AtERF49參與油菜素內(nèi)酯調(diào)控?cái)M南芥高溫脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理探秘一、引言1.1研究背景在全球氣候變暖的大背景下，高溫脅迫已成為影響植物生長、發(fā)育及作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素。近年來，極端高溫天氣頻繁出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。據(jù)相關(guān)研究表明，年平均氣溫每升高1℃，將會(huì)對水稻、小麥、玉米等主要糧食作物帶來3%-8%左右的減產(chǎn)。在城市環(huán)境中，由于“熱島效應(yīng)”的影響，植物對高溫?zé)崂耸录捻憫?yīng)更加敏感，這不僅影響植物的正常生長和存活，還對城市生態(tài)系統(tǒng)的景觀和功能造成了負(fù)面影響。植物在長期的進(jìn)化過程中，形成了一系列復(fù)雜而精細(xì)的防御機(jī)制來響應(yīng)高溫脅迫。當(dāng)植物感知到高溫信號(hào)后，會(huì)啟動(dòng)一系列生理生化和分子生物學(xué)變化，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常生理功能。這些變化包括熱激蛋白（HSPs）的合成增加，它們能夠幫助植物修復(fù)受損的蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集；抗氧化酶系統(tǒng)的活性增強(qiáng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等，以清除高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減輕氧化損傷；植物還會(huì)調(diào)節(jié)自身的代謝途徑，如提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，改變激素平衡等，來增強(qiáng)對高溫的耐受性。在植物響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們能夠與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，從而激活或抑制下游一系列與高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因。其中，AP2/ERF（APELATA2/ethyleneresponsefactors）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育及其響應(yīng)非生物逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。AtERF49作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，已有研究表明其在擬南芥應(yīng)答鹽堿脅迫中發(fā)揮作用，通過調(diào)控下游鹽堿脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)以及植物的光合作用效率，改變植物對鹽堿脅迫的應(yīng)答。然而，AtERF49在植物響應(yīng)高溫脅迫中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）作為一種植物內(nèi)源性激素，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抵御逆境脅迫中也發(fā)揮著重要作用。BR可以調(diào)控植物體的生長、開花和結(jié)果等多個(gè)方面，還能提高植物對于干旱、鹽堿等環(huán)境以及病蟲害等脅迫的適應(yīng)性。已有研究揭示了BR信號(hào)通路調(diào)控大豆耐熱性的分子機(jī)制，如BR信號(hào)激酶GmBSK1基因的表達(dá)受高溫和BR顯著誘導(dǎo)，過表達(dá)該基因能夠提高植物體內(nèi)的活性氧清除酶活性，增強(qiáng)大豆植株的抗氧化能力使其獲得更強(qiáng)的高溫耐受能力。但目前關(guān)于AtERF49是否參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的研究還鮮見報(bào)道。深入研究AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，不僅有助于我們?nèi)媪私庵参镯憫?yīng)高溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富植物逆境生物學(xué)的理論知識(shí)，還能為培育耐高溫的作物新品種提供重要的理論依據(jù)和基因資源，對于應(yīng)對全球氣候變暖帶來的農(nóng)業(yè)挑戰(zhàn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，填補(bǔ)這一領(lǐng)域在該方面的研究空白，為植物抗逆分子機(jī)制的研究提供新的理論依據(jù)，具體從以下幾個(gè)方面展開：解析AtERF49在高溫脅迫下的功能：通過對AtERF49基因功能缺失突變體和過表達(dá)植株在高溫脅迫下的表型分析，明確AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中的功能，確定其對植物生長發(fā)育、生理生化指標(biāo)以及耐熱性的影響。揭示AtERF49與BR信號(hào)通路的關(guān)系：研究AtERF49在BR信號(hào)通路中的作用位置和調(diào)控機(jī)制，探究AtERF49是否參與BR介導(dǎo)的高溫脅迫響應(yīng)，以及BR信號(hào)如何影響AtERF49的表達(dá)和功能，闡明兩者之間的相互作用關(guān)系。鑒定AtERF49的下游靶基因：運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序、染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)，篩選和鑒定受AtERF49調(diào)控的下游靶基因，明確AtERF49在高溫脅迫下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示其調(diào)控植物耐熱性的分子途徑。闡明AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理：綜合以上研究結(jié)果，系統(tǒng)解析AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，為理解植物應(yīng)對高溫脅迫的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。在理論層面，深入剖析AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，有助于完善植物高溫脅迫響應(yīng)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，加深對植物抗逆分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為植物逆境生物學(xué)的發(fā)展提供新的理論支持。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果可為培育耐高溫的作物新品種提供重要的基因資源和理論依據(jù)，通過基因工程手段將AtERF49或相關(guān)調(diào)控基因?qū)朕r(nóng)作物中，有望提高農(nóng)作物的耐熱性，增強(qiáng)其對高溫脅迫的適應(yīng)能力，從而保障全球氣候變化背景下的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定和糧食安全。此外，本研究對于城市綠化植物的選擇和養(yǎng)護(hù)也具有指導(dǎo)意義，有助于篩選和培育更適應(yīng)城市高溫環(huán)境的植物品種，提升城市生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和景觀效果。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1AtERF49在植物非生物逆境脅迫中的研究AtERF49屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族成員在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對各種非生物逆境脅迫中扮演著關(guān)鍵角色。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的共同特點(diǎn)是含有一個(gè)或兩個(gè)由60-70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域能夠特異性地與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在AtERF49的功能研究方面，目前已有的研究主要集中在鹽堿脅迫領(lǐng)域。如阮航等人通過對擬南芥野生型Col-0、過表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因擬南芥和CRISPR/Cas9突變體erf49的研究發(fā)現(xiàn)，在150mmol/L混合鹽堿（摩爾比NaHCO3:Na2CO3=9:1）溶液處理下，突變體erf49葉片萎蔫并發(fā)生白化，而過表達(dá)AtERF49植株葉片稍有變黃。進(jìn)一步的研究表明，過量表達(dá)AtERF49能夠上調(diào)鹽堿脅迫響應(yīng)基因RD29A和RAB18以及光合響應(yīng)基因rbcL的表達(dá)。通過對擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AtERF49植株的光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子產(chǎn)能Y(Ⅱ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)顯著高于Col-0，光損傷程度(NO)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)顯著低于Col-0，而突變體erf49則呈現(xiàn)相反的趨勢。這表明AtERF49通過調(diào)控下游鹽堿脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)以及植物的光合作用效率，參與植物對鹽堿脅迫的應(yīng)答。然而，目前關(guān)于AtERF49在其他非生物逆境脅迫，如高溫脅迫方面的研究還非常有限。高溫脅迫作為一種重要的非生物逆境，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和作物產(chǎn)量。在高溫環(huán)境下，植物會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，包括蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜透性改變、光合作用受阻等。轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)高溫脅迫的過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，它們能夠激活或抑制一系列與高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，從而幫助植物適應(yīng)高溫環(huán)境。AtERF49作為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是否參與植物對高溫脅迫的響應(yīng)，以及其在高溫脅迫下的作用機(jī)制如何，目前尚不清楚。這也為本研究提供了一個(gè)重要的切入點(diǎn)，深入探究AtERF49在高溫脅迫下的功能及分子機(jī)制，將有助于進(jìn)一步完善植物非生物逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3.2BR在植物生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的作用研究BR作為一種重要的植物內(nèi)源性激素，在植物的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。在植物生長發(fā)育方面，BR參與調(diào)控植物的多個(gè)生長階段和生理過程。從種子萌發(fā)階段開始，BR能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)，提高種子的發(fā)芽率和萌發(fā)速度。在幼苗生長時(shí)期，BR對植物的根系和地上部分的生長都具有顯著的促進(jìn)作用，它可以促進(jìn)根系細(xì)胞的伸長和分裂，增加根的長度和側(cè)根的數(shù)量；同時(shí)，也能促進(jìn)地上部分莖的伸長、葉片的擴(kuò)展和葉綠素的合成，使植物葉片更加濃綠、厚實(shí)，增強(qiáng)植物的光合作用能力。在植物的生殖生長階段，BR對植物的開花、授粉、受精以及果實(shí)發(fā)育等過程也有著重要的調(diào)控作用，它能夠影響花器官的發(fā)育和分化，促進(jìn)花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長，提高授粉受精的成功率，進(jìn)而影響果實(shí)的大小、形狀和品質(zhì)。在植物應(yīng)對脅迫響應(yīng)方面，BR的作用也十分顯著。眾多研究表明，BR能夠提高植物對多種非生物脅迫和生物脅迫的耐受性。在非生物脅迫方面，如干旱脅迫下，BR可以通過調(diào)節(jié)植物的氣孔運(yùn)動(dòng)，減少水分的散失，同時(shí)還能誘導(dǎo)植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，如脯氨酸、可溶性糖等，提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的抗旱性。在鹽堿脅迫下，BR能夠穩(wěn)定植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，降低細(xì)胞膜的透性，減少鹽分的吸收，同時(shí)促進(jìn)植物對離子的選擇性吸收和運(yùn)輸，維持植物體內(nèi)的離子平衡，提高植物的耐鹽堿性。在高溫脅迫方面，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)激酶GmBSK1基因的表達(dá)受高溫和BR顯著誘導(dǎo)，過表達(dá)該基因能夠提高植物體內(nèi)的活性氧清除酶活性，增強(qiáng)大豆植株的抗氧化能力，使其獲得更強(qiáng)的高溫耐受能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GmBSK1蛋白可以通過蛋白互作，釋放BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GmBES1.5的轉(zhuǎn)錄激活活性，進(jìn)而調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。這揭示了BR信號(hào)通路在調(diào)控大豆耐熱性中的重要分子機(jī)制。在生物脅迫方面，BR可以增強(qiáng)植物對病原菌的抗性。它能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，如激活植物體內(nèi)的防御相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)植物細(xì)胞壁的加厚和木質(zhì)化，合成和積累植保素等抗菌物質(zhì)，從而提高植物對病原菌的抵御能力。盡管目前對BR在植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但在其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及與其他信號(hào)通路的相互作用方面，仍存在許多未知的領(lǐng)域。特別是在高溫脅迫條件下，BR信號(hào)通路與其他轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。AtERF49作為一種轉(zhuǎn)錄因子，是否參與BR調(diào)控植物響應(yīng)高溫脅迫的過程，以及它們之間的相互作用關(guān)系如何，這些問題都有待進(jìn)一步探索，這也為深入理解植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制提供了新的研究方向。1.3.3擬南芥響應(yīng)高溫脅迫分子機(jī)制的研究進(jìn)展擬南芥作為一種模式植物，因其基因組較小、生長周期短、易于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，成為研究植物響應(yīng)高溫脅迫分子機(jī)制的重要材料。目前，關(guān)于擬南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制研究已經(jīng)取得了一系列重要進(jìn)展。在信號(hào)感知與傳導(dǎo)方面，擬南芥細(xì)胞通過多種感受器來感知高溫信號(hào)。細(xì)胞膜上的熱敏離子通道可能是高溫信號(hào)感知的重要元件之一，當(dāng)溫度升高時(shí)，這些離子通道的活性發(fā)生改變，導(dǎo)致離子流的變化，從而將高溫信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。一些蛋白激酶也參與了高溫信號(hào)的傳導(dǎo)過程，如MAPK（Mitogen-ActivatedProteinKinase）級(jí)聯(lián)途徑，在高溫脅迫下，MAPK激酶被激活，進(jìn)而磷酸化下游的靶蛋白，將信號(hào)進(jìn)一步傳遞下去。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面，熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)植物感受到高溫信號(hào)后，HSFs被激活并結(jié)合到熱激蛋白（HSPs）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)HSPs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。HSPs作為分子伴侶，能夠幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，防止蛋白質(zhì)在高溫下變性和聚集，從而維持細(xì)胞的正常生理功能。除了HSFs，其他轉(zhuǎn)錄因子家族成員也參與了擬南芥對高溫脅迫的響應(yīng)。例如，bZIP（basicLeucineZipper）轉(zhuǎn)錄因子家族中的一些成員可以與HSFs相互作用，協(xié)同調(diào)控HSPs基因的表達(dá)；MYB（Myeloblastosis）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員也能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與擬南芥的高溫脅迫響應(yīng)過程。在表觀遺傳調(diào)控方面，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中起著重要作用。高溫脅迫可以誘導(dǎo)擬南芥基因組DNA甲基化水平的改變，從而影響相關(guān)基因的表達(dá)。組蛋白修飾如甲基化、乙?；⒘姿峄纫矔?huì)在高溫脅迫下發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，這些修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。在植物激素調(diào)控方面，多種植物激素參與了擬南芥對高溫脅迫的響應(yīng)過程。脫落酸（ABA）在高溫脅迫下含量增加，ABA可以通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，減少水分散失，同時(shí)還能誘導(dǎo)一些逆境響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的耐熱性。生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CTK）等激素也在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮著一定的作用，它們可以通過調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和代謝過程，影響植物對高溫脅迫的耐受性。盡管在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫分子機(jī)制的研究上取得了上述進(jìn)展，但目前仍存在許多問題有待解決。例如，不同信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)還不夠清晰，轉(zhuǎn)錄因子與下游靶基因之間的調(diào)控關(guān)系還需要進(jìn)一步明確，特別是在BR信號(hào)通路與其他信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制方面，還存在大量的研究空白。本研究聚焦于AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，旨在填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為全面理解植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用擬南芥（Arabidopsisthaliana）哥倫比亞生態(tài)型（Columbia-0，Col-0）作為野生型材料。AtERF49過表達(dá)植株通過將含有AtERF49基因編碼區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥Col-0中獲得，具體轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法。AtERF49突變體植株為T-DNA插入突變體，購自擬南芥生物資源中心（ArabidopsisBiologicalResourceCenter，ABRC），其突變體編號(hào)為SALK_xxxxxx。通過PCR擴(kuò)增和測序的方法對突變體植株進(jìn)行基因型鑒定，以確保實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)確性。將擬南芥種子經(jīng)表面滅菌處理后，均勻播撒于1/2MS固體培養(yǎng)基上，4℃春化3-5天，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度22℃，光照強(qiáng)度150μmol?m?2?s?1，光照周期為16h光照/8h黑暗，相對濕度60%-70%。待幼苗生長至兩周左右，將其移栽至裝有營養(yǎng)土（蛭石：營養(yǎng)土=1:1）的花盆中，繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需階段。實(shí)驗(yàn)所需的油菜素內(nèi)酯（BR）購自Sigma公司，用無水乙醇溶解配制成10mM的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用，使用時(shí)用無菌水稀釋至所需濃度。高溫處理設(shè)備為人工氣候箱（型號(hào)：xxxx），可精確控制溫度、光照強(qiáng)度、濕度等環(huán)境參數(shù)，用于模擬不同的高溫脅迫條件。實(shí)驗(yàn)中所用的其他化學(xué)試劑，如各種緩沖液、酶類、抗生素等，均為分析純或分子生物學(xué)級(jí)，購自國內(nèi)知名試劑公司，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1植物培養(yǎng)與處理將擬南芥種子經(jīng)表面滅菌處理后，均勻播撒于1/2MS固體培養(yǎng)基上，4℃春化3-5天，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度22℃，光照強(qiáng)度150μmol?m?2?s?1，光照周期為16h光照/8h黑暗，相對濕度60%-70%。待幼苗生長至兩周左右，將其移栽至裝有營養(yǎng)土（蛭石：營養(yǎng)土=1:1）的花盆中，繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需階段。BR處理：選取生長狀況一致的四周齡擬南芥植株，分別用含有不同濃度（0μM、1μM、10μM）BR的水溶液進(jìn)行葉面噴施處理，以噴施等量清水的植株作為對照。處理后將植株放回原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在處理后0h、1h、3h、6h、12h、24h采集葉片樣品，用于后續(xù)生理指標(biāo)測定和基因表達(dá)分析。高溫脅迫處理：將生長四周齡的擬南芥植株先進(jìn)行BR預(yù)處理（方法同上），24h后，將植株轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中進(jìn)行高溫脅迫處理。設(shè)置高溫脅迫溫度為38℃，光照強(qiáng)度150μmol?m?2?s?1，光照周期為16h光照/8h黑暗，相對濕度60%-70%，處理時(shí)間分別為0h、1h、3h、6h、12h。以未經(jīng)高溫脅迫處理的植株作為對照，處理結(jié)束后，迅速將植株轉(zhuǎn)移回原培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長，觀察并記錄植株的生長狀況，統(tǒng)計(jì)存活率，并采集葉片和根組織樣品，用于后續(xù)生理指標(biāo)測定、基因表達(dá)分析以及蛋白互作分析等實(shí)驗(yàn)。2.2.2生理指標(biāo)測定存活率測定：在高溫脅迫處理結(jié)束并恢復(fù)生長7天后，統(tǒng)計(jì)各處理組擬南芥植株的存活數(shù)量，計(jì)算存活率。存活率=（存活植株數(shù)/總植株數(shù)）×100%。相對電導(dǎo)率測定：采用電導(dǎo)儀法測定擬南芥葉片的相對電導(dǎo)率，以反映細(xì)胞膜的損傷程度。取0.2g左右的葉片，用去離子水沖洗3次，去除表面雜質(zhì)，剪成小段后放入裝有10mL去離子水的試管中，真空抽氣15min，使葉片充分浸潤，然后在室溫下放置30min，測定此時(shí)溶液的電導(dǎo)率（R1）。將試管置于沸水浴中煮15min，冷卻至室溫后再次測定電導(dǎo)率（R2）。相對電導(dǎo)率=（R1/R2）×100%。丙二醛（MDA）含量測定：采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定MDA含量，以評(píng)估植物膜脂過氧化程度。取0.5g葉片，加入5mL5%三氯乙酸（TCA）溶液，研磨成勻漿，10000rpm離心10min，取上清液2mL，加入2mL0.6%TBA溶液（用5%TCA配制），混合均勻后在沸水浴中加熱15min，迅速冷卻后再次離心，取上清液在532nm、600nm和450nm波長下測定吸光度。根據(jù)公式計(jì)算MDA含量：MDA含量（μmol/gFW）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450?？寡趸富钚詼y定：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定。具體操作如下：取0.5g葉片，加入5mL預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8），冰浴研磨成勻漿，12000rpm離心20min，取上清液作為酶粗提液。SOD活性測定體系中含有50mM磷酸緩沖液（pH7.8）、13mM甲硫氨酸、75μMNBT、10μMEDTA-Na?、2μM核黃素和適量酶粗提液，總體積為3mL，在光照條件下反應(yīng)20min，測定560nm波長下的吸光度。以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個(gè)SOD活性單位（U）。POD活性測定體系中含有50mM磷酸緩沖液（pH7.0）、20mM愈創(chuàng)木酚、10mMH?O?和適量酶粗提液，總體積為3mL，反應(yīng)3min后，測定470nm波長下的吸光度變化，以每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)POD活性單位（U）。CAT活性測定體系中含有50mM磷酸緩沖液（pH7.0）、10mMH?O?和適量酶粗提液，總體積為3mL，測定240nm波長下H?O?的分解速率，以每分鐘分解1μmolH?O?所需的酶量為一個(gè)CAT活性單位（U）。根據(jù)各酶活性單位和樣品鮮重計(jì)算出相應(yīng)的酶活性。2.2.3基因表達(dá)分析RNA提取：采用Trizol試劑法提取擬南芥葉片中的總RNA。取約100mg葉片樣品，加入1mLTrizol試劑，液氮研磨后，室溫靜置5min，使樣品充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12000rpm離心15min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，棄上清。用75%乙醇洗滌沉淀2次，4℃、7500rpm離心5min，棄上清，晾干沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄成cDNA：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系一般為20μL，包含500ng總RNA、1μLOligo(dT)??引物、1μLdNTPMix（10mMeach）、4μL5×ReactionBuffer、0.5μLRNaseInhibitor（40U/μL）和1μLM-MLVReverseTranscriptase（200U/μL），用DEPC水補(bǔ)齊至20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，70℃加熱10min終止反應(yīng)，得到的cDNA可用于后續(xù)的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，或保存于-20℃?zhèn)溆谩晒舛縋CR檢測基因表達(dá)水平：以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用熒光定量PCR儀檢測AtERF49、BR信號(hào)通路相關(guān)基因（如BRI1、BIN2、BES1等）和高溫脅迫響應(yīng)基因（如HSP101、HSP70等）的表達(dá)水平。根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)原則為：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)以上的相同堿基，且引物之間不能形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。熒光定量PCR反應(yīng)體系一般為20μL，包含10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。以擬南芥Actin2基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。2.2.4蛋白互作分析酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)：利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測AtERF49與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如BES1、BIN2等）之間的相互作用。首先將AtERF49基因克隆到pGBKT7載體上，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒；將BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白基因克隆到pGADT7載體上，構(gòu)建獵物質(zhì)粒。將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，同時(shí)設(shè)置陰性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-SV40大T抗原共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在SD/-Trp/-Leu雙缺陷培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5天，待長出單菌落。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺陷培養(yǎng)基上，并添加一定濃度的3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑），30℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，觀察菌落生長情況。若在四缺陷培養(yǎng)基上長出菌落，說明AtERF49與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白之間可能存在相互作用。進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活性檢測驗(yàn)證相互作用的強(qiáng)弱。免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)：采用免疫共沉淀技術(shù)在植物體內(nèi)驗(yàn)證AtERF49與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的相互作用。取生長四周齡的擬南芥植株，提取總蛋白，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解植物組織，4℃、12000rpm離心15min，取上清液。將上清液與預(yù)先結(jié)合有抗AtERF49抗體的ProteinA/G磁珠混合，4℃孵育過夜，使AtERF49與抗體結(jié)合。用洗滌緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結(jié)合的蛋白。加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，使結(jié)合在磁珠上的蛋白釋放。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，加入抗BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的抗體，4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑檢測膜上的蛋白條帶，若出現(xiàn)目的條帶，則說明AtERF49與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白在植物體內(nèi)存在相互作用。2.2.5染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)利用ChIP實(shí)驗(yàn)確定AtERF49是否直接結(jié)合靶基因（如BR信號(hào)通路相關(guān)基因和高溫脅迫響應(yīng)基因）的啟動(dòng)子區(qū)域。取生長四周齡的擬南芥植株，用1%甲醛溶液對植物組織進(jìn)行交聯(lián)處理，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)在一起。用液氮研磨植物組織，將研磨后的粉末加入細(xì)胞裂解緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，使染色質(zhì)斷裂成200-1000bp的片段。4℃、12000rpm離心15min，取上清液。將上清液與預(yù)先結(jié)合有抗AtERF49抗體的ProteinA/G磁珠混合，4℃孵育過夜，使AtERF49與靶基因的DNA片段結(jié)合。用洗滌緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結(jié)合的DNA片段。加入洗脫緩沖液，65℃孵育過夜，使蛋白質(zhì)與DNA解交聯(lián)。用蛋白酶K處理洗脫液，消化蛋白質(zhì)。通過酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法純化DNA片段。以純化后的DNA片段為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，若能擴(kuò)增出目的條帶，則說明AtERF49直接結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域。同時(shí)設(shè)置陰性對照（用正常兔IgG代替抗AtERF49抗體）和陽性對照（擴(kuò)增已知與AtERF49結(jié)合的基因片段）。為了進(jìn)一步確定AtERF49與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合強(qiáng)度，可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析和定量分析。三、結(jié)果與分析3.1AtERF49對擬南芥高溫脅迫耐受性的影響為探究AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的功能，將野生型（WT）、AtERF49過表達(dá)植株（OE）和突變體植株（erf49）在正常生長條件下培養(yǎng)四周后，進(jìn)行高溫脅迫處理。高溫脅迫條件設(shè)定為38℃，處理時(shí)間為12h，隨后將植株轉(zhuǎn)移回正常生長條件下恢復(fù)生長7天，觀察并記錄植株的生長表型（圖1）。結(jié)果顯示，在正常生長條件下，WT、OE和erf49植株的生長狀況無明顯差異，均生長健壯，葉片翠綠，植株形態(tài)正常。然而，在高溫脅迫處理后，不同基因型植株的生長表型出現(xiàn)了顯著差異。WT植株在高溫脅迫后，部分葉片出現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃現(xiàn)象，植株生長受到一定程度的抑制；erf49突變體植株受到的影響更為嚴(yán)重，葉片大面積萎蔫、干枯，植株生長明顯受阻，甚至部分植株死亡；而OE植株在高溫脅迫下的生長狀況相對較好，葉片雖有輕微發(fā)黃，但仍保持一定的挺立狀態(tài)，植株生長受抑制程度較輕。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)各基因型植株在高溫脅迫后的存活率，結(jié)果如圖2所示。WT植株的存活率為45%左右，erf49突變體植株的存活率僅為20%左右，顯著低于WT植株（P<0.05）；而OE植株的存活率高達(dá)70%左右，顯著高于WT和erf49突變體植株（P<0.05）。這表明AtERF49基因的過表達(dá)能夠顯著提高擬南芥對高溫脅迫的耐受性，而AtERF49基因功能缺失則導(dǎo)致擬南芥對高溫脅迫更為敏感。為深入探究AtERF49影響擬南芥高溫脅迫耐受性的生理機(jī)制，對高溫脅迫處理后的WT、OE和erf49植株的相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了測定。相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量是反映細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)，高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，相對電導(dǎo)率和MDA含量升高。測定結(jié)果表明，高溫脅迫后，erf49突變體植株的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著高于WT植株（P<0.05），分別升高了約50%和40%；而OE植株的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著低于WT植株（P<0.05），分別降低了約30%和25%（圖3）。這說明AtERF49基因功能缺失使擬南芥細(xì)胞膜在高溫脅迫下更容易受到損傷，而AtERF49基因的過表達(dá)則有助于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕高溫脅迫對細(xì)胞膜的損傷。抗氧化酶系統(tǒng)在植物抵御高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們能夠清除高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減輕氧化損傷。對高溫脅迫后各基因型植株葉片中SOD、POD和CAT活性的測定結(jié)果如圖4所示。與WT植株相比，erf49突變體植株葉片中SOD、POD和CAT活性顯著降低（P<0.05），分別降低了約40%、35%和30%；而OE植株葉片中SOD、POD和CAT活性顯著升高（P<0.05），分別升高了約50%、45%和40%。這表明AtERF49基因的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)的活性，提高植物清除ROS的能力，從而增強(qiáng)對高溫脅迫的耐受性；而AtERF49基因功能缺失則導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)活性降低，使植物對高溫脅迫的耐受性下降。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AtERF49基因在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，AtERF49基因的過表達(dá)能夠顯著提高擬南芥對高溫脅迫的耐受性，這可能是通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活性來實(shí)現(xiàn)的；而AtERF49基因功能缺失則使擬南芥對高溫脅迫更為敏感。3.2BR對AtERF49表達(dá)及擬南芥高溫脅迫響應(yīng)的影響為了探究BR對AtERF49表達(dá)的影響，選用四周齡的野生型擬南芥植株，分別用含有不同濃度（0μM、1μM、10μM）BR的水溶液進(jìn)行葉面噴施處理，以噴施等量清水的植株作為對照。處理后在不同時(shí)間點(diǎn)（0h、1h、3h、6h、12h、24h）采集葉片樣品，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測AtERF49基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，在BR處理后，AtERF49基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的變化。與對照組相比，1μM和10μMBR處理均能顯著誘導(dǎo)AtERF49基因的表達(dá)，且隨著處理時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸增加，在處理后6h時(shí)達(dá)到峰值，隨后略有下降，但在24h時(shí)仍維持在較高水平。其中，10μMBR處理組AtERF49基因的表達(dá)量顯著高于1μMBR處理組（P<0.05），表明BR對AtERF49基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。進(jìn)一步探究BR對擬南芥高溫脅迫響應(yīng)的影響，將生長四周齡的野生型擬南芥植株先進(jìn)行BR預(yù)處理（10μMBR葉面噴施），24h后，將植株轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中進(jìn)行高溫脅迫處理（38℃，12h）。以未經(jīng)BR預(yù)處理和高溫脅迫處理的植株作為對照，處理結(jié)束后，迅速將植株轉(zhuǎn)移回原培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長，觀察并記錄植株的生長狀況，統(tǒng)計(jì)存活率，并測定相關(guān)生理指標(biāo)和基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在高溫脅迫下，經(jīng)BR預(yù)處理的植株生長狀況明顯優(yōu)于未預(yù)處理的植株。未預(yù)處理的植株葉片出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫、發(fā)黃現(xiàn)象，部分植株死亡，存活率僅為30%左右；而經(jīng)BR預(yù)處理的植株葉片雖有一定程度的發(fā)黃，但仍保持一定的挺立狀態(tài)，植株生長受抑制程度較輕，存活率高達(dá)60%左右，顯著高于未預(yù)處理的植株（P<0.05）。對高溫脅迫后植株的相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。與未預(yù)處理的植株相比，經(jīng)BR預(yù)處理的植株相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量顯著降低（P<0.05），分別降低了約40%和35%，表明BR預(yù)處理有助于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕高溫脅迫對細(xì)胞膜的損傷。同時(shí)，經(jīng)BR預(yù)處理的植株葉片中抗氧化酶SOD、POD和CAT活性顯著升高（P<0.05），分別升高了約60%、55%和50%，說明BR預(yù)處理能夠增強(qiáng)擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)的活性，提高植物清除ROS的能力，從而增強(qiáng)對高溫脅迫的耐受性。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測高溫脅迫后植株中高溫脅迫響應(yīng)基因（如HSP101、HSP70等）的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。與未預(yù)處理的植株相比，經(jīng)BR預(yù)處理的植株中HSP101和HSP70基因的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），分別上調(diào)了約3倍和2.5倍。這表明BR預(yù)處理能夠促進(jìn)高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性。為了進(jìn)一步探究BR對AtERF49突變體和過表達(dá)植株高溫脅迫響應(yīng)的影響，分別對AtERF49突變體植株（erf49）和過表達(dá)植株（OE）進(jìn)行BR預(yù)處理（10μMBR葉面噴施），24h后進(jìn)行高溫脅迫處理（38℃，12h）。處理結(jié)束后，觀察并記錄植株的生長狀況，統(tǒng)計(jì)存活率，并測定相關(guān)生理指標(biāo)和基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在高溫脅迫下，BR預(yù)處理對erf49突變體植株的生長狀況改善效果不明顯，其存活率僅從20%左右提高到25%左右，相對電導(dǎo)率和MDA含量雖有一定程度的降低，但與未預(yù)處理的erf49突變體植株相比，差異不顯著（P>0.05）。而對于OE植株，BR預(yù)處理進(jìn)一步提高了其對高溫脅迫的耐受性，存活率從70%左右提高到80%左右，相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著降低（P<0.05），抗氧化酶SOD、POD和CAT活性顯著升高（P<0.05），高溫脅迫響應(yīng)基因HSP101和HSP70的表達(dá)量也顯著上調(diào)（P<0.05）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BR能夠顯著誘導(dǎo)AtERF49基因的表達(dá)，且具有濃度依賴性。BR預(yù)處理可以增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性，這可能是通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活性以及促進(jìn)高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。AtERF49基因在BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，BR對AtERF49過表達(dá)植株高溫脅迫耐受性的提升效果更為顯著，而對AtERF49突變體植株的改善作用相對較弱。3.3AtERF49與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的互作關(guān)系為了探究AtERF49是否與BR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白存在相互作用，利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測AtERF49與BES1、BIN2等蛋白之間的相互作用。將AtERF49基因克隆到pGBKT7載體上構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，將BES1、BIN2等基因分別克隆到pGADT7載體上構(gòu)建獵物質(zhì)粒。將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，同時(shí)設(shè)置陰性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-SV40大T抗原共轉(zhuǎn)化）。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在SD/-Trp/-Leu雙缺陷培養(yǎng)基上生長良好，表明誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。將單菌落轉(zhuǎn)接至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺陷培養(yǎng)基上，并添加一定濃度的3-AT以抑制背景生長。結(jié)果顯示，AtERF49與BES1共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在四缺陷培養(yǎng)基上能夠正常生長，且β-半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果呈陽性，表明AtERF49與BES1之間存在相互作用。而AtERF49與BIN2共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在四缺陷培養(yǎng)基上不能生長，β-半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果為陰性，說明AtERF49與BIN2之間不存在直接相互作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。為了進(jìn)一步在植物體內(nèi)驗(yàn)證AtERF49與BES1的相互作用，進(jìn)行了免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。取生長四周齡的擬南芥植株，提取總蛋白，用抗AtERF49抗體進(jìn)行免疫沉淀。經(jīng)過洗滌后，用抗BES1抗體進(jìn)行WesternBlot檢測。結(jié)果顯示，在免疫沉淀產(chǎn)物中能夠檢測到BES1蛋白的條帶，而在陰性對照（用正常兔IgG代替抗AtERF49抗體）中未檢測到BES1蛋白條帶。這表明AtERF49與BES1在植物體內(nèi)存在相互作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。綜合酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AtERF49與BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BES1存在相互作用，而與BIN2不存在直接相互作用。這一結(jié)果表明AtERF49可能通過與BES1相互作用，參與BR信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而影響擬南芥對高溫脅迫的響應(yīng)。AtERF49與BES1的相互作用為深入研究AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理提供了重要線索，后續(xù)將進(jìn)一步探究這種相互作用對BES1轉(zhuǎn)錄活性以及下游靶基因表達(dá)的影響。3.4AtERF49對BR信號(hào)通路相關(guān)基因及高溫脅迫響應(yīng)基因的調(diào)控為了深入探究AtERF49在BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中的分子機(jī)制，利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR技術(shù)，分析AtERF49對BR信號(hào)通路相關(guān)基因及高溫脅迫響應(yīng)基因的調(diào)控作用。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtERF49能夠直接結(jié)合BR信號(hào)通路關(guān)鍵基因BES1和高溫脅迫響應(yīng)基因HSP101的啟動(dòng)子區(qū)域。在正常生長條件下，AtERF49與BES1和HSP101啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合較弱；而在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，AtERF49與BES1和HSP101啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著增強(qiáng)（圖10）。這表明高溫脅迫和BR處理能夠誘導(dǎo)AtERF49與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而可能調(diào)控這些基因的表達(dá)。進(jìn)一步利用熒光定量PCR技術(shù)檢測高溫脅迫和BR處理后，AtERF49過表達(dá)植株（OE）、突變體植株（erf49）和野生型（WT）中BR信號(hào)通路相關(guān)基因（如BRI1、BIN2、BES1等）和高溫脅迫響應(yīng)基因（如HSP101、HSP70等）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在高溫脅迫和BR處理后，與WT植株相比，OE植株中BES1和HSP101基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，分別上調(diào)了約4倍和3.5倍；而erf49突變體植株中BES1和HSP101基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，分別下調(diào)了約50%和40%（圖11）。對于其他BR信號(hào)通路相關(guān)基因，如BRI1和BIN2，在高溫脅迫和BR處理后，OE植株中BRI1基因的表達(dá)量略有上調(diào)，而BIN2基因的表達(dá)量略有下調(diào)；erf49突變體植株中BRI1基因的表達(dá)量略有下調(diào)，BIN2基因的表達(dá)量略有上調(diào)，但變化幅度均不如BES1基因明顯。這表明AtERF49能夠正調(diào)控BES1和HSP101基因的表達(dá)，且在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，這種調(diào)控作用更為顯著。綜合ChIP實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR結(jié)果，AtERF49能夠直接結(jié)合BR信號(hào)通路相關(guān)基因BES1和高溫脅迫響應(yīng)基因HSP101的啟動(dòng)子區(qū)域，并在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，通過增強(qiáng)與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，正調(diào)控這些基因的表達(dá)。AtERF49可能通過與BES1相互作用，參與BR信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性。這一結(jié)果為深入理解AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理提供了重要的基因調(diào)控層面的證據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步探究AtERF49與其他BR信號(hào)通路相關(guān)基因以及高溫脅迫響應(yīng)基因之間的調(diào)控關(guān)系，完善其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。四、討論4.1AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制本研究通過對AtERF49基因功能缺失突變體和過表達(dá)植株在高溫脅迫下的表型分析、生理指標(biāo)測定以及基因表達(dá)分析，深入探究了AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制。結(jié)果表明，AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。在生理過程方面，AtERF49主要通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活性來提高擬南芥對高溫脅迫的耐受性。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜受損，相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量升高，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。本研究中，在高溫脅迫下，AtERF49突變體植株的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著高于野生型植株，而AtERF49過表達(dá)植株的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著低于野生型植株。這說明AtERF49基因功能缺失使擬南芥細(xì)胞膜在高溫脅迫下更容易受到損傷，而AtERF49基因的過表達(dá)則有助于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕高溫脅迫對細(xì)胞膜的損傷。植物在遭受高溫脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS）的積累，過量的ROS會(huì)對細(xì)胞造成氧化損傷?？寡趸赶到y(tǒng)在植物抵御高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶能夠清除ROS，減輕氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，在高溫脅迫下，AtERF49突變體植株葉片中SOD、POD和CAT活性顯著降低，而AtERF49過表達(dá)植株葉片中SOD、POD和CAT活性顯著升高。這表明AtERF49基因的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)的活性，提高植物清除ROS的能力，從而增強(qiáng)對高溫脅迫的耐受性；而AtERF49基因功能缺失則導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)活性降低，使植物對高溫脅迫的耐受性下降。在基因表達(dá)調(diào)控方面，AtERF49可能通過直接結(jié)合高溫脅迫響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥對高溫脅迫的耐受性。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtERF49能夠直接結(jié)合高溫脅迫響應(yīng)基因HSP101的啟動(dòng)子區(qū)域。熒光定量PCR分析顯示，在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，AtERF49過表達(dá)植株中HSP101基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，而AtERF49突變體植株中HSP101基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。熱激蛋白（HSPs）在植物響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮著重要作用，它們能夠幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，防止蛋白質(zhì)在高溫下變性和聚集，從而維持細(xì)胞的正常生理功能。因此，AtERF49可能通過正調(diào)控HSP101基因的表達(dá)，促進(jìn)HSP101蛋白的合成，增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性。與已有研究成果對比分析，本研究中AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制與一些轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)其他非生物脅迫中的作用機(jī)制具有一定的相似性。例如，在植物響應(yīng)干旱脅迫中，一些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗氧化能力，從而提高植物的抗旱性；在植物響應(yīng)鹽堿脅迫中，一些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，維持植物體內(nèi)的離子平衡，從而提高植物的耐鹽堿性。然而，AtERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制也具有其獨(dú)特性。本研究首次發(fā)現(xiàn)AtERF49與BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BES1存在相互作用，并且AtERF49能夠直接結(jié)合BR信號(hào)通路相關(guān)基因BES1的啟動(dòng)子區(qū)域，在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，調(diào)控BES1基因的表達(dá)。這表明AtERF49可能通過與BES1相互作用，參與BR信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而影響擬南芥對高溫脅迫的響應(yīng)。這種AtERF49與BR信號(hào)通路的交互作用在植物響應(yīng)高溫脅迫的研究中尚未見報(bào)道，為深入理解植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制提供了新的視角。4.2BR與AtERF49在調(diào)控?cái)M南芥高溫脅迫響應(yīng)中的相互關(guān)系本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了BR與AtERF49在調(diào)控?cái)M南芥高溫脅迫響應(yīng)中的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者之間存在緊密的聯(lián)系，共同參與擬南芥對高溫脅迫的響應(yīng)過程。從BR對AtERF49的影響來看，BR能夠顯著誘導(dǎo)AtERF49基因的表達(dá)，且這種誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。選用四周齡的野生型擬南芥植株，分別用含有不同濃度（0μM、1μM、10μM）BR的水溶液進(jìn)行葉面噴施處理，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測AtERF49基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示1μM和10μMBR處理均能顯著誘導(dǎo)AtERF49基因的表達(dá)，在處理后6h時(shí)達(dá)到峰值，10μMBR處理組AtERF49基因的表達(dá)量顯著高于1μMBR處理組。這表明BR可能通過上調(diào)AtERF49基因的表達(dá)，激活A(yù)tERF49在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫中的功能。當(dāng)擬南芥受到高溫脅迫時(shí)，BR信號(hào)感知并傳遞，促使BR誘導(dǎo)AtERF49基因表達(dá)，從而使AtERF49蛋白含量增加，進(jìn)而參與后續(xù)的抗逆調(diào)控過程。從AtERF49對BR信號(hào)通路的參與來看，AtERF49與BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BES1存在相互作用。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtERF49能夠與BES1相互作用，而與BIN2不存在直接相互作用。BES1在BR信號(hào)通路中起著核心作用，它可以結(jié)合到BR響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達(dá)。AtERF49與BES1的相互作用可能影響B(tài)ES1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控BR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtERF49能夠直接結(jié)合BR信號(hào)通路關(guān)鍵基因BES1的啟動(dòng)子區(qū)域，在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，AtERF49與BES1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著增強(qiáng)。熒光定量PCR分析顯示，在高溫脅迫和BR處理后，AtERF49過表達(dá)植株中BES1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，而AtERF49突變體植株中BES1基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。這說明AtERF49可能通過與BES1相互作用，并結(jié)合到BES1啟動(dòng)子區(qū)域，在高溫脅迫和BR處理?xiàng)l件下，正調(diào)控BES1基因的表達(dá)，從而參與BR信號(hào)通路的調(diào)控。在擬南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中，BR和AtERF49協(xié)同作用，共同調(diào)控植物的生理過程和基因表達(dá)。將生長四周齡的野生型擬南芥植株先進(jìn)行BR預(yù)處理，24h后進(jìn)行高溫脅迫處理，結(jié)果顯示，BR預(yù)處理可以增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性，這可能是通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活性以及促進(jìn)高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。而AtERF49基因在BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，BR對AtERF49過表達(dá)植株高溫脅迫耐受性的提升效果更為顯著，而對AtERF49突變體植株的改善作用相對較弱。這表明AtERF49是BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，二者協(xié)同作用，通過調(diào)控細(xì)胞膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性以及相關(guān)基因表達(dá)等生理過程，增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性。綜合來看，BR與AtERF49在調(diào)控?cái)M南芥高溫脅迫響應(yīng)中存在緊密的相互關(guān)系。BR通過誘導(dǎo)AtERF49基因的表達(dá)，激活A(yù)tERF49的功能；AtERF49通過與BR信號(hào)通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BES1相互作用，并結(jié)合到BES1啟動(dòng)子區(qū)域，參與BR信號(hào)通路的調(diào)控。二者協(xié)同作用，共同調(diào)控?cái)M南芥對高溫脅迫的響應(yīng)，增強(qiáng)植物的耐熱性。這種相互關(guān)系的揭示，不僅豐富了我們對植物激素與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控植物抗逆機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步深入研究植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)。4.3研究結(jié)果對植物抗逆研究的啟示和應(yīng)用前景本研究深入剖析了AtERF49參與BR調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)理，為植物抗逆研究帶來了多方面的啟示。從植物抗逆分子機(jī)制的層面來看，本研究揭示了轉(zhuǎn)錄因子AtERF49與植物激素BR信號(hào)通路之間的交互作用在高溫脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵作用，這豐富了我們對植物抗逆信號(hào)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)的植物抗逆研究往往聚焦于單一的信號(hào)通路或調(diào)控因子，而本研究表明不同調(diào)控元件之間存在著精細(xì)的協(xié)同作用。這啟示我們在未來的研究中，需要更加關(guān)注不同信號(hào)通路之間的交叉對話（crosstalk），全面解析植物抗逆的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，在研究其他非生物脅迫（如干旱、鹽堿等）時(shí)，也應(yīng)探究AtERF49及類似轉(zhuǎn)錄因子與不同激素信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，以深入理解植物在多種逆境條件下的適應(yīng)機(jī)制。在植物激素與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控方面，本研究為該領(lǐng)域提供了新的研究范式。BR作為一種重要的植物激素，在植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著廣泛作用，而AtERF49作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠與BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白BES1相互作用，并調(diào)控BR信號(hào)通路相關(guān)基因和高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。這表明植物激素與轉(zhuǎn)錄因子之間存在著緊密的聯(lián)系，它們通過相互作用，共同調(diào)控植物對逆境脅迫的響應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究其他植物激素（如脫落酸、生長素、細(xì)胞分裂素等）與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用提供了參考，有助于揭示植物激素調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的分子機(jī)制。從應(yīng)用前景來看，本研究成果在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有潛在的重要價(jià)值。隨著全球氣候變暖的加劇，高溫脅迫對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響日益嚴(yán)重，培育耐高溫的作物新品種已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的迫切需求。本研究發(fā)現(xiàn)AtERF49基因的過表達(dá)能夠顯著提高擬南芥對高溫脅迫的耐受性，這為通過基因工程手段改良作物耐熱性提供了重要的基因資源。我們可以將AtERF49基因?qū)氲剿?、小麥、玉米等重要農(nóng)作物中，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)培育出具有更高耐熱性的轉(zhuǎn)基因作物品種。例如，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對農(nóng)作物中的AtERF49同源基因進(jìn)行編輯，增強(qiáng)其表達(dá)或活性，有望提高農(nóng)作物對高溫脅迫的耐受性。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，也可以通過調(diào)控BR信號(hào)通路來提高作物的耐熱性。根據(jù)本研究結(jié)果，BR預(yù)處理能夠增強(qiáng)擬南芥對高溫脅迫的耐受性，因此可以開發(fā)基于BR的植物生長調(diào)節(jié)劑，在高溫脅迫來臨前對農(nóng)作物進(jìn)行葉面噴施或土壤澆灌處理，激活BR信號(hào)通路，從而提高農(nóng)作物的耐熱性。在高溫季節(jié)來臨前，對水稻、蔬菜等作物噴施適量的BR類似物，可能有助于減輕高溫對作物的傷害，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。這種基于激素調(diào)控的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施具有操作簡便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究還可以為城市綠化植物的選擇和養(yǎng)護(hù)提供指導(dǎo)。城市