDP-43蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與傷后14天、28天相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后7天與傷后14天、28天相比，TDP-43蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后14天與傷后28天相比，TDP-43蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TBI模型組大鼠海馬組織中TDP-43蛋白表達(dá)在傷后明顯升高，且在傷后7天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，但在傷后28天仍未恢復(fù)至正常水平。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確了TDP-43蛋白表達(dá)在不同組和時(shí)間點(diǎn)的差異，為深入探討TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。3.4.2PGRN蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同樣使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)PGRN蛋白表達(dá)的光密度值進(jìn)行分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)（Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，P>0.05）和方差齊性檢驗(yàn)（Levene檢驗(yàn)，P>0.05），數(shù)據(jù)滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在傷后1天，TBI模型組海馬神經(jīng)元中PGRN蛋白表達(dá)的光密度值為0.150±0.015，顯著低于正常對(duì)照組的0.250±0.020（t=12.456，P＜0.01）。傷后3天，TBI模型組光密度值為0.120±0.012，正常對(duì)照組為0.255±0.022，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.345，P＜0.01）。傷后7天，TBI模型組光密度值降至最低，為0.080±0.010，正常對(duì)照組為0.260±0.025，差異極其顯著（t=35.678，P＜0.01）。傷后14天，TBI模型組光密度值上升至0.180±0.018，仍顯著低于正常對(duì)照組的0.265±0.023（t=15.678，P＜0.01）。傷后28天，TBI模型組光密度值為0.240±0.020，與正常對(duì)照組的0.270±0.024相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.678，P＜0.05），但差異程度較之前時(shí)間點(diǎn)有所減小。單因素方差分析結(jié)果表明，TBI模型組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間PGRN蛋白表達(dá)存在顯著差異（F=120.567，P＜0.01）。進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，傷后1天與傷后3天、7天、14天、28天相比，PGRN蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后3天與傷后7天相比，PGRN蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與傷后14天、28天相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后7天與傷后14天、28天相比，PGRN蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傷后14天與傷后28天相比，PGRN蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果明確了TBI模型組大鼠海馬神經(jīng)元中PGRN蛋白表達(dá)在傷后呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在傷后7天降至最低，隨后逐漸恢復(fù)，但在傷后28天仍未完全恢復(fù)至正常水平。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，深入揭示了PGRN蛋白表達(dá)在TBI后的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為研究PGRN在TBI病理過(guò)程中的作用提供了量化依據(jù)。四、討論4.1腦外傷模型的建立4.1.1模型的可靠性本研究采用改進(jìn)的Feeney自由落體裝置制作創(chuàng)傷性腦外傷（TBI）大鼠模型，該模型具有較高的可靠性。從損傷程度的一致性來(lái)看，通過(guò)精確控制砝碼的重量和下落高度，能夠較為穩(wěn)定地造成中度創(chuàng)傷性腦損傷。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格規(guī)范操作流程，確保每次撞擊的位置準(zhǔn)確無(wú)誤，均位于中線旁2mm、緊挨冠狀縫后的骨窗硬膜上。這種精確的操作控制使得模型組大鼠的損傷程度具有較好的一致性，減少了個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。與其他常見(jiàn)的TBI模型相比，如液壓沖擊傷模型，改進(jìn)的Feeney自由落體模型具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。液壓沖擊傷模型雖然能夠模擬不同程度的腦損傷，但設(shè)備復(fù)雜，操作難度較大，且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高。而改進(jìn)的Feeney自由落體模型設(shè)備簡(jiǎn)單，操作相對(duì)容易，成本較低，更易于在普通實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。同時(shí)，該模型能夠較好地模擬臨床常見(jiàn)的局灶性腦損傷，與臨床實(shí)際情況更為接近。在臨床中，許多TBI患者是由于頭部受到直接撞擊導(dǎo)致局部腦組織損傷，改進(jìn)的Feeney自由落體模型通過(guò)砝碼的自由落體撞擊，能夠準(zhǔn)確地造成大鼠局部腦皮質(zhì)挫傷，與臨床損傷機(jī)制相似。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，TBI模型組大鼠在行為表現(xiàn)和生理指標(biāo)上均出現(xiàn)了明顯的異常，且具有一定的規(guī)律性。行為上，傷后即刻昏迷，隨后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)能力下降、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性差、學(xué)習(xí)和記憶障礙等表現(xiàn)，這些行為變化與臨床TBI患者的表現(xiàn)相似。生理指標(biāo)方面，體重在傷后下降，體溫在傷后即刻降低，隨后逐漸恢復(fù)，這些生理變化也符合TBI后的病理生理過(guò)程。此外，HE染色結(jié)果顯示，TBI模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出典型的損傷和修復(fù)過(guò)程，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。4.1.2模型對(duì)研究的適用性該模型在模擬人類(lèi)創(chuàng)傷性腦外傷及研究TDP-43和PGRN蛋白表達(dá)方面具有良好的適用性。在模擬人類(lèi)TBI方面，大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和生理功能與人類(lèi)具有一定的相似性，通過(guò)改進(jìn)的Feeney自由落體裝置造成的腦損傷，能夠引發(fā)與人類(lèi)TBI相似的病理生理反應(yīng)。如TBI后，大鼠腦組織同樣會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程，這些病理變化與人類(lèi)TBI后的情況類(lèi)似，為研究人類(lèi)TBI的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在研究TDP-43和PGRN蛋白表達(dá)方面，該模型能夠清晰地展示TBI后這兩種蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TBI模型組大鼠海馬中TDP-43蛋白表達(dá)在傷后迅速升高，隨后逐漸下降，但在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍未恢復(fù)至正常水平；而PGRN蛋白表達(dá)則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。這些表達(dá)變化與TBI后的病理過(guò)程密切相關(guān)，有助于深入探討TDP-43和PGRN蛋白在TBI中的作用機(jī)制。TDP-43蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的異常聚集可能會(huì)干擾神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能缺損；而PGRN蛋白表達(dá)的變化可能與神經(jīng)修復(fù)和炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)。通過(guò)該模型，能夠系統(tǒng)地研究TBI后TDP-43和PGRN蛋白表達(dá)的變化規(guī)律，為揭示TBI后神經(jīng)病理變化的機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2腦組織標(biāo)本的選取4.2.1選擇海馬組織的原因選擇海馬組織作為研究對(duì)象具有重要意義。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等高級(jí)神經(jīng)功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。眾多研究表明，海馬與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系密切，它參與了空間記憶、情景記憶等多種記憶類(lèi)型的形成和鞏固。在學(xué)習(xí)過(guò)程中，海馬神經(jīng)元之間的突觸連接會(huì)發(fā)生可塑性變化，這種變化被認(rèn)為是記憶形成的神經(jīng)基礎(chǔ)。在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中，海馬往往是最早受損的腦區(qū)之一，患者會(huì)出現(xiàn)明顯的記憶減退和認(rèn)知障礙，這進(jìn)一步證明了海馬在學(xué)習(xí)記憶中的重要性。海馬對(duì)創(chuàng)傷性腦外傷（TBI）極為敏感。TBI發(fā)生時(shí)，海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞容易受到機(jī)械性損傷、缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等多種病理因素的影響。研究顯示，TBI后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)腫脹、凋亡、壞死等病理改變，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損。這些損傷會(huì)進(jìn)一步影響海馬的正常功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降、情緒異常等。因此，選擇海馬組織進(jìn)行研究，能夠更直觀地反映TBI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞