分子生物學實驗

1.幸免長時刻的培養(yǎng)，大腸桿菌一樣培養(yǎng)12個小時就能夠擬瞰克隆子進行驗證了。

要緊是因為培養(yǎng)時刻過長，專門是含有Amp抗性的質(zhì)粒。重組菌能夠分泌酶降解Amp,

造成平板中局部Amp濃度太低。其他未重組菌在Amp存在的情形下只是生長受抑制而非死

亡，當Amp濃度降低時就能夠生長了。衛(wèi)星菌落，由于陽性菌落大量分解抗生素，造成周圍區(qū)

域抗生素濃度降低，則無抗性的菌也生長出來了。一句話，你的板子培養(yǎng)時刻過長了。這是am

p抗性質(zhì)粒特有的衛(wèi)星菌落，確實是又抗性的Ecol分泌beta內(nèi)酰胺酶分解周圍的amp,從而

使沒有抗性的ecoli生長。

2.3.乙醇能夠排除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來。Na+之類的平穩(wěn)離子

能夠與這些帶電基團結(jié)合，在沉淀形成部位降低多核苗酸睫之間的排斥作用。因此只有在陽離

子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時才會發(fā)生乙醇沉淀。1.什么原因用無水乙醇沉淀DN

A?

用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是能夠任意比

和水相混溶,乙醇與核酸可不能起任何化學反應,對DNA專門安全,因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)固存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分

子，使DNA失水而易于聚合。一樣實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇

的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比

95%乙醇昂貴1然而加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而

DNA缺失也增大，專門用多次乙醇沉淀時，就會阻礙收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時

可用95%乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也能夠用0.6倍體積的異丙醇

選擇性沉淀DNAe一樣在室溫下放置15-30分鐘即可。

2.在用乙醇沉淀DNA時，什么原因一定要加NaAc或NaCI至最終濃度達0.1~0.25mol/

L?

在pH為8左右的溶液中,DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCI,使Na

+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成D

NA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,如此就造

成DNA沉淀不完全,當加入的鹽溶液濃度太高時，其成效也不行。在沉淀的DNA中，由于過

多的鹽雜質(zhì)存在，阻礙DNA的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀。用無水乙醇沉淀DN

A,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是能夠任意匕次口水相混溶，乙醇與核酸

可不能起任何化學反應，對DNA專門安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)固存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分

子，使DNA失水而易于聚合。一樣實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇

的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比

95%乙醇昂貴X然而加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而

DNA缺失也增大，專門用多次乙醇沉淀時，就會阻礙收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時

可用95%乙醇代替無水乙酵,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也能夠用0.6倍體積的異丙醇

選擇性沉淀DNA。一樣在室溫下放置15?30分鐘即可。1。DNA不溶于乙醇

2。乙醇能夠吸附水分子（極性相同），使得溶液中相對的水分子減少,增大了DNA在水中

的相對濃度。

3。附：乙醇沉淀DNA需要鹽離子,用金屬離子屏蔽DNA上磷酸的負電荷，降低DNA分

子間的斥力，才能沉淀完全。

4.溶菌酶是一種堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰胺殘基和芳香族氨，酸的比例較高，

酶的活動中心是天冬氨酸和骸酸。

溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶,稱包胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解

酶，它專一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的,4鍵，從而

破壞細菌的細胞壁，使之松馳而失去對細胞的愛護作用，最終使細菌溶解死亡。也能夠直截了

當破壞革蘭氏陽性菌的細胞壁，而達到殺菌的作用，這要緊是因為革蘭氏陽性細菌的細胞壁要

緊是由胞壁質(zhì)和磷酸質(zhì)組成，其中胞壁質(zhì)是由雜多糖和多肽組成的糖蛋白，這種多糖正是由N-

乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的p-1,4鍵聯(lián)結(jié)的。對某些革蘭氏陰性菌，如埃希氏大

腸桿菌，傷寒沙門氏菌，也會受到溶菌酶的破壞。溶菌酶是母乳中能愛護嬰兒免遭病毒感染的

一種有效成分，它能通過消化道而保持其活性狀態(tài)，溶菌酶還能夠使嬰兒腸道中大腸桿菌減

少，促進雙歧桿菌的增加，還能夠促進蛋白質(zhì)的消化吸取

5.酚、氮仿是變性蛋白質(zhì)的（由于苯酚能溶進少量水缺失DNA,因此與氯仿一起使用，減

少DNA缺失）

異戊醇是消泡劑（蛋白質(zhì)變性中常常產(chǎn)動氣泡，會缺失DNA,因此需消泡）抽提DNA去

除蛋白質(zhì)時，如何樣使用酚與氯仿較好？猷與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當?shù)鞍姿?/p>

液與酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變

性。通過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面,從而

與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的

酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互

溶，大約10%~15%的水溶解在酚相中，因而缺失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作

用不如酚成效好，但氯仿與水不相混溶，可不能帶走因此在抽提過程中，混合使用酚與

DNAe

氯仿成效最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第

二次變性蛋白質(zhì)，現(xiàn)在一起將酚帶走。也能夠在第二次抽;是時，將酚與氯仿混合（1：1）使用。

10.什么原因用酚與氯仿抽提DNA時,還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合

平均，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)動氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。

加入異戊醇能降低分子表面張力,因此能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一樣采納氯仿與異戊酵

為24:1之比。也可采納酚、氯仿與異戊醇之比為25:24:1（不必先配制，可在臨用前把一份

酚加一份24:1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變

性蛋白相以及下層有機溶劑相堅持穩(wěn)固。1.酚/氯仿/異戊醇的作用：從核酸樣品中除去蛋白質(zhì)經(jīng)

常常使用酚和氯仿都能使蛋白質(zhì)變性，并使其溶于有機相或中間相內(nèi)，而異戊醇則有助于排除

抽提過程中顯現(xiàn)的氣泡。

6邛-筑基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成配，幸免褐變,使酚容易去除

7.

8.講得對。乃％乙醇清洗DNA的目的是脫鹽的。

其機理如下：75%乙醇中含有25%的水，這部分水能夠溶解和DNA沉淀中混有的、DNA

沉淀前加入的鉀鹽（或鈉鹽〔但同時也會溶解（缺失）少部分DNA（鹽離子比DNA更易溶于

水中X為了減少DNA缺失，因此用含量較高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇X蛋白質(zhì)、糖、

脂類等都能夠溶于75%酒精，而DNA不溶

9.

10.RNaseA的作用是使RNA降解，減少提取得到的DNA中的RNA,以便減少對后續(xù)實

驗的阻礙。RNaseH是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。消化mRNA用的。RNaseH,即RibonucleaseH,中

文名為核糖核酸酶H,是一種核糖核酸內(nèi)切酶，能夠特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RN

A,RNaseH不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA中的磷酸二酯鍵，即不能消化單鏈或雙鏈DN

A或RNA。特點：特異性消化DNA-RNA雜合鏈中的RNA,常用于cDNA第二鏈的合成

編輯本段用途

?在cDNA第二鏈合成前去除mRNA?DNA-RNA雜交體的鑒定?在Oligo（dT）

存在下去除mRNA的poly（A）尾

11.當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，

質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性

而呈絮狀，離心時可沉淀下來。破細胞的要緊是堿，而不是SDS,因此才叫堿法抽提。0.2NN

aOH:是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌依舊哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬

時就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化

所導致。由于質(zhì)粒和細菌染色體的拓撲結(jié)構(gòu)不同，變性時前者盡管兩條鏈分離，卻仍舊纏繞在

一起不分開；但后者完全變性分甚至顯現(xiàn)斷裂。因此，在裂解細菌時要注意：

第一，時刻不能過長，因為在如此的堿性條件下DNA片斷會慢慢斷裂；

第二，混合必須輕柔，不然DNA也會斷裂。

1%SDS（十二烷基磺酸鈉）：是一種陰離子表面活慚I」，它既能使細菌細胞裂解,又能使

一些蛋白質(zhì)變性.

12.這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Nd,得至!JPDS（十二烷基磺酸鉀）沉

淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量

沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀。當加入pH4.8的

酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液pH值復原較低的近中性水平常，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈

可迅速復性復原雙鏈結(jié)構(gòu)，然而主染色體DNA則難以復性。

SDS遇到鉀離子后變成十二烷基硫酸鉀（potassiumdodecylsulfate,PDS）,而PDS是不

溶于水的，而高濃度的鹽使得沉淀更完全。SDS極易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一

個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。

同時，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合，由于大腸桿菌的基因組DNA專門長，專門容易和

變性的蛋白質(zhì)纏繞在一起。在離心時，大部分主染色體與細胞碎片，變性蛋白質(zhì)等纏繞一起被

沉淀，而復性的質(zhì)粒DNA以可溶性狀態(tài)留在上清夜中。

13.所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應條件不同而產(chǎn)生的切斷與原先認識序列不同

的位點的現(xiàn)象，也確實是講產(chǎn)生Star活性后，不但能夠切斷特異性的識別位點，還能夠切斷非

特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。因此講Star活性與粘端變平端沒關

系。另外，Star活性除了與酶本身的性質(zhì)有關外，與甘油濃度，pH值及離子濃度有關。

一樣正規(guī)廠家生產(chǎn)的限制酶出廠前都做有關的檢測，buffer體系也都做了相應的考慮,因此正

常情形下酶切,能夠先不必考慮Star活性的咨詢題。一旦顯現(xiàn)底物DNA不行切斷,需要

增加酶量或延長反應時刻時，如果使用的是易產(chǎn)生StaR活性的限制酶切，一樣優(yōu)先考慮增加酶

量，而不是延長反應時刻，換句話講，延長時刻比增加酶量更易產(chǎn)生Star活性。另外，實

際上幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都可能產(chǎn)生Star活性。但目前Star活性對實際實驗室操作過程中

的阻礙并不太大，能夠先不考慮。一樣來講，限制性內(nèi)切存在嚴格的識別在序列特異性,但某

些條件改變，會使其對識別序列特異性的放寬，而導致在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，限制性內(nèi)切酣

表現(xiàn)的這種活性稱為星活性，或笫二活性，在名稱右上角加一星號表示。

產(chǎn)生星活性的條件

①甘油濃度

②離子強度高鹽緩沖液酶降低鹽

③pH值7.5~8.5產(chǎn)生

④有機溶劑DMSO(二甲亞颯)1~2%(V/V)

⑤二價陽離子Mn2+代替Mg2+

⑥酶與DNA的比例

酶與DNA比為(50U/ug)產(chǎn)生星活性。為了防止星活性的顯現(xiàn)，所有限制性內(nèi)切酶反應在

標準條件下(專門是pH、離節(jié)雖度、二價離子濃度的條件下)進行。

某些限制性內(nèi)叨酶誘導產(chǎn)生星活性的反應條件

酶誘導星活性條件

AvalA,B,D

EcoRIA,B,D,E,F

HdefflB,D

HhalB,D.G

BamHIA,B,C,D,E,H

A.乙二醇(45%);B.甘油(11~20%);C.乙醇(12%);

D.高酶：DNA比值()25U/pg);E.Mn2+代替Mg2+;

F.pH8.5;G.DMSO(8%)；H.無NaCI

14.同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是專門

重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳NEBuffer,以保證100%的酶活性。NEBuff

er的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的講

明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液

條件下的切割速率會減緩，因此使用時可按照每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應調(diào)整酶

量和反應時刻。要保證雙酶切實驗的高效、準確，就要選擇合適的通用buffer,如此就能幸免

質(zhì)粒和基因沒有切動或者被切散。常用的幾家內(nèi)切酶公司有MBI、NEB、Promega.Roche.

Takara,要查找雙酶切體系的通用buffer,最好到出品該內(nèi)切酶的公司網(wǎng)站上查詢。

15.緩沖液在電泳過程中的一個作用是堅持合適的pH。電泳時正極與負極都會發(fā)生電解反

應,正極發(fā)生的是氧化反應(4OH-4e->2H2O+O2),負極發(fā)生的是還原反應(4H++4e->2

H2),長時刻的電泳將使正極變酸，負極變堿。一個好的緩沖系統(tǒng)應有較強的緩沖能力，是溶液

兩極的pH保持差不多不變。

電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移,例如，一

樣電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；

太高時就會造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。

電泳緩沖液還有一個組分是EDTA,加入濃度為l-2mmol/L,目的是螯合Mg2+等離子，

防止電泳時激活DNABS,此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。

16.

17.關于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電

泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心噪作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決方

法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易辨論，造成條帶缺失現(xiàn)象?？讖酱蟮沫?/p>

脂糖。

19.⑴、細胞的生長狀態(tài)和密度

最好從-7CTC或-2CTC甘油儲存的菌種中直截了當轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液，不要用

差不多過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4P的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5x

107個左右為佳。即應用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌,可通過測定培養(yǎng)液的OD600操縱。對

TG1菌株，OD600為0.5時，細胞密度在5x107個/ml左右。（應注意OD600值與細胞數(shù)

之間的關系隨菌株的不同而不同X密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細胞一樣應

是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。同時受體細胞還應

與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。

⑵、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應要緊是超螺5定態(tài)的,轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范疇內(nèi)成正

比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一樣地，DNA溶液的

體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%,Ing的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。關

于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明,大于30kb的重組質(zhì)粒將

專門難進行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也緊密有關，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率

較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。

⑶、試劑的質(zhì)量

所用的CaCI2等試劑均需是最高純度的,并用最純潔的水配制，最好分裝儲存于4?！?/p>

⑷、防止雜菌和雜DNA的污染

整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并

經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑者曖滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，

否則均會阻礙轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。

⑸、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴,否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。

20.TAE是Tris-乙酸，韁中容量小，然而溶解度大，易于儲存

TBE是Tris-硼酸，緩沖容量大，然而溶解度小，不易長期儲存，易產(chǎn)生沉淀

TAE與TBE的區(qū)別

第一要明白TAE輿TBE緩彳薊溶液的成份如下:

50xTAEBuffer(Tris-Acetdle-EDTA)

242gmTrisbase

57.1mlAceticacid100ml

0.5MEDTA

AddddH2Oto1literandadjustpHto8.5.

lOxTBEBuffer(Tris-Borate-EDTA)

108gmTrisbase

55gmBoricacid

9.3gmNa4EDTA

AddddH2Oto1liter.

ThepHis8.3andrequiresnoadjustment.

它優(yōu)的分別有下列黑黠：

1.TBE不能太渡(它只可有10times),因卷borate曾專門容易沉;殿，但一樣有少聲午沉混殳

是不曾有太大冏

2.TBE的bufferingcapacity比TAE高，用TBE來跑出來的gel,辨論率(resolution)?

比敕高。

3.因卷TBE有borate能子(ion),它曾影簪酵素(enzyme)的工作。因此,若要^分蹄出

的DNA御亍下一步酵素虞理，如cloning或restrictioncut的言舌，就要切言己不要ISDNA碰

上borateion0

4.TAE的bufferopacity匕獺差，gel一樣比較模糊，但它不曾封影轡酵素

三種緩沖液的配制方法

Tris-乙酸(TAE):50x濃貯存液(每升):

242gTris堿

57.1ml冰乙酸

100ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)

使用時再稀釋50倍。

Tris-磷酸(TPE):10、濃貯存液(每升)：

108gTris堿

15.5ml85%磷酸(1.679g/ml)

40rnlO.5mmol/LEDTA(pH8.0)

使用時再稀釋10倍。

Tris-硼酸(TBE):5x濃貯存液(每升):

54gTris堿

27.5g硼酸

20ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)

21.標準的PCR反應體系：

10x擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物S200umol/L800ul

引物各10~100pmol

模板DNA0.1~2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至lOOul

PCR反應五要素：參加PCR反應的物質(zhì)要緊有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

22.1、考慮是否引物有咨詢題，不特異；2、是否Taq酶加多了，一樣50ul體系加1UTa

q就能夠了；3、是否是Mg2+加多了，Mg2+加多了會造成^特異擴增；4、是否退火溫度不

行？5、是否循環(huán)數(shù)過多，PCR擴增后期，進入平臺期擴增,錯誤擴增增加，非特異性也增強.

23.可能有如下緣故：

1,模板量過低；

2,引物濃度多大；

3,退火時刻過長.

4,最重要的一點是，在引物設計過程中幸免引物間有互補序列,專門是3'末端,同時盡量使引

物3,末端的GC含量高一點,使與模板緊密結(jié)合.

做到以上各點，一樣可不能顯現(xiàn)引物二聚體了.

24.由于RNase能迅速降解RNA,且耐熱、耐酸、耐堿，不需要輔助因子，用蛋白質(zhì)變性

劑只能使之臨時失活，變性劑去除后，其活性又可復原。因此，分離提取RNA時，為確保RN

A的完整性，必須制造一個無RNase的環(huán)境，操作時應專門注意以下幾個方面：

1.操作者在整個實驗過程中必須戴消毒手套和口罩，并經(jīng)常更換。

2.玻璃器皿沖洗潔凈后，需180~250（干烤4小時以上。

3.盡可能使用一次性塑料制品（Ep管、吸頭等），用0.1%DEPC溶液浸泡過夜，80℃烤干

后局壓滅菌。

4.電泳槽沖洗潔凈后，于3%H2O2中浸泡30分鐘以上,然后用0.1%DEPC溶液或高壓

滅菌水完全沖洗。

5.除Tris類試劑外，所有溶液用0.1%DEPC處理12小時以上，然后高壓消毒。所用試劑

應未開封或RNA專用試劑。

6.使用強烈、有效的RNase抑制劑以抑制內(nèi)源RNase。常用的RNase抑制劑有異硫氨酸

?。℅TC）、氧鋼核糖核昔復合物（VRC）、RNasin及焦碳酸二乙酯（DFPC）等。

評判RNA質(zhì)量的標準是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取決于有效的去除RNA提

取物中的DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；完整的RNA則取決于最大限度地幸免純化過程中內(nèi)源性

及外源性RNase對RNA的降解。通常采納紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度,純RNA

的A260/A280=2.0，但由于所用的標本不同，此比值有一定的變化，一樣在1.7~2.0之間，低

于該值表明有蛋白污染，需進一步用酚/氯仿抽提。有時樣本的A260/A280可能大于20,如重

復讀數(shù)無誤，并不表示純度有咨詢題。

RNA的完整性可通過瓊脂糖電泳法進行鑒定。完整的RNA電泳時，28S（約4.8Kb）和1

8S（約1.9Kb）rRNA經(jīng)EB染色后,兩條電泳條帶的顯色強度近似為2比1。

25.RNA提取提取RNA能夠分為總RNA,mRNA,VirusRNA（RNA病毒）幾類Trizol

即異硫鼠酸呱-苯酚法，這種方法的原理是：笫一用強變性劑異硫鼠酸弧裂解細胞，同時使核蛋

白復合體中的蛋白變性，開釋出核酸。開釋出來的DNA和RNA由于在特定pH時溶解度不

同，分別位于整個體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進一步通過有機溶

劑來抽提沉淀RNA,就能夠得到純潔的RNA;

26.

27.-防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均應在使用前于18CTC的高溫下干烤6hr或更長時刻。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,

故不能使用X

3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2

室溫lOmin,然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。

4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC,在37（處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘

留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22pm

濾膜過濾除菌。

5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6.設置RNA操作專用實臉室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）:是一種強烈但不完全的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活

性基團組氨酸的咪喋環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2.異硫富酸胭:目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶

失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.氧饑核糖核苗復合物：由氧化的離子和核苛形成的復合物,它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)

類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）:從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin

是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，能夠和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。

5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

28.

29。配1000ml的DEPC處理水，加lmIDEPC。磁力攪拌器攪拌過夜。翌日高壓蒸汽

滅菌121c,25minDEPC分解成二氧化碳和酒精，封閉冷藏備用。最好分裝小瓶來用，盡量幸

免污染。DEPC水是用DEPC（diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯）處理過并經(jīng)高溫高壓消毒

的MiliQ純水。經(jīng)檢測不含RNase、DNase和proteinase。

DEPC水能夠用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應體系如反轉(zhuǎn)錄、siRNA的退火

等,以及其它各種要求無RNase、DNase和proteinase的反應體系。

DEPC水一樣是指千分之一濃度的DEPC,在攪拌器上攪拌至完全溶解，即看不到"油珠”為

止，用來處理槍頭、EP管的DEPC水不需高壓滅活，而用于配制DEPC酒精等試劑和用來這種

RNA有關試驗的DEPC水需滅火后使用。

DEPC氣味芳香濃烈，強揮發(fā)性，有毒，需在通風櫥中操作。

方法是：取市售DEPC1ml,加入1L待處理水（蒸餡水等）中，經(jīng)猛烈振搖后，于室溫靜

止數(shù)小時，然后高壓滅菌,以除去降解DEPC（DEPC分解為C02和乙醇\有些試劑可直截

了當加入DEPC,終濃度一樣為0.1%?0.4%,原則上在雜交及其往常的步驟中，所有液體試劑

均需用DEPC處理,或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸標本以及標本有關的空

中的洗滌也需DEPC水洗滌。

注意：①DEPC是潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應盡量在通風的條件下進行，并幸免接觸皮

膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。

去離子純潔水加入DEPC達濃度0.1%,室溫下連續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后濕熱高壓滅菌完

全揮發(fā)去除DEPC后能夠長期儲存在室溫或4度冰箱，不宜反復使用。

30.

31.非變性凝膠里面沒加變性劑，一樣是SDS。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性一樣用

做功能試驗,如EMSA。由于沒有變性劑的緣故非變性膠電泳時除了與蛋白分子量有關也會受

都電荷的阻礙，因此對蛋白等電點的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時需要倒轉(zhuǎn)電泳時的正

負極。從跑的膠來看，變性膠會比較好看,帶比較窄，非變性膠跑出來則比較粗糙。

32.[l]40ml水中力口7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃,力口7mll0xMSE緩沖液,11.5m

I甲醛，加水定容至70ml,混勻后倒入盛膠槽。[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放

入1XMSE緩沖液的電泳槽。［3］使RNA變性(最多20四)，RNA4.5rnl,10xMSE緩沖液20

ml,甲醛3.5ml,去離子甲酰胺10mlo［4］55℃加熱15min，冰浴冷卻。⑸力口2mI5x載樣緩

沖液。⑹上樣、同時加RNA標記物(同位素(32P)dCTPi［7］60伏電泳過夜。［8］取出凝

膠，水中浸泡2次，每次5mino［9］室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCI中

45min,水解高分子RNA,以增強轉(zhuǎn)印。［10］室溫下將膠浸到O.lmmol/LTrisHCI(pH7.5)中

45min,使膠中和。［ll］20xSSC洗膠lh。［12］20xSSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。［13］

取出硝酸纖維素膜，80工真空烘烤2h。＜3＞注意事項囚嚴格遵守試驗規(guī)則，物必準確。［2］由

于好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意自身安全，做好防護。

33.要進行北方雜合反應前,必須先將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙(nitrocellulose

membrane)或尼龍膜(nylonmembrane)上,這一個過程稱為轉(zhuǎn)印(blotting\一樣

常用的方法包括毛細管轉(zhuǎn)移法(capillarytransfer\真空轉(zhuǎn)移法(vacuumtransfer)與電

轉(zhuǎn)印法(electroblotting1毛細管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸取轉(zhuǎn)移緩沖液時所產(chǎn)生的牽引力量將

RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6h以上。盡管所需花費的時刻比較

長，以其不須要專門的儀器設備，毛細管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采納。若分析RNA時采納變性聚

丙烯酰胺膠體電泳，則必須以電轉(zhuǎn)印法進行RNA轉(zhuǎn)印。至于膜的選擇，硝基纖維素膜的優(yōu)點是

比較可不能產(chǎn)生非專一性反應；只是其一旦被潤濕再烘干的后，容易碎裂，不適用于進行多次

雜合反應。尼龍膜的優(yōu)點是韌性好，與核酸結(jié)合的能力也相當強，正能夠補償硝基纖維素膜的

缺點，現(xiàn)已成為主流。一旦將RNA轉(zhuǎn)移至膜上后，即能夠利用紫外線照耀法(uv