ICS07.080

CCSB44

35

福建省地方標準

DB35/T2132—2023

實驗用秀麗隱桿線蟲飼育技術

ExperimentalCaenorhabditiselegans—Rearingtechnique

2023-10-25發(fā)布2024-01-25實施

福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB35/T2132—2023

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術語和定義.........................................................................1

4人員...............................................................................1

5環(huán)境與設施.........................................................................2

6引種與保種.........................................................................2

7繁育...............................................................................3

8飼養(yǎng)...............................................................................4

9消毒與感染防控.....................................................................6

10廢棄物處理........................................................................6

11記錄與檔案........................................................................6

附錄A（資料性）儀器設備及耗材......................................................7

附錄B（資料性）培養(yǎng)基及試劑........................................................9

附錄C（資料性）雄蟲及雌雄同體蟲的形態(tài)結構圖........................................11

附錄D（資料性）線蟲的生長周期.....................................................13

附錄E（資料性）OP50的培養(yǎng)........................................................14

附錄F（資料性）線蟲易感染的微生物和寄生蟲..........................................15

參考文獻.............................................................................16

I

DB35/T2132—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由福建上源生物科學技術有限公司提出。

本文件由福建省科技廳歸口。

本文件起草單位：福建上源生物科學技術有限公司、福建農林大學、福建師范大學。

本文件主要起草人：趙培、張壬輝、陳嵐彬、張積森、林晨韜、鄭惠、卞文印、蔡棟靈。

II

DB35/T2132—2023

實驗用秀麗隱桿線蟲飼育技術

1范圍

本文件規(guī)定了實驗用秀麗隱桿線蟲（以下簡稱“線蟲”）飼育過程中人員、環(huán)境與設施、引種與保

種、繁育、飼養(yǎng)、消毒與感染防控、廢棄物處理、記錄與檔案等技術要求。

本文件適用于實驗用秀麗隱桿線蟲的飼育。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法

GB14925—2010實驗動物環(huán)境及設施

GB/T34791—2017實驗動物質量控制要求

JG/T292潔凈工作臺

SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans

秀麗隱桿線蟲屬于線形動物門（Nemathelminthes），線蟲綱（Nematoda），小桿線蟲目（Rhabditida），

廣桿線蟲屬（Caenorhabditis），食細菌的線形動物，對人體無毒無害，安全的實驗動物。

大腸埃希氏菌OP50EscherichiacoliOP50（E.coliOP50）

尿嘧啶缺陷型大腸桿菌。

幼蟲期線蟲larvalphaseCaenorhabditiselegans

未性成熟的線蟲，分為一齡（L1）、二齡（L2）、三齡（L3）、四齡（L4）四個時期。

耐受期線蟲dauerphaseCaenorhabditiselegans

L2時期線蟲在逆境條件下發(fā)育而成的滯育線蟲。

4人員

一般要求

1

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按照GB/T34791—2017中規(guī)定的人員技術指標執(zhí)行。

管理人員

包括設施負責人、技術負責人和質量負責人，應經過專業(yè)培訓，掌握線蟲的生理、生態(tài)習性和專業(yè)

知識，滿足崗位技能要求。

飼育人員

身體健康，并接受過專業(yè)培訓，熟練掌握操作技能。

5環(huán)境與設施

設施

設施的外部環(huán)境、工藝布局及其暖通空調、給排水、供電照明、通訊監(jiān)控、消防等按GB14925—2010

中普通環(huán)境的要求執(zhí)行。

設備及試劑耗材

飼育所需的儀器設備及耗材見附錄A。

區(qū)域布局

5.3.1布局

各區(qū)域之間應規(guī)定合理的人員流動路線，輔助功能區(qū)和飼育區(qū)應分開。

5.3.2輔助功能區(qū)

包括稱量區(qū)、滅菌區(qū)、制板區(qū)、食物制備區(qū)、廢棄物品處理區(qū)等。

5.3.3飼育區(qū)

用于線蟲飼養(yǎng)繁育的區(qū)域。

環(huán)境

5.4.1技術指標

飼育區(qū)環(huán)境指標按照GB14925—2010的相關規(guī)定執(zhí)行。

5.4.2監(jiān)測方法

設施環(huán)境指標監(jiān)測方法按照GB14925—2010的相關規(guī)定執(zhí)行。

6引種與保種

引種

滿足以下要求：

2

DB35/T2132—2023

——應從正規(guī)種質資源庫進行引種，以獲取遺傳背景明確的線蟲種質資源；

——引種過程應建立包括種名、來源、引種日期等信息的檔案；

——境外引種時應按國家相關規(guī)定執(zhí)行。

保種

6.2.1線蟲的選取

應選取L1幼蟲期線蟲或耐受期線蟲進行長期保種。

6.2.2保種條件

溫度低于﹣80℃。

6.2.3保種方法

線蟲的保種應采用超低溫凍存技術，應滿足以下要求：

——凍存液選用S緩沖液1和含有30％甘油的S緩沖液2，詳細配方見附錄B；

——凍存器材選用凍存管、梯度降溫盒；

——凍存液中收集的線蟲密度宜為每1ml凍存液中包含600～1000只線蟲，每支凍存管中分裝1

mL；

——凍存管在﹣80℃冰箱的臨時保存區(qū)梯度降溫至﹣80℃；

——凍存管梯度降溫完成后轉移至﹣80℃冰箱或液氮罐的長期保存區(qū)。

6.2.4凍存合格檢測標準

凍存24h后，取同一批次凍存的線蟲，在37℃半融化后，迅速轉移到線蟲生長培養(yǎng)基（NGM）培養(yǎng)

皿中觀察，復蘇后的線蟲存活率應高于20％。

6.2.5保種年限

根據需求，宜選擇以下方式進行保存：

——在﹣80℃冰箱能保存10年；

——在液氮中能長期保存。

7繁育

自體受精繁育

線蟲有雄性及雌雄同體兩種性別。雌雄同體蟲既能產生精子，又能產生卵子，可以在無雄蟲存在的

情況下進行自體受精繁育。

交配繁育

7.2.1交配線蟲的選取

雄蟲

3

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體長約為0.8mm，在22℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天的年輕雄蟲（附錄C）。在正常培養(yǎng)條件下，雄蟲在群

體中的比例為1‰～3‰。為獲取足夠的交配雄蟲，宜將L4幼蟲期線蟲中的雌雄同體線蟲置于30℃條件

下熱激6h～8h，后代中將產生2％～3％的雄蟲。

雌雄同體

整體外觀符合線蟲的顯微形態(tài)學表型的年輕雌雄同體成蟲（附錄C）。

7.2.2交配原則

應滿足以下要求：

——雄蟲和雌雄同體的比例按為1∶1或2∶1；

——交配兩天后，待培養(yǎng)皿中的子代發(fā)育到L4時期之前，將用于雜交的親本雄蟲盡數挑出。

7.2.3交配成功的判定

交配成功時，后代中應有至少3％雄蟲。

繁育合格指標

7.3.1卵的質量

卵為顆粒狀，鈍橢圓形，飽滿且富有光澤；卵內幼胚應具備與發(fā)育時期一致的正常的顯微形態(tài)學特

征。

7.3.2生長周期

22℃且相對濕度范圍為40％～80％培養(yǎng)條件下線蟲的生長周期如附錄D所示。

7.3.3特征及表型

繁育合格的線蟲應滿足以下要求：

——整體外觀符合線蟲的顯微形態(tài)學表型（附錄C和附錄D）；

——無行動障礙，爬行軌跡呈正弦曲線；

——L4階段的雌雄同體線蟲在腹側中心能看到一個清晰的半圓形亮斑；

——L4階段的雄蟲尾部尖端向前擴展，至成蟲發(fā)育為帶交配器官的獨特扇形尾部。

7.3.4繁殖能力

每只雌雄同體蟲自交產250～300只后代，雄蟲和雌雄同體蟲雜交產950～1050只后代。

8飼養(yǎng)

固體飼養(yǎng)

8.1.1培養(yǎng)基及食物

培養(yǎng)基及食物的要求如下：

——固體飼養(yǎng)應用NGM培養(yǎng)基（見附錄B）；

——線蟲以大腸埃希氏菌OP50（以下簡稱OP50）為食，培養(yǎng)方法見附錄E。

4

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8.1.2線蟲轉板

根據需要，宜采用以下方式進行線蟲轉板：

——使用挑蟲器在固體培養(yǎng)基上挑取線蟲至新的OP50-NGM培養(yǎng)皿中；

——用滅菌的解剖刀，從OP50-NGM培養(yǎng)皿中切取帶線蟲的瓊脂塊，置于新的OP50-NGM培養(yǎng)皿中。

8.1.3容器選擇

根據實驗需求，宜選φ3.5cm、φ6cm、φ9cm等大小的培養(yǎng)皿。

8.1.4飼養(yǎng)密度

每1cm2OP50菌苔上飼養(yǎng)的線蟲數量宜為2只，培養(yǎng)3d～5d后（食物耗盡前）進行轉板。

液體飼養(yǎng)

8.2.1培養(yǎng)液及食物

培養(yǎng)液及食物的要求如下：

——液體飼養(yǎng)應用S培養(yǎng)基（見附錄B）；

——線蟲以OP50為食，培養(yǎng)方法見附錄E。

8.2.2線蟲轉移

應使用移液器進行轉移，且移液器的吸頭宜為玻璃材質。

8.2.3容器選擇

根據實驗需求，宜選無菌三角瓶、無菌24孔板、96孔板等。

8.2.4飼養(yǎng)密度

飼養(yǎng)密度滿足以下要求：

——每1mLS培養(yǎng)基中添加50mg的OP50，能供2只線蟲生長3d～5d；

——培養(yǎng)過程應注意觀察線蟲生長狀況，并根據需要在食物耗盡前添加OP50或進行轉移。

飼養(yǎng)的技術指標

8.3.1操作要求

操作符合以下要求：

——挑取線蟲時，動作應輕柔細致，從線蟲的腹側下方輕輕挑取，避免挑蟲器損傷線蟲；

——每次挑取線蟲前，挑蟲器應在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻3s～5s后使用；

——線蟲的轉板及轉移操作應在潔凈工作臺中進行。

8.3.2飼養(yǎng)條件

飼養(yǎng)的各類條件應符合以下要求：

——生長溫度在15℃～25℃之間，最常使用的培養(yǎng)溫度是20℃；

——相對濕度在40％～80％；

——光照不超過30lx；

5

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——固體飼養(yǎng)的線蟲置于潔凈的恒溫培養(yǎng)箱中，液體飼養(yǎng)的線蟲置于恒溫搖床中，恒溫搖床的震

蕩頻率為100r/min～200r/min。

9消毒與感染防控

消毒管理

定期對設施設備進行清潔消毒。

微生物與寄生蟲處理

在人工飼育過程中，如線蟲表現(xiàn)出被微生物或寄生蟲感染的表型，對感染線蟲進行銷毀處理。線蟲

易感染的微生物和寄生蟲見附錄F。

10廢棄物處理

產生的生物廢棄物和污水按照SN/T4835的規(guī)定進行無害化處理，其他實驗室廢棄物按照相關規(guī)定

進行處理。

11記錄與檔案

記錄

記錄培養(yǎng)溫度、相對濕度、線蟲發(fā)育情況等。

標識

飼育容器應標記飼育日期、繁育方法、飼育條件等。

檔案

應滿足以下要求：

——建立人員培訓計劃和培訓檔案；

——建立設備維護、使用檔案；

——建立線蟲凍存檔案，記錄凍存時間、編號；

——檔案保存不少于3年。

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A

A

附錄A

（資料性）

儀器設備及耗材

A.1儀器設備

A.1.1恒溫培養(yǎng)箱

培養(yǎng)箱材質無毒、無害、無放射性，并配有溫度控制系統(tǒng)，方便在0℃～60℃溫度范圍內調節(jié)箱內

溫度。

A.1.2體視顯微鏡

放大倍數在5～50倍之間。

A.1.3恒溫搖床

搖床材質無毒、無害、無放射性。配有溫度控制系統(tǒng)，能夠在10℃～60℃溫度范圍內調節(jié)箱內溫

度；震蕩頻率調節(jié)范圍為0r/min～300r/min。

A.1.4高壓滅菌鍋

高壓滅菌鍋材質耐熱、耐腐蝕、無放射性，最高滅菌工作溫度不低于130℃。

A.1.5移液器

能夠精確地移取一定體積的液體。

A.1.6酒精燈

防爆不銹鋼酒精燈。

A.1.7挑蟲器

挑蟲器由鉑金絲和手柄兩部分組成，鉑金絲一端壓成鏟形，另一端固定在手柄上。

A.1.8潔凈工作臺

潔凈工作臺的性能達到JG/T292中的規(guī)定。

A.1.9﹣80℃冰箱

提供﹣80℃條件的超低溫冰箱。

A.1.10液氮罐

液氮儲存罐。

A.2耗材

A.2.1培養(yǎng)皿

無毒、無害、無放射性、無菌。

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A.2.2多孔板

無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、無菌。常用規(guī)格有96孔板、24孔板和12孔板等。

A.2.3三角瓶

無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、無菌。常用規(guī)格有50mL、150mL、500mL、1000mL等。

A.2.4梯度降溫盒

提供每分鐘降低1℃的冷卻速率，能夠成功進行低溫凍存和恢復。

A.2.5凍存管

用于﹣80℃和液氮中長期儲存。

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B

B

附錄B

（資料性）

培養(yǎng)基及試劑

B.1雙蒸水

配制培養(yǎng)基及試劑的雙蒸水達到GB/T6682—2008中三級水或以上的規(guī)格要求。

B.2LB培養(yǎng)基

B.2.1LB液體培養(yǎng)基

1g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，1g氯化鈉（NaCl），加入雙蒸水定容至100mL，121°C、0.107MPa

滅菌20min。

B.2.2LB固體培養(yǎng)基

1g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，1gNaCl，2g瓊脂，加入雙蒸水定容至100mL，用1M氫氧化鈉（NaOH）

調pH到7.5，121°C、0.107MPa滅菌20min。倒入無菌培養(yǎng)皿中，凝固冷卻。

B.3NGM培養(yǎng)基

2.5g酪蛋白胨，17g瓊脂粉，3gNaCl，加入975mL的雙蒸水，121°C、0.107MPa滅菌20min。

冷卻至55℃后，加入下列溶液（膽固醇溶液過濾除菌，其余溶液在121°C、0.107MPa滅菌20min）。

——1mL5mg/mL溶解于無水乙醇的膽固醇溶液

——1mL1M氯化鈣（CaCl2）溶液

——1mL1M硫酸鎂（MgSO4）溶液

——25mL1M磷酸鹽溶液（108.3g磷酸二氫鉀（KH2PO4），35.6g磷酸氫二鉀（K2HPO4），加

入1000mL的雙蒸水）

在培養(yǎng)基凝固前分裝至無菌培養(yǎng)皿中，從而制成空白的NGM皿。

B.4M9溶液

6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4），3gK2HPO4，5gNaCl，0.25g七水硫酸鎂（MgSO4?7H2O），加入雙蒸

水定容至1000mL，121°C、0.107MPa滅菌20min。

B.5凍存液

B.5.1S緩沖液1

129mL0.05MK2HPO4，871mL0.05MKH2PO4，5.85gNaCl，121°C、0.107MPa滅菌20min。

B.5.2S緩沖液2（含30％甘油）

700mLS緩沖液1，300mL無菌甘油，混勻。

B.6液體培養(yǎng)基

B.6.1S-basal基礎培養(yǎng)液

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5.85gNaCl，1gK2HPO4，6gKH2PO4，加入999mL的雙蒸水，121°C、0.107MPa滅菌20min，再

加入1mL5mg/mL溶解于無水乙醇的膽固醇溶液（過濾除菌）。

B.6.2微量金屬溶液

1.86g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA?Na2），0.69g七水硫酸亞鐵（FeSO4?7H2O），0.2g四水氯化錳

（MnCl2?4H2O），0.29g七水硫酸鋅（ZnSO4?7H2O），0.025g五水硫酸銅（CuSO4?5H2O），加雙蒸水定容

至1000mL，121°C、0.107MPa滅菌20min，避光保存。

B.6.3S培養(yǎng)基

1LS-basal基礎培養(yǎng)液，10mL1MpH6.0檸檬酸鉀溶液，10mL微量金屬溶液，3mL1MCaCl2，

3mL1MMgSO4，上述所有溶液均在121°C、0.107MPa滅菌20min，并在無菌條件下混勻。

10

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C

C

附錄C

（資料性）

雄蟲及雌雄同體蟲的形態(tài)結構圖

C.1雄蟲

雄蟲的形態(tài)結構如圖C.1所示。

標引序號說明：

A——成年雄蟲解剖模式圖；

B——相差干涉顯微鏡拍攝的成年雄蟲全長；

C——放大的生殖腺遠端；

D——放大的雄蟲尾部。

注：圖中標尺為0.1mm。

圖C.1秀麗隱桿線蟲雄蟲（成蟲）形態(tài)結構

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C.2雌雄同體蟲

雌雄同體蟲的形態(tài)結構如圖C.2所示。

標引序號說明：

A——用相差干涉顯微鏡拍攝的雌雄同體蟲；

B——雌雄同體蟲解剖模式圖。

注：圖中標尺為0.1mm。

圖C.2秀麗隱桿線蟲雌雄同體（成蟲）形態(tài)結構

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D

D

附錄D

（資料性）

線蟲的生長周期

卵：線蟲的胚胎發(fā)生在母體子宮中就已開始，從母體產出的卵大約處在30個細胞期。胚胎發(fā)生完成

后孵化出一齡幼蟲（L1），約550個細胞。每個雌雄同體成蟲能產250～300個卵，用解剖鏡觀察NGM培養(yǎng)

皿上的卵，為顆粒狀，鈍橢圓形，富有光澤。

幼蟲：在22℃的培養(yǎng)條件下，野生型秀麗隱桿線蟲產出的卵經過大概9h即孵化成L1。線蟲的幼蟲

分為4個階段，分別為一齡、二齡、三齡及四齡幼蟲（L1，L2、L3、L4）。從L1發(fā)育至L4需經歷三次蛻

皮：L1發(fā)育至L2約需12h，L2發(fā)育至L3約需8h，L3發(fā)育至L4約需8h。當遇到群體密度很大且食物缺乏，

或溫度偏高等不利環(huán)境條件時，L2不發(fā)生蛻皮，不發(fā)育為L3，而是成為耐受期線蟲，耐受期線蟲是為抵

御不良環(huán)境，如干燥等條件特化而成。在解剖鏡下，耐受期線蟲體型比L3小，一般不動，但遇干擾，則

蠕動得比L3快，耐受期線蟲能生存幾個月。當食物條件恢復后，耐受期線蟲不經過L3幼蟲，直接發(fā)育成

L4幼蟲，這一特點能用于線蟲的短期保存。

成蟲：L4最后一次蛻皮成為年輕的成蟲約需10h，年輕的成蟲最后發(fā)育成成熟的成蟲約需8h。野生

型秀麗隱桿線蟲的雌雄同體成蟲在20℃培養(yǎng)條件下，壽命大概為21天。線蟲在25℃的生長速度是15℃

的2.1倍，在20℃的生長速度是15℃的1.3倍。

線蟲的生長周期如圖D.1所示。

圖D.1線蟲的生長周期

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E

E

附錄E

（資料性）

OP50的培養(yǎng)

線蟲是以OP50為食，OP50具有尿嘧啶缺陷，在NGM培養(yǎng)皿上不可無限生長。LB液體培養(yǎng)基即能滿足

OP50的繁殖。LB瓊脂固體培養(yǎng)皿能用于OP50菌株單克隆的劃線分離和保存。培養(yǎng)皿可置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

OP50的擴增：取出保存OP50單克隆的培養(yǎng)皿，用無菌牙簽挑取一個克隆到100mLLB液體培養(yǎng)基中，

于37℃搖床過夜振蕩培養(yǎng)(220r/min)。培養(yǎng)好的OP50菌液即能作為線蟲的食物使用，并能在4℃保存

4周。

OP50的質量控制：每批次擴增的OP50均進行一次質量檢測。質量符合如下要求：OP50菌落呈圓形，

表面光滑濕潤而具閃光，微凸起，邊緣整齊。

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F

F

附錄F

（資料性）

線蟲易感染的微生物和寄生蟲

線蟲易感染的微生物和寄生蟲見表F.1。

表F.1線蟲易感染的微生物和寄生蟲

項目