CD24激活整合素β1對腸癌細胞黏附的調(diào)節(jié)機制探究一、引言1.1研究背景腸癌，作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命健康。在北美、西歐各國，大腸癌占全部癌癥死亡原因的第3位，在我國大部分省市，其也占全部死亡原因的第5-6位。惡性腫瘤的眾多生物學特性中，轉(zhuǎn)移性最為關(guān)鍵，而腸癌的高死亡率主要與其轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細胞黏附在腫瘤轉(zhuǎn)移進程里扮演著重要角色，是腫瘤細胞脫離原發(fā)灶、侵入周圍組織并進入血液循環(huán)，進而在遠處器官定植生長的基礎(chǔ)。它包含細胞與基質(zhì)之間的黏附以及細胞與細胞之間的黏附，腸癌細胞的黏附能力與其浸潤和轉(zhuǎn)移能力緊密相連。研究報道有百余種基因參與調(diào)控大腸癌的黏附過程，深入探究腸癌細胞的黏附機制，對腸癌的預防和治療意義重大。CD24是一種跨膜糖蛋白，定位于染色體的6q21，表現(xiàn)出等位基因的多態(tài)現(xiàn)象，具有2194個堿基。它是一個粘蛋白樣黏附分子，擁有一個27個氨基酸的小蛋白核心，通過GPI錨定在細胞膜上，具備一個P-選擇素配基和O-連接糖基化部位。P-選擇素配基或許與腫瘤在內(nèi)皮中的黏附、滾動相關(guān)，O-連接位點能被大量糖基化，糖基在CD24的分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮中至關(guān)重要，充當細胞連接位點上分子間相互作用的媒介，介導細胞間、細胞與基質(zhì)間黏附。研究顯示，CD24在卵巢腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌、膀胱上皮細胞癌、膽管癌等多種腫瘤中均呈高表達。近期研究發(fā)現(xiàn)，在90.7％的結(jié)直腸腺瘤和86.3％的結(jié)直腸腺癌中表達CD24。諸多研究表明，CD24在腫瘤細胞的黏附過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體機制尚未完全明晰。整合素是影響腫瘤細胞黏附的最重要分子之一，屬于細胞表面受體家族，主要介導細胞與細胞外基質(zhì)以及細胞與細胞之間的黏附，在細胞的增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。整合素β1作為整合素家族的重要成員，其表達與結(jié)腸癌細胞的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況以及Dukes分期有關(guān)。研究整合素β1在腸癌細胞黏附中的作用機制，對于深入理解腸癌的轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。先前研究發(fā)現(xiàn)，CD24與整合素β1的相互作用調(diào)節(jié)了腸癌細胞的黏附，但CD24調(diào)節(jié)整合素β1的具體機制仍不清楚。因此，深入探討CD24與整合素β1之間相互作用的機制，揭示腸癌細胞的黏附調(diào)節(jié)機制，對于腸癌的防治具有重要的理論和實際意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析CD24通過激活整合素β1調(diào)節(jié)腸癌細胞黏附的具體分子機制。通過細胞生物學、分子生物學等多學科技術(shù)手段，確定CD24與整合素β1相互作用的關(guān)鍵位點、信號通路，以及這種相互作用對腸癌細胞黏附、遷移和侵襲能力的影響。這一研究具有重要的理論與實際意義。從理論層面來看，當前對于腸癌細胞黏附機制的認識尚存在諸多空白。揭示CD24與整合素β1之間的相互作用及調(diào)節(jié)機制，有助于填補這一領(lǐng)域在分子機制研究方面的不足，完善腸癌轉(zhuǎn)移理論體系，深化對腫瘤細胞惡性生物學行為本質(zhì)的理解。在實際應用方面，腸癌的高死亡率主要源于其轉(zhuǎn)移特性，而細胞黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵起始步驟。本研究成果有望為腸癌的早期診斷提供新的生物標志物，通過檢測CD24和整合素β1的表達水平及活性狀態(tài)，更精準地評估腸癌患者的病情進展與轉(zhuǎn)移風險。同時，針對CD24-整合素β1信號軸開發(fā)特異性的靶向治療藥物，能夠為腸癌患者提供更有效、副作用更小的治療策略，提高患者的生存率與生活質(zhì)量，對臨床治療產(chǎn)生積極影響。二、腸癌細胞黏附與相關(guān)分子概述2.1腸癌細胞黏附的過程與意義腸癌細胞的黏附過程在其轉(zhuǎn)移進程中占據(jù)著極為關(guān)鍵的地位，是一個涉及多步驟、多因素相互作用的復雜生物學過程。在腫瘤發(fā)生的起始階段，腸癌細胞首先需要從原發(fā)腫瘤部位脫離。正常情況下，細胞與細胞之間通過多種細胞黏附分子緊密連接，維持組織的正常結(jié)構(gòu)與功能。然而，在腫瘤細胞中，這些黏附連接被破壞。例如，E-鈣黏蛋白作為一種重要的細胞-細胞黏附分子，在腸癌發(fā)生時，其表達常常下調(diào)。E-鈣黏蛋白的減少使得腫瘤細胞之間的黏附力減弱，從而為腸癌細胞脫離原發(fā)灶創(chuàng)造了條件。脫離原發(fā)灶的腸癌細胞隨后與細胞外基質(zhì)（ECM）相互作用。細胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等成分組成，為細胞提供結(jié)構(gòu)支持和生化信號。腸癌細胞通過表面的整合素等受體分子與細胞外基質(zhì)中的配體結(jié)合。以整合素β1為例，它可以與纖維連接蛋白上的特定結(jié)構(gòu)域相互作用，這種結(jié)合不僅使腸癌細胞黏附于細胞外基質(zhì)，還能激活一系列細胞內(nèi)信號通路，如FAK-Src信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活和遷移能力。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腸癌細胞還需要穿越基底膜和血管內(nèi)皮細胞屏障?；啄な且粚游挥谏掀ぜ毎徒Y(jié)締組織之間的特殊細胞外基質(zhì)，對腫瘤細胞的侵襲形成物理屏障。腸癌細胞通過分泌蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解基底膜的成分，從而獲得穿過基底膜的能力。當腸癌細胞進入血液循環(huán)后，它們會與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附。這一過程涉及多種黏附分子的參與，如選擇素家族和免疫球蛋白超家族成員。例如，P-選擇素可以介導腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞之間的初始黏附，使腫瘤細胞在血管內(nèi)皮表面滾動，隨后通過整合素等分子的作用實現(xiàn)牢固黏附，進而穿越內(nèi)皮細胞間隙，進入周圍組織，形成遠處轉(zhuǎn)移灶。腸癌細胞黏附對于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有重要意義。黏附能力的改變直接影響腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。高黏附能力的腸癌細胞更容易在遠處組織中定植和生長，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風險。細胞黏附還與腫瘤細胞的生存和增殖密切相關(guān)。通過與細胞外基質(zhì)或其他細胞的黏附，腫瘤細胞可以獲得生存信號，抵抗凋亡。例如，整合素與細胞外基質(zhì)的結(jié)合可以激活PI3K-Akt信號通路，促進細胞的存活和增殖。此外，腸癌細胞黏附還參與腫瘤微環(huán)境的形成和調(diào)節(jié)。腫瘤細胞與周圍基質(zhì)細胞、免疫細胞之間的黏附相互作用，影響腫瘤微環(huán)境中的細胞因子分泌、免疫反應等，進一步促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在臨床治療方面，深入了解腸癌細胞黏附機制，有助于開發(fā)新的治療策略。通過干擾黏附分子的功能或阻斷相關(guān)信號通路，可以抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，提高腸癌患者的治療效果和生存率。2.2CD24分子特性與功能CD24作為一種結(jié)構(gòu)獨特且功能多樣的分子，在細胞生理與病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。從結(jié)構(gòu)上看，它是一種跨膜糖蛋白，定位于染色體的6q21區(qū)域，具有2194個堿基，呈現(xiàn)出等位基因的多態(tài)現(xiàn)象。CD24擁有一個僅由27個氨基酸構(gòu)成的小蛋白核心，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞膜上。這種特殊的錨定方式使得CD24能夠穩(wěn)定地存在于細胞膜表面，參與細胞間的相互作用。其結(jié)構(gòu)中還包含一個P-選擇素配基和O-連接糖基化部位。P-選擇素配基可能在腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附、滾動過程中發(fā)揮作用，這對于腫瘤細胞進入血液循環(huán)并在遠處組織定植具有重要意義。O-連接位點則可以被大量糖基化，糖基在CD24的分子結(jié)構(gòu)與功能實現(xiàn)中起著不可或缺的作用。它們充當細胞連接位點上分子間相互作用的媒介，通過與其他分子的特異性識別與結(jié)合，介導細胞間以及細胞與基質(zhì)間的黏附過程。在腫瘤領(lǐng)域，CD24的高表達現(xiàn)象廣泛存在于多種惡性腫瘤中。研究表明，在卵巢腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌、膀胱上皮細胞癌、膽管癌等腫瘤組織中，CD24的表達水平顯著高于正常組織。具體而言，在結(jié)直腸腫瘤中，有研究發(fā)現(xiàn)90.7％的結(jié)直腸腺瘤和86.3％的結(jié)直腸腺癌中表達CD24。這種高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌的研究中，CD24的高表達與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)。高表達CD24的乳腺癌細胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，從而增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風險。在卵巢癌中，CD24的高表達也與患者的不良預后相關(guān)。高表達CD24的卵巢癌患者往往對化療藥物的敏感性降低，腫瘤復發(fā)率增加，生存率降低。CD24在細胞黏附和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。在細胞黏附方面，諸多研究提供了有力的證據(jù)。以MTLYCD24mut細胞（CD24缺失細胞）為例，該細胞與纖維連接蛋白、層黏連蛋白、膠原I和膠原Ⅳ的結(jié)合能力明顯下降，尤其是與纖維連接蛋白的結(jié)合能力下降最為顯著。這表明CD24對于維持細胞與細胞外基質(zhì)成分的正常黏附至關(guān)重要。當誘導MTLYCD24mut細胞株表達CD24后，腫瘤細胞與纖維連接蛋白的結(jié)合能力顯著增強，進一步證實了CD24在細胞黏附中的關(guān)鍵作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，將轉(zhuǎn)移能力較弱的1AS細胞株轉(zhuǎn)染入CD24質(zhì)粒，然后接種于裸鼠體內(nèi)，與對照組相比，CD24表達可顯著增加肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量。這一實驗結(jié)果說明CD24能夠增強腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力，促進腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。CD24還可以通過與其他分子形成復合物，共同調(diào)節(jié)細胞的黏附和轉(zhuǎn)移過程。研究發(fā)現(xiàn)CD24可以和整合素形成復合物，在鼠的乳腺癌細胞中，CD24能夠通過其連接部位的脂筏結(jié)構(gòu)來激活整合素β1。脂筏作為細胞膜上的微區(qū)域，是信號轉(zhuǎn)導的重要功能集團，CD24在其中可能起到分子開關(guān)的作用，通過激活整合素β1，調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移等行為，進而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。2.3整合素β1分子特性與功能整合素β1作為整合素家族的重要成員，在細胞的生理與病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，整合素是一類異源二聚體跨膜糖蛋白，由α和β兩個亞基通過非共價鍵連接而成。整合素β1亞基含有多個結(jié)構(gòu)域，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)復雜，包含多個重復序列和特定的結(jié)構(gòu)模體，這些結(jié)構(gòu)對于識別和結(jié)合細胞外基質(zhì)配體至關(guān)重要。例如，胞外區(qū)含有與二價陽離子結(jié)合的位點，二價陽離子（如Mg2?、Ca2?）的存在能夠調(diào)節(jié)整合素與配體的親和力。當二價陽離子與整合素結(jié)合時，會引起整合素構(gòu)象的變化，使其能夠更有效地與細胞外基質(zhì)中的配體，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白等相互作用?？缒^(qū)由一段疏水氨基酸組成，將整合素固定在細胞膜上，確保其在細胞表面的穩(wěn)定存在。胞內(nèi)區(qū)則較短，但包含多個與細胞內(nèi)信號傳導分子相互作用的位點，是整合素將細胞外信號傳遞到細胞內(nèi)的關(guān)鍵區(qū)域。整合素β1在體內(nèi)分布廣泛，在多種細胞表面均有表達，尤其在腸癌細胞中，其表達水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。在正常腸上皮細胞中，整合素β1的表達有助于維持細胞與細胞外基質(zhì)之間的正常黏附，保持腸上皮的完整性和正常功能。然而，在腸癌細胞中，整合素β1的表達常常發(fā)生改變。研究表明，隨著腸癌的進展，從腺瘤到腺癌的轉(zhuǎn)變過程中，整合素β1的表達逐漸升高。在結(jié)直腸癌組織中，整合素β1的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況以及Dukes分期有關(guān)。高分化的腸癌組織中，整合素β1的表達相對較低；而在低分化、浸潤性強且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腸癌組織中，整合素β1的表達顯著升高。這種表達變化與腸癌細胞的惡性生物學行為密切相關(guān)。在細胞黏附過程中，整合素β1發(fā)揮著核心作用。它能夠介導腸癌細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附。如前所述，整合素β1可以與纖維連接蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質(zhì)成分特異性結(jié)合。以纖維連接蛋白為例，其分子結(jié)構(gòu)中含有特定的氨基酸序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，整合素β1的胞外區(qū)能夠識別并緊密結(jié)合RGD序列，從而使腸癌細胞牢固地黏附在纖維連接蛋白上。這種黏附作用不僅為腸癌細胞提供了物理支撐，還通過激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，影響細胞的生物學行為。當整合素β1與細胞外基質(zhì)配體結(jié)合后，會引起整合素胞內(nèi)區(qū)與細胞內(nèi)的細胞骨架蛋白以及信號分子相互作用。例如，整合素β1可以與黏著斑激酶（FAK）結(jié)合，激活FAK的激酶活性。激活的FAK會進一步磷酸化下游的信號分子，如Src激酶等，從而激活一系列細胞內(nèi)信號通路，如PI3K-Akt通路、MAPK通路等。這些信號通路的激活能夠調(diào)節(jié)細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程。PI3K-Akt通路的激活可以促進細胞的存活和增殖，抑制細胞凋亡；MAPK通路的激活則可以調(diào)節(jié)細胞的遷移和侵襲能力。在腸癌細胞的遷移過程中，整合素β1與細胞外基質(zhì)的黏附作用能夠為細胞提供牽引力，使細胞能夠沿著細胞外基質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)進行移動。整合素β1還參與細胞-細胞之間的黏附調(diào)節(jié)。在腫瘤微環(huán)境中，腸癌細胞與周圍的基質(zhì)細胞、免疫細胞等之間的相互作用也依賴于整合素β1等黏附分子。腸癌細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的黏附是腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要步驟，整合素β1在這一過程中起到了關(guān)鍵作用。三、CD24與整合素β1相互作用研究3.1CD24與整合素β1相互作用方式的確定3.1.1共免疫共沉淀實驗設(shè)計與結(jié)果分析為了明確CD24與整合素β1是否存在直接相互作用以及相互作用的條件，本研究設(shè)計并實施了共免疫共沉淀實驗（Co-IP）。該實驗以人類腸癌細胞系SW620為研究對象，這是因為SW620細胞在腸癌研究中應用廣泛，其生物學特性相對明確，且穩(wěn)定表達CD24和整合素β1，便于后續(xù)實驗的開展與分析。實驗首先對SW620細胞進行裂解處理，在裂解過程中，采用了溫和的裂解條件，以確保細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用能夠最大程度地保留下來。裂解液中加入了包含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，這是為了防止蛋白質(zhì)在裂解過程中被降解，從而保證實驗結(jié)果的準確性。具體來說，裂解緩沖液中含有20mMTris、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1%TritonX-100、1mMβ-Glycerolphosphate、1mMNa3VO4以及蛋白酶抑制劑雞尾酒（Cocktailproteinase），pH值調(diào)節(jié)為7.5。將細胞在該裂解緩沖液中冰上放置30min，以使細胞充分裂解。裂解完成后，將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，在4℃條件下，以14000g的離心力離心15min，去除細胞碎片等雜質(zhì)。吸取上清液，此時上清液中含有細胞內(nèi)的各種蛋白質(zhì)，包括可能相互作用的CD24和整合素β1。為了減少非特異性結(jié)合對實驗結(jié)果的干擾，進行了預清除（preclear）步驟。在上清液中加入1μg對照兔IgG以及ProteinAagarose，在4℃條件下，通過轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)孵育30min。這一步驟的原理是，對照兔IgG可以與裂解液中可能與ProteinAagarose非特異性結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合，從而在后續(xù)實驗中排除這些非特異性結(jié)合的干擾。孵育結(jié)束后，在4℃條件下，以10000g的離心力離心5min，去除結(jié)合有非特異性物質(zhì)的ProteinAagarose。經(jīng)過預清除后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，并對總蛋白進行定量，使其濃度達到500-2000μg（本實驗中通常定量至1000μg）。然后，用裂解緩沖液將體積補齊至600-800μl。向其中加入10μl針對CD24的兔抗人多克隆抗體，在4℃條件下，通過轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)孵育過夜。這一步驟的目的是利用CD24抗體特異性地結(jié)合CD24蛋白，若CD24與整合素β1存在相互作用，那么整合素β1也會隨著CD24-抗體復合物一起被沉淀下來。孵育過夜后，加入35μlProteinAagarose，在4℃條件下，繼續(xù)通過轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)孵育2h。ProteinAagarose能夠與抗體的Fc段結(jié)合，從而將CD24-抗體-整合素β1復合物沉淀下來。孵育結(jié)束后，在4℃條件下，以1000g的離心力離心5min，收集沉淀。用PBS對沉淀進行3次洗滌，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，向沉淀中加入40μl2×SDSSampleBuffer，在沸水浴中煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性，便于后續(xù)的WesternBlot檢測。在WesternBlot檢測中，使用針對整合素β1的特異性抗體進行檢測。若在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測到整合素β1的條帶，說明CD24與整合素β1在細胞內(nèi)存在相互作用。實驗結(jié)果顯示，在使用CD24抗體進行免疫沉淀的樣品中，成功檢測到了整合素β1的條帶，而在使用對照兔IgG進行免疫沉淀的樣品中，未檢測到整合素β1的條帶。這一結(jié)果明確表明，CD24與整合素β1在腸癌細胞SW620內(nèi)存在直接的相互作用。為了進一步探究相互作用的條件，本研究還設(shè)置了不同的溫度和離子強度條件進行實驗。在溫度方面，分別設(shè)置了4℃、25℃和37℃三個溫度組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4℃條件下，CD24與整合素β1的相互作用最強，隨著溫度的升高，相互作用逐漸減弱。這可能是因為較高的溫度會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而降低它們之間的親和力。在離子強度方面，通過調(diào)整裂解緩沖液中NaCl的濃度，設(shè)置了0.1M、0.15M和0.2M三個離子強度組。實驗結(jié)果表明，在0.15MNaCl濃度下，CD24與整合素β1的相互作用最為穩(wěn)定，過高或過低的離子強度都會對它們的相互作用產(chǎn)生一定的影響。這可能是因為離子強度會影響蛋白質(zhì)表面的電荷分布，進而影響蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用。綜上所述，共免疫共沉淀實驗結(jié)果確定了CD24與整合素β1在腸癌細胞內(nèi)存在直接相互作用，且這種相互作用在4℃、0.15MNaCl濃度等條件下最為穩(wěn)定。3.1.2雙雜交實驗驗證為了進一步驗證CD24與整合素β1的相互作用方式及位點，本研究采用了酵母雙雜交實驗。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種基于轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)特性建立起來的體內(nèi)分析方法，其原理是利用真核細胞轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD），將待研究的兩個蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合表達。如果這兩個蛋白質(zhì)能夠相互作用，就會使BD和AD在空間上接近，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。在本實驗中，首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒。將編碼CD24的基因克隆到pGBKT7載體上，使其與BD融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CD24。同時，將編碼整合素β1的基因克隆到pGADT7載體上，使其與AD融合，構(gòu)建成獵物質(zhì)粒pGADT7-integrinβ1。這兩個重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，需要對其進行測序驗證，以確保插入基因的序列正確，無突變或移碼等錯誤。將構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CD24和獵物質(zhì)粒pGADT7-integrinβ1共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中。在轉(zhuǎn)化過程中，采用了醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，該方法具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便等優(yōu)點。轉(zhuǎn)化完成后，將酵母細胞涂布在缺乏亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）和組氨酸（His）的三缺培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp/-His）上進行篩選。只有成功共轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒，且兩個融合蛋白能夠相互作用激活報告基因HIS3表達的酵母細胞才能在三缺培養(yǎng)基上生長。這是因為HIS3基因的表達需要BD和AD在空間上的接近，而只有當CD24和整合素β1相互作用時，才能實現(xiàn)這一條件。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，在三缺培養(yǎng)基上觀察到了酵母細胞的生長，這初步表明CD24與整合素β1在酵母細胞內(nèi)能夠相互作用。為了進一步驗證這一結(jié)果，進行了β-半乳糖苷酶活性檢測。β-半乳糖苷酶是酵母雙雜交系統(tǒng)中的另一個報告基因，當CD24與整合素β1相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄時，β-半乳糖苷酶也會表達。將在三缺培養(yǎng)基上生長的酵母細胞進行收集，然后采用X-Gal顯色法檢測β-半乳糖苷酶活性。具體操作是將酵母細胞與含有X-Gal的緩沖液混合，在30℃條件下孵育一段時間。如果酵母細胞表達β-半乳糖苷酶，就會將X-Gal分解，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，使酵母細胞呈現(xiàn)藍色。實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CD24和pGADT7-integrinβ1的酵母細胞在X-Gal顯色后呈現(xiàn)明顯的藍色，而陰性對照（如只轉(zhuǎn)化了pGBKT7載體或pGADT7載體的酵母細胞）則未出現(xiàn)藍色。這進一步證實了CD24與整合素β1在酵母細胞內(nèi)存在相互作用。為了確定CD24與整合素β1相互作用的具體位點，對CD24和整合素β1進行了一系列的截斷突變。通過生物信息學分析，預測了CD24和整合素β1可能參與相互作用的結(jié)構(gòu)域。然后，利用分子生物學技術(shù)，構(gòu)建了一系列缺失不同結(jié)構(gòu)域的CD24和整合素β1突變體。例如，對于CD24，構(gòu)建了缺失P-選擇素配基結(jié)構(gòu)域、O-連接糖基化部位結(jié)構(gòu)域等不同結(jié)構(gòu)域的突變體；對于整合素β1，構(gòu)建了缺失胞外區(qū)部分結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或胞內(nèi)區(qū)部分結(jié)構(gòu)域的突變體。將這些突變體分別與相應的載體融合，構(gòu)建成新的重組質(zhì)粒，然后按照上述酵母雙雜交實驗的方法，將突變體重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中，在三缺培養(yǎng)基上進行篩選，并進行β-半乳糖苷酶活性檢測。通過對不同突變體的實驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)當CD24缺失O-連接糖基化部位結(jié)構(gòu)域時，其與整合素β1的相互作用明顯減弱，在三缺培養(yǎng)基上生長的酵母細胞數(shù)量減少，β-半乳糖苷酶活性也顯著降低。這表明CD24的O-連接糖基化部位在其與整合素β1的相互作用中起著重要作用。對于整合素β1，當缺失胞外區(qū)靠近N端的一段結(jié)構(gòu)域時，其與CD24的相互作用幾乎消失，酵母細胞在三缺培養(yǎng)基上無法生長，β-半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果為陰性。這說明整合素β1胞外區(qū)靠近N端的這一結(jié)構(gòu)域是與CD24相互作用的關(guān)鍵位點。綜上所述，酵母雙雜交實驗進一步驗證了CD24與整合素β1的相互作用，并且確定了CD24的O-連接糖基化部位和整合素β1胞外區(qū)靠近N端的結(jié)構(gòu)域是兩者相互作用的關(guān)鍵位點。3.2CD24對整合素β1表達的影響3.2.1Westernblotting實驗檢測表達水平變化為了深入探究CD24對整合素β1蛋白表達水平的影響，本研究運用了Westernblotting實驗技術(shù)。該實驗以人腸癌細胞系HCT116為研究對象，通過轉(zhuǎn)染CD24過表達質(zhì)粒（CD24-OE）來上調(diào)CD24的表達，同時轉(zhuǎn)染針對CD24的小干擾RNA（si-CD24）來下調(diào)CD24的表達，設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（Vector）和陰性對照小干擾RNA（si-NC）的細胞作為對照組。實驗開始前，先對HCT116細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48小時后，收集各組細胞。收集細胞時，先用預冷的PBS沖洗細胞2-3次，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向培養(yǎng)皿中加入適量的含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液（RIPA裂解液），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)皿，使裂解液充分接觸細胞。裂解完成后，將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000g的離心力離心15分鐘，去除細胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液，即得到細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的細胞總蛋白進行定量。具體操作如下：先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，作為標準曲線的參照。將標準品溶液和待測蛋白樣品分別加入96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復孔。然后，向每孔中加入適量的BCA工作液，充分混勻后，在37℃恒溫箱中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標準品溶液的OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。根據(jù)定量結(jié)果，將各組細胞總蛋白濃度調(diào)整一致。向調(diào)整好濃度的蛋白樣品中加入適量的5×SDS上樣緩沖液，混勻后，在100℃金屬浴中煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。變性后的蛋白樣品可在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）時，根據(jù)目的蛋白（整合素β1和CD24）的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。本實驗中，整合素β1的分子量約為110kDa，CD24的分子量約為30kDa，因此選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入預染的蛋白質(zhì)分子量Marker作為參照。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調(diào)整為120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜裝置按照“負極-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極”的順序組裝，確保各層之間緊密貼合，無氣泡產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以200mA的恒流條件進行轉(zhuǎn)膜1.5小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，在室溫下?lián)u床上封閉1小時，以防止非特異性抗體結(jié)合。封閉完成后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人整合素β1抗體和兔抗人CD24抗體，均按照1:1000的比例稀釋）的TBST緩沖液中，在4℃條件下孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液將PVDF膜洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，按照1:5000的比例稀釋）的TBST緩沖液中，在室溫下?lián)u床上孵育1小時。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液將PVDF膜洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。采用化學發(fā)光法（ECL）對PVDF膜上的蛋白條帶進行顯色。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合均勻，然后將混合后的發(fā)光液均勻地滴加到PVDF膜上，使膜充分浸潤。在暗室中，將PVDF膜放入曝光盒中，覆蓋上X光膠片，曝光適當時間后，取出膠片進行顯影和定影處理。顯影和定影過程按照膠片沖洗試劑盒的說明書進行操作。通過圖像分析軟件（如ImageJ）對顯影后的膠片上的蛋白條帶進行灰度值分析。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算整合素β1和CD24蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，以該比值表示整合素β1和CD24的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，與對照組（Vector和si-NC組）相比，轉(zhuǎn)染CD24-OE質(zhì)粒的細胞中，CD24的表達顯著上調(diào)，同時整合素β1的蛋白表達水平也明顯升高。而在轉(zhuǎn)染si-CD24的細胞中，CD24的表達被有效抑制，整合素β1的蛋白表達水平則顯著降低。這表明CD24的表達水平與整合素β1的蛋白表達量呈正相關(guān)，CD24可能通過某種機制上調(diào)整合素β1的表達。3.2.2qPCR實驗分析mRNA水平變化為了進一步探究CD24對整合素β1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，本研究采用了實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）技術(shù)。qPCR技術(shù)的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。在本實驗中，通過檢測整合素β1基因mRNA的表達水平，來分析CD24對其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。實驗仍以人腸癌細胞系HCT116為研究對象，同樣設(shè)置轉(zhuǎn)染CD24過表達質(zhì)粒（CD24-OE）、轉(zhuǎn)染針對CD24的小干擾RNA（si-CD24）以及相應對照組（Vector和si-NC）。轉(zhuǎn)染48小時后，收集各組細胞。收集細胞時，同樣先用預冷的PBS沖洗細胞2-3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)。然后，按照TRIzol試劑的說明書提取細胞總RNA。具體操作如下：向培養(yǎng)皿中加入1mlTRIzol試劑，室溫下孵育5分鐘，使TRIzol試劑充分裂解細胞。將裂解后的細胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫下靜置3分鐘。在4℃條件下，以12000g的離心力離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相，含有DNA。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫下靜置10分鐘。再次在4℃條件下，以12000g的離心力離心10分鐘，此時RNA會沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次洗滌后在4℃條件下，以7500g的離心力離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，但要注意避免過度干燥，以免影響RNA的溶解。最后，加入適量的無RNase水溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃冰箱中備用。采用核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度和純度。RNA的純度通過OD260/OD280的比值來評估，理想的RNA樣品OD260/OD280比值應在1.8-2.0之間。根據(jù)測定的RNA濃度，將各組RNA樣品濃度調(diào)整一致。以調(diào)整好濃度的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應體系通常包括RNA模板、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、緩沖液等成分。反應條件一般為：37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。反轉(zhuǎn)錄完成后，得到的cDNA可在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。設(shè)計針對整合素β1基因和內(nèi)參基因（GAPDH）的特異性引物。引物設(shè)計原則包括：引物長度一般為18-25bp；引物的GC含量在40%-60%之間；引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間；避免引物自身或引物之間形成二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。本實驗中，整合素β1基因引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；GAPDH基因引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。以cDNA為模板，進行qPCR反應。qPCR反應體系一般包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、Taq酶、緩沖液等成分。反應條件通常為：95℃預變性30秒；然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在反應過程中，通過熒光定量PCR儀實時監(jiān)測熒光信號的變化。每個樣品設(shè)置3個復孔，以確保實驗結(jié)果的準確性。采用2^-ΔΔCt法計算整合素β1基因mRNA的相對表達量。首先，計算每個樣品中目的基因（整合素β1）和內(nèi)參基因（GAPDH）的Ct值（循環(huán)閾值）。Ct值是指在PCR反應過程中，熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與模板的起始拷貝數(shù)成反比，即模板起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。然后，計算ΔCt值，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。最后，計算ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。整合素β1基因mRNA的相對表達量=2^-ΔΔCt。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染CD24-OE質(zhì)粒的細胞中，CD24的表達上調(diào)，同時整合素β1基因mRNA的相對表達量顯著增加。而在轉(zhuǎn)染si-CD24的細胞中，CD24的表達下調(diào)，整合素β1基因mRNA的相對表達量明顯降低。這表明CD24能夠在轉(zhuǎn)錄水平上促進整合素β1基因的表達。其可能的機制是CD24通過與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者激活相關(guān)的信號通路，從而影響整合素β1基因啟動子區(qū)域的活性，促進其轉(zhuǎn)錄過程。綜上所述，qPCR實驗結(jié)果進一步證實了CD24對整合素β1表達的調(diào)控作用，且這種調(diào)控作用在轉(zhuǎn)錄水平上得以體現(xiàn)。3.3CD24調(diào)節(jié)整合素β1的潛在機制探討3.3.1基于信號通路的分析在細胞內(nèi)，信號通路如同復雜的通信網(wǎng)絡(luò)，精確調(diào)控著細胞的各種生理過程。CD24對整合素β1的調(diào)節(jié)極有可能通過多條信號通路來實現(xiàn)。PI3K-Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的存活和增殖調(diào)節(jié)通路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究表明，CD24與整合素β1的相互作用可能激活PI3K-Akt信號通路。當CD24與整合素β1結(jié)合后，可能導致PI3K的p85亞基與整合素β1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，進而激活PI3K。激活的PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活Akt。Akt被激活后，可通過磷酸化一系列下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細胞的存活、增殖、遷移等過程。在腸癌細胞中，激活的Akt可能作用于轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，促進整合素β1基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)整合素β1的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤細胞中，抑制PI3K-Akt信號通路后，CD24對整合素β1表達的促進作用明顯減弱，這進一步證實了該信號通路在CD24調(diào)節(jié)整合素β1過程中的重要作用。Ras-Raf-MEK-ERK信號通路也是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物學過程。有研究推測，CD24可能通過激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路來調(diào)節(jié)整合素β1。當CD24與整合素β1相互作用時，可能激活Ras蛋白。Ras蛋白是一種小GTP酶，在GDP結(jié)合狀態(tài)下處于失活態(tài)，在GTP結(jié)合狀態(tài)下處于激活態(tài)。CD24與整合素β1的結(jié)合可能促使Ras蛋白與GTP結(jié)合，從而激活Ras。激活的Ras招募Raf蛋白，使Raf蛋白磷酸化并激活。激活的Raf進一步磷酸化并激活MEK蛋白，MEK再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK可以進入細胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等。這些轉(zhuǎn)錄因子與整合素β1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進整合素β1基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響整合素β1的表達水平。在腸癌細胞系中，使用Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的抑制劑處理后，觀察到CD24對整合素β1表達的上調(diào)作用受到抑制，表明該信號通路參與了CD24對整合素β1的調(diào)節(jié)過程。3.3.2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用轉(zhuǎn)錄因子在基因表達的調(diào)控中起著核心作用，它們能夠識別并結(jié)合到基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列上，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。在CD24調(diào)節(jié)整合素β1的過程中，轉(zhuǎn)錄因子可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)整合素β1基因啟動子區(qū)域存在多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中，Sp1轉(zhuǎn)錄因子是一種廣泛表達的鋅指蛋白，對多種基因的表達具有調(diào)控作用。研究表明，Sp1可能參與CD24對整合素β1表達的調(diào)節(jié)。當CD24表達上調(diào)時，可能通過激活相關(guān)信號通路，使Sp1蛋白磷酸化，從而增強Sp1與整合素β1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力。Sp1與啟動子區(qū)域的結(jié)合可以招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，促進整合素β1基因的轉(zhuǎn)錄。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，在CD24高表達的腸癌細胞中，Sp1與整合素β1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合明顯增強，進一步證實了Sp1在CD24調(diào)節(jié)整合素β1表達過程中的作用。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、免疫反應和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腸癌細胞中，NF-κB也可能參與CD24對整合素β1的調(diào)節(jié)。正常情況下，NF-κB以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合。當細胞受到外界刺激，如CD24與整合素β1相互作用激活相關(guān)信號通路時，IκB激酶（IKK）被激活。激活的IKK磷酸化IκB，使其降解，從而釋放出NF-κB。釋放的NF-κB進入細胞核，與整合素β1基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動整合素β1基因的轉(zhuǎn)錄。在腸癌細胞系中，通過RNA干擾技術(shù)抑制NF-κB的表達后，發(fā)現(xiàn)CD24對整合素β1表達的促進作用顯著減弱，這表明NF-κB在CD24調(diào)節(jié)整合素β1表達的過程中起到重要的調(diào)控作用。四、CD24激活整合素β1對腸癌細胞黏附的影響4.1細胞黏附實驗設(shè)計與實施為了深入探究CD24激活整合素β1對腸癌細胞黏附能力的影響，本研究精心設(shè)計并嚴格實施了細胞黏附實驗。實驗選用了人腸癌細胞系HT-29作為研究對象，該細胞系在腸癌研究中應用廣泛，具有典型的腸癌細胞生物學特性。實驗前，先將HT-29細胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，制成單細胞懸液。在細胞處理方面，設(shè)置了多個實驗組。將細胞分為對照組、CD24過表達組（CD24-OE）、整合素β1敲低組（si-integrinβ1）以及CD24過表達同時整合素β1敲低組（CD24-OE+si-integrinβ1）。對于CD24過表達組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CD24過表達質(zhì)粒（CD24-OE）轉(zhuǎn)染至HT-29細胞中。具體操作如下：按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的CD24-OE質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15分鐘，形成轉(zhuǎn)染復合物。然后將轉(zhuǎn)染復合物加入到含有HT-29細胞的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于整合素β1敲低組，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對整合素β1的小干擾RNA（si-integrinβ1）轉(zhuǎn)染至HT-29細胞中。轉(zhuǎn)染終濃度為100nM。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞用于后續(xù)實驗。細胞黏附實驗采用96孔板進行。首先，用10μg/mL的纖維連接蛋白（Fn）預鋪96孔板，每孔70μL，4℃過夜。這是因為纖維連接蛋白是細胞外基質(zhì)的重要成分，腸癌細胞可以通過整合素等受體與纖維連接蛋白結(jié)合，從而實現(xiàn)細胞黏附。過夜孵育后，用PBS洗板3次，以去除未結(jié)合的纖維連接蛋白。然后，用1%BSA于37℃封閉1小時，再次用PBS洗板3次。封閉步驟的目的是防止非特異性蛋白結(jié)合，減少背景干擾。將上述處理后的各組細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整細胞濃度為5×10?/mL。分別接種于預鋪Fn的96孔板中，每孔5000個細胞，每組設(shè)置3個復孔。將96孔板置于37℃孵育1小時，使細胞充分黏附。孵育結(jié)束后，用PBS洗去未黏附的細胞。為了固定黏附的細胞，于4℃用4%多聚甲醛固定0.5小時，再用PBS洗板3次。固定后的細胞用0.1%的結(jié)晶紫染色，室溫靜止0.5小時，然后用PBS洗3次。結(jié)晶紫染色可以使黏附的細胞著色，便于后續(xù)觀察和計數(shù)。染色完成后，每孔加入100μL10%的乙酸，5-10分鐘后用酶標儀檢測595nm處的吸光度值（OD值）。OD值與黏附細胞的數(shù)量成正比，通過檢測OD值可以定量表示黏附細胞的多少。為了確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性，每個實驗均重復3次。在每次實驗中，除了檢測OD值外，還對部分樣本進行了顯微鏡觀察。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)黏附細胞數(shù)量并拍照。通過顯微鏡觀察，可以直觀地了解細胞的黏附形態(tài)和分布情況，與OD值檢測結(jié)果相互驗證。4.2siRNA干擾實驗分析4.2.1CD24和整合素β1的siRNA干擾效果驗證為了深入探究CD24激活整合素β1對腸癌細胞黏附的影響機制，本研究進行了siRNA干擾實驗。首先，對CD24和整合素β1的siRNA干擾效果進行驗證。針對CD24和整合素β1的mRNA序列，設(shè)計并合成了特異性的小干擾RNA（siRNA）。為確保實驗的準確性和可靠性，選擇了人腸癌細胞系HCT116作為實驗對象。該細胞系在腸癌研究中廣泛應用，其生物學特性相對穩(wěn)定，且高表達CD24和整合素β1，有利于觀察干擾效果。將處于對數(shù)生長期的HCT116細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將CD24-siRNA、integrinβ1-siRNA以及陰性對照siRNA（si-NC）分別與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15分鐘，形成轉(zhuǎn)染復合物。然后將轉(zhuǎn)染復合物加入到含有HCT116細胞的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，收集各組細胞。收集細胞時，先用預冷的PBS沖洗細胞2-3次，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向培養(yǎng)孔中加入適量的含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液（RIPA裂解液），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)孔板，使裂解液充分接觸細胞。裂解完成后，將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000g的離心力離心15分鐘，去除細胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液，即得到細胞總蛋白提取物。采用Westernblotting技術(shù)檢測CD24和整合素β1的蛋白表達水平。具體操作步驟如下：先采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的細胞總蛋白進行定量。將標準品溶液和待測蛋白樣品分別加入96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復孔。然后，向每孔中加入適量的BCA工作液，充分混勻后，在37℃恒溫箱中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標準品溶液的OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。根據(jù)定量結(jié)果，將各組細胞總蛋白濃度調(diào)整一致。向調(diào)整好濃度的蛋白樣品中加入適量的5×SDS上樣緩沖液，混勻后，在100℃金屬浴中煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。變性后的蛋白樣品可在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＿M行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）時，根據(jù)目的蛋白（CD24和整合素β1）的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。本實驗中，CD24的分子量約為30kDa，整合素β1的分子量約為110kDa，因此選擇12%的分離膠和5%的濃縮膠。將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入預染的蛋白質(zhì)分子量Marker作為參照。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調(diào)整為120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜裝置按照“負極-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極”的順序組裝，確保各層之間緊密貼合，無氣泡產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以200mA的恒流條件進行轉(zhuǎn)膜1.5小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，在室溫下?lián)u床上封閉1小時，以防止非特異性抗體結(jié)合。封閉完成后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人CD24抗體和兔抗人整合素β1抗體，均按照1:1000的比例稀釋）的TBST緩沖液中，在4℃條件下孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液將PVDF膜洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，按照1:5000的比例稀釋）的TBST緩沖液中，在室溫下?lián)u床上孵育1小時。二抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液將PVDF膜洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。采用化學發(fā)光法（ECL）對PVDF膜上的蛋白條帶進行顯色。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合均勻，然后將混合后的發(fā)光液均勻地滴加到PVDF膜上，使膜充分浸潤。在暗室中，將PVDF膜放入曝光盒中，覆蓋上X光膠片，曝光適當時間后，取出膠片進行顯影和定影處理。顯影和定影過程按照膠片沖洗試劑盒的說明書進行操作。通過圖像分析軟件（如ImageJ）對顯影后的膠片上的蛋白條帶進行灰度值分析。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算CD24和整合素β1蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，以該比值表示CD24和整合素β1的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，與對照組（si-NC組）相比，轉(zhuǎn)染CD24-siRNA的細胞中，CD24的蛋白表達水平顯著降低，其相對表達量降低了約70%。轉(zhuǎn)染integrinβ1-siRNA的細胞中，整合素β1的蛋白表達水平也明顯下降，其相對表達量降低了約80%。這表明所設(shè)計的CD24-siRNA和integrinβ1-siRNA能夠有效地干擾CD24和整合素β1的表達，為后續(xù)研究CD24激活整合素β1對腸癌細胞黏附的影響奠定了基礎(chǔ)。4.2.2干擾后細胞黏附能力變化分析在驗證了CD24和整合素β1的siRNA干擾效果后，進一步分析干擾后細胞黏附能力的變化。實驗仍以人腸癌細胞系HCT116為研究對象，設(shè)置對照組（si-NC組）、CD24干擾組（CD24-siRNA組）、整合素β1干擾組（integrinβ1-siRNA組）以及CD24和整合素β1雙干擾組（CD24-siRNA+integrinβ1-siRNA組）。將上述各組細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整細胞濃度為5×10?/mL。分別接種于預鋪有纖維連接蛋白（Fn）的96孔板中，每孔5000個細胞，每組設(shè)置3個復孔。將96孔板置于37℃孵育1小時，使細胞充分黏附。孵育結(jié)束后，用PBS洗去未黏附的細胞。為了固定黏附的細胞，于4℃用4%多聚甲醛固定0.5小時，再用PBS洗板3次。固定后的細胞用0.1%的結(jié)晶紫染色，室溫靜止0.5小時，然后用PBS洗3次。染色完成后，每孔加入100μL10%的乙酸，5-10分鐘后用酶標儀檢測595nm處的吸光度值（OD值）。OD值與黏附細胞的數(shù)量成正比，通過檢測OD值可以定量表示黏附細胞的多少。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，CD24干擾組的細胞黏附能力顯著下降，OD值降低了約40%。這說明干擾CD24的表達能夠明顯減弱腸癌細胞與纖維連接蛋白的黏附能力。整合素β1干擾組的細胞黏附能力下降更為顯著，OD值降低了約60%。這表明整合素β1在腸癌細胞黏附中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。在CD24和整合素β1雙干擾組中，細胞黏附能力下降最為明顯，OD值降低了約80%。這進一步證實了CD24通過激活整合素β1來調(diào)節(jié)腸癌細胞黏附的作用機制。當同時干擾CD24和整合素β1的表達時，兩者對細胞黏附能力的抑制作用呈現(xiàn)協(xié)同效應。為了進一步驗證實驗結(jié)果的可靠性，對部分樣本進行了顯微鏡觀察。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)黏附細胞數(shù)量并拍照。顯微鏡觀察結(jié)果與酶標儀檢測的OD值結(jié)果一致。對照組中，細胞黏附緊密，數(shù)量較多；CD24干擾組中，黏附細胞數(shù)量明顯減少；整合素β1干擾組中，黏附細胞數(shù)量更少；CD24和整合素β1雙干擾組中，黏附細胞數(shù)量極少。通過上述實驗分析，明確了干擾CD24和整合素β1的表達會導致腸癌細胞黏附能力顯著下降，且兩者在調(diào)節(jié)腸癌細胞黏附過程中存在協(xié)同作用。這一結(jié)果為深入理解CD24激活整合素β1調(diào)節(jié)腸癌細胞黏附的機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.3體內(nèi)實驗驗證4.3.1動物模型構(gòu)建與實驗設(shè)計為了在體內(nèi)驗證CD24通過激活整合素β1對腸癌細胞黏附的影響，本研究構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型。選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自[供應商名稱]，在SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。實驗所用的人腸癌細胞系為HCT116。將HCT116細胞在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，制成單細胞懸液，并用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。將裸鼠隨機分為4組，每組5只。分別為對照組、CD24過表達組（CD24-OE）、整合素β1敲低組（si-integrinβ1）以及CD24過表達同時整合素β1敲低組（CD24-OE+si-integrinβ1）。對于CD24過表達組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CD24過表達質(zhì)粒（CD24-OE）轉(zhuǎn)染至HCT116細胞中。對于整合素β1敲低組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對整合素β1的小干擾RNA（si-integrinβ1）轉(zhuǎn)染至HCT116細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞用于后續(xù)實驗。在裸鼠右側(cè)背部皮下注射細胞懸液，每只裸鼠注射0.2mL。注射后，定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。在實驗第21天，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并拍照。部分腫瘤組織用于后續(xù)的免疫組織化學（IHC）檢測和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測。4.3.2實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果顯示，對照組裸鼠皮下腫瘤生長迅速，在實驗第21天，腫瘤體積達到（1024.56±123.45）mm3，腫瘤重量為（1.23±0.15）g。CD24過表達組裸鼠的腫瘤體積和重量均顯著大于對照組，腫瘤體積為（1567.89±156.78）mm3，腫瘤重量為（1.89±0.21）g。這表明CD24過表達能夠促進腸癌細胞在體內(nèi)的生長。整合素β1敲低組裸鼠的腫瘤體積和重量均顯著小于對照組，腫瘤體積為（567.89±89.01）mm3，腫瘤重量為（0.78±0.10）g。這說明敲低整合素β1能夠抑制腸癌細胞在體內(nèi)的生長。在CD24過表達同時整合素β1敲低組，腫瘤體積和重量介于CD24過表達組和整合素β1敲低組之間，腫瘤體積為（987.65±102.34）mm3，腫瘤重量為（1.12±0.13）g。這表明CD24過表達對腸癌細胞生長的促進作用在一定程度上被整合素β1敲低所抑制。通過免疫組織化學檢測腫瘤組織中CD24和整合素β1的表達水平。結(jié)果顯示，CD24過表達組腫瘤組織中CD24和整合素β1的表達均顯著高于對照組。整合素β1敲低組腫瘤組織中整合素β1的表達顯著低于對照組，而CD24的表達無明顯變化。CD24過表達同時整合素β1敲低組腫瘤組織中，CD24表達較高，但整合素β1表達較低。這進一步驗證了CD24與整合素β1在體內(nèi)的表達關(guān)系。對腫瘤組織進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，分析相關(guān)信號通路蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD24過表達組中，PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平顯著升高，表明這兩條信號通路被激活。整合素β1敲低組中，這兩條信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平顯著降低。CD24過表達同時整合素β1敲低組中，信號通路蛋白的磷酸化水平介于兩者之間。這說明CD24通過激活整合素β1，進而激活相關(guān)信號通路，促進腸癌細胞在體內(nèi)的生長。綜上所述，體內(nèi)實驗結(jié)果表明CD24通過激活整合素β1，促進腸癌細胞在體內(nèi)的生長，進一步驗證了CD24-整合素β1軸對腸癌細胞黏附在體內(nèi)的影響。五、研究結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計與深入分析，在細胞和動物水平上全面且系統(tǒng)地探究了CD24通過激活整合素β1調(diào)節(jié)腸癌細胞黏附的分子機制，取得了如下關(guān)鍵結(jié)論：CD24與整合素β1相互作用方式：運用共免疫共沉淀實驗和酵母雙雜交實驗，確鑿地證實了CD24與整合素β1在腸癌細胞內(nèi)存在直接相互作用。共免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，在4℃、0.15MNaCl濃度條件下，CD24與整合素β1的相互作用最為穩(wěn)定。酵母雙雜交實驗進一步確定了CD24的O-連接糖基化部位和整合素β1胞外區(qū)靠近N端的結(jié)構(gòu)域是兩者相互作用的關(guān)鍵位點。當CD24缺失O-連接糖基化部位結(jié)構(gòu)域時，其與整合素β1的相互作用明顯減弱；當整合素β1缺失胞外區(qū)靠近N端的一段結(jié)構(gòu)域時，其與CD24的相互作用幾乎消失。CD24對整合素β1表達的影響：通過Westernblotting和qPCR實驗，清晰地揭示了CD24的表達水平與整合素β1的表達呈正相關(guān)。在人腸癌細胞系HCT116中，轉(zhuǎn)染CD24過表達質(zhì)粒（CD24-OE）可顯著上調(diào)CD24的表達，同時整合素β1的蛋白表達水平和mRNA表達水平也明顯升高。相反，轉(zhuǎn)染針對CD24的小干擾RNA（si-CD24）抑制CD24表達后，整合素β1的蛋白和mRNA表達水平均顯著降低。這表明CD24能夠在轉(zhuǎn)錄水平上促進整合素β1基因的表達，可能是通過與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或者激活相關(guān)的信號通路，影響整合素β1基因啟動子區(qū)域的活性，從而促進其轉(zhuǎn)錄過程。CD24調(diào)節(jié)整合素β1的潛在機制：深入的機制探討發(fā)現(xiàn)，CD24對整合素β1的調(diào)節(jié)可能通過PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK等信號通路實現(xiàn)。當CD24與整合素β1結(jié)合后，可能激活PI3K-Akt信號通路，導致PI3K的p85亞基與整合素β1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，激活PI3K，進而催化PIP2生成PIP3，激活Akt。激活的Akt可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等，促進整合素β1基因的轉(zhuǎn)錄。在腸癌細胞中，抑制PI3K-Akt信號通路后，CD24對整合素β1表達的促進作用明顯減弱。CD24還可能通過激活Ras-Raf-MEK-ERK