β1整合素與FN粘附對卵巢癌A2780細胞生物學(xué)行為的影響及機制探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在婦科惡性腫瘤中高居榜首，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。卵巢癌之所以死亡率高，主要有以下幾個原因。其一，卵巢位于盆腔深部，早期病變通常沒有明顯癥狀，很難在早期被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)患者確診時已處于晚期，病變范圍廣泛且發(fā)生轉(zhuǎn)移，大大增加了治療的難度。有數(shù)據(jù)表明，70%的卵巢癌患者確診時已是晚期，而晚期卵巢癌的五年生存率僅為39%。其二，卵巢癌的病情復(fù)雜多變，腫瘤細胞生長迅速，容易擴散到其他部位。其三，目前針對卵巢癌的治療手段，如手術(shù)、化療和放療等，存在一定的局限性，對于晚期和轉(zhuǎn)移性卵巢癌的治療效果并不理想。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后與腫瘤細胞所處的微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境是一個由腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、細胞因子、免疫細胞等共同構(gòu)成的局部病理環(huán)境，具有組織缺氧、酸中毒、間質(zhì)高壓等特點。在腫瘤微環(huán)境中，細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用對腫瘤細胞的生物學(xué)行為有著重要影響。細胞外基質(zhì)主要由膠原、纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸等成分組成，不僅為細胞提供結(jié)構(gòu)支持，還參與細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等過程。整合素是一類細胞表面受體，能夠介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)以及細胞與細胞之間的黏附。β1整合素是整合素家族中的重要成員，廣泛分布于各種類型的細胞表面。它可以與細胞外基質(zhì)中的多種配體，如FN、Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白等結(jié)合，在細胞的生長、分化、遷移和信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，β1整合素在卵巢癌中高表達，且與卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。當(dāng)β1整合素與配體結(jié)合后，可激活一系列細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為。纖維連接蛋白（FN）是細胞外基質(zhì)的主要成分之一，它含有多個結(jié)構(gòu)域，能夠與多種細胞表面受體結(jié)合，包括β1整合素。FN在腫瘤微環(huán)境中含量豐富，不僅參與細胞外基質(zhì)的構(gòu)建，還通過與細胞表面受體相互作用，影響腫瘤細胞的黏附、遷移和增殖等過程。在卵巢癌中，F(xiàn)N的表達水平與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞與FN的黏附能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。A2780細胞是一種常用的卵巢癌細胞系，廣泛應(yīng)用于卵巢癌的研究。研究β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞增殖及凋亡的影響，有助于深入了解卵巢癌的發(fā)病機制，為卵巢癌的治療提供新的靶點和策略。通過探討β1整合素與FN粘附介導(dǎo)的信號通路，有望揭示卵巢癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控機制，為開發(fā)針對卵巢癌的靶向治療藥物提供理論依據(jù)。此外，研究結(jié)果還可能為卵巢癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物，具有重要的臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，關(guān)于β1整合素和FN在腫瘤領(lǐng)域的研究開展較早且較為深入。有研究表明，β1整合素在多種腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在乳腺癌細胞中，β1整合素與FN的結(jié)合能夠激活細胞內(nèi)的信號通路，促進癌細胞的遷移和侵襲，從而增加腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，β1整合素的高表達與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。對于卵巢癌，國外學(xué)者通過大量實驗證實，β1整合素在卵巢癌細胞表面高度表達，并且其表達水平與卵巢癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。卵巢癌細胞與FN的粘附可增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，促進卵巢癌的腹膜轉(zhuǎn)移。有研究利用卵巢癌動物模型，發(fā)現(xiàn)阻斷β1整合素與FN的相互作用后，卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯降低，小鼠的生存期顯著延長。國內(nèi)的研究也在不斷深入，取得了一系列重要成果。在對β1整合素在卵巢癌中的作用機制研究中，發(fā)現(xiàn)β1整合素與FN結(jié)合后，可通過激活FAK、Src等激酶，調(diào)節(jié)下游信號通路，進而影響卵巢癌細胞的增殖、凋亡和遷移。有研究表明，β1整合素介導(dǎo)的卵巢癌細胞與FN的粘附能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制卵巢癌細胞的凋亡。國內(nèi)學(xué)者還關(guān)注到β1整合素與FN的相互作用在卵巢癌耐藥中的作用，發(fā)現(xiàn)該粘附作用可導(dǎo)致卵巢癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，其機制可能與調(diào)節(jié)藥物外排泵的表達和活性有關(guān)。盡管國內(nèi)外在β1整合素與FN對卵巢癌的影響方面取得了不少成果，但仍存在一些不足與空白。目前的研究主要集中在β1整合素與FN相互作用對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，而對其在卵巢癌細胞凋亡調(diào)控方面的研究還不夠系統(tǒng)和深入。對于β1整合素與FN粘附介導(dǎo)的信號通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的動態(tài)變化以及各信號分子之間的相互作用機制，還需要進一步探究。在臨床應(yīng)用方面，雖然有研究提出β1整合素可能成為卵巢癌治療的潛在靶點，但如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，仍有待進一步探索。本文將針對這些不足，深入研究β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞增殖及凋亡的影響，旨在為卵巢癌的治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)和潛在的治療策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞增殖及凋亡的影響，并初步探索其相關(guān)的信號傳導(dǎo)機制。通過對這一課題的研究，有望為卵巢癌的發(fā)病機制研究提供新的理論依據(jù)，為卵巢癌的治療尋找潛在的分子靶點和治療策略。本研究的具體內(nèi)容如下：β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞增殖的影響：通過體外細胞培養(yǎng)實驗，構(gòu)建不同的細胞培養(yǎng)體系。將卵巢癌A2780細胞分別接種于多聚賴氨酸鋪板的對照組、FN鋪板的實驗組A以及FN鋪板且加入整合素β1單克隆抗體的實驗組B。利用CCK-8法在不同時間點檢測三組細胞的增殖情況，繪制細胞增殖曲線，對比分析各組細胞的增殖率，明確β1整合素與FN的粘附對A2780細胞增殖的影響。同時，采用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿苷）標(biāo)記法，直觀地觀察細胞的DNA合成情況，進一步驗證β1整合素與FN粘附對細胞增殖的作用。β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞凋亡的影響：在上述構(gòu)建的細胞培養(yǎng)體系中，利用Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)，檢測順鉑誘導(dǎo)下三組細胞的凋亡率。通過分析凋亡細胞的比例，明確β1整合素與FN的粘附對A2780細胞凋亡的影響。同時，采用TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）染色法，對凋亡細胞進行原位標(biāo)記，在顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)和數(shù)量，進一步確認(rèn)β1整合素與FN粘附對細胞凋亡的調(diào)控作用。此外，運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等的表達水平，從分子層面揭示β1整合素與FN的粘附影響細胞凋亡的機制。β1整合素與FN粘附介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機制研究：采用實時定量RT-PCR技術(shù)，檢測與細胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，如AuroraB、Survivin等的mRNA水平變化，分析β1整合素與FN的粘附對這些基因表達的影響。運用Westernblot技術(shù)，檢測FAK、Src等信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，探究β1整合素與FN粘附激活的下游信號通路。此外，通過使用信號通路抑制劑，阻斷相關(guān)信號通路，觀察細胞增殖和凋亡的變化，進一步驗證信號傳導(dǎo)機制。1.4研究方法與技術(shù)路線細胞培養(yǎng)：從細胞庫購買卵巢癌A2780細胞，將其置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗。實驗分組：設(shè)置三組不同的細胞培養(yǎng)條件。對照組：將A2780細胞接種于多聚賴氨酸鋪板的培養(yǎng)板中，多聚賴氨酸能夠促進細胞貼壁，但不提供與β1整合素特異性結(jié)合的配體，作為基礎(chǔ)對照。實驗組A：將A2780細胞接種于FN鋪板的培養(yǎng)板中，F(xiàn)N作為β1整合素的配體，可與細胞表面的β1整合素結(jié)合，模擬腫瘤微環(huán)境中細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用。實驗組B：在FN鋪板的培養(yǎng)板中，先加入整合素β1單克隆抗體，孵育一段時間后，再接種A2780細胞。整合素β1單克隆抗體能夠特異性地阻斷β1整合素與FN的結(jié)合，從而研究β1整合素與FN粘附被阻斷后對細胞的影響。CCK-8法檢測細胞增殖：取對數(shù)期生長的A2780細胞，調(diào)整細胞濃度為5×103個/mL，分別接種于96孔板中，每孔100μL。按照上述分組，分別進行處理。在接種后的0h、24h、48h、72h，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值代表細胞數(shù)量，繪制細胞增殖曲線，計算細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。EdU標(biāo)記法檢測細胞DNA合成：按照EdU試劑盒說明書進行操作。將不同處理組的A2780細胞接種于含有EdU的培養(yǎng)基中，孵育2h，使EdU摻入到正在進行DNA合成的細胞中。用4%多聚甲醛固定細胞，0.5%TritonX-100破膜，然后加入Apollo染色液進行染色，最后用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽性細胞（紅色熒光）表示正在進行DNA合成的細胞，統(tǒng)計EdU陽性細胞占總細胞數(shù)（藍色熒光）的比例，評估細胞的增殖活性。Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：將不同處理組的A2780細胞培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，PBS洗滌兩次，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。按照Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒說明書，向細胞懸液中加入5μLAnnexin-V-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。加入400μLBindingBuffer，立即用流式細胞儀進行檢測。流式細胞儀通過檢測Annexin-V-FITC（綠色熒光）和PI（紅色熒光）的信號強度，區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，計算凋亡細胞所占比例。TUNEL染色法檢測細胞凋亡：將不同處理組的A2780細胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)48h后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100破膜。按照TUNEL試劑盒說明書，加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，37℃孵育60min。用PBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細胞（棕色）表示凋亡細胞，統(tǒng)計凋亡細胞占總細胞數(shù)的比例。Westernblot檢測蛋白表達水平：收集不同處理組的A2780細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性。進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗（如Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、FAK、p-FAK、Src、p-Src等），4℃孵育過夜。TBST洗滌三次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。TBST洗滌三次后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，曝光，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實時定量RT-PCR檢測基因表達水平：使用TRIzol試劑提取不同處理組A2780細胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物（如AuroraB、Survivin等基因的引物），在實時定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA、SYBRGreenMasterMix、上下游引物等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從細胞培養(yǎng)、分組處理到各項檢測指標(biāo)及分析方法的流程，如細胞培養(yǎng)分為對照組、實驗組A和實驗組B，分別進行不同處理后，通過CCK-8法、EdU標(biāo)記法檢測細胞增殖，Annexin-V/PI雙染法、TUNEL染色法檢測細胞凋亡，Westernblot檢測蛋白表達，實時定量RT-PCR檢測基因表達等步驟，各步驟之間用箭頭表示先后順序和相互關(guān)系]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中極為常見且嚴(yán)重的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。據(jù)統(tǒng)計，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中約占3%-5%，但死亡率卻在婦科惡性腫瘤中高居首位。在我國，每年新發(fā)病例約為5.2萬，死亡病例約為2.2萬，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。卵巢癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中起著重要作用，約10%-15%的卵巢癌患者具有遺傳背景。BRCA1和BRCA2基因突變是卵巢癌最常見的遺傳因素，攜帶這些基因突變的女性，其一生中患卵巢癌的風(fēng)險可高達40%-60%。此外，年齡也是卵巢癌發(fā)病的重要危險因素，卵巢癌的發(fā)病率隨年齡的增長而逐漸升高，尤其是在50歲以上的女性中更為常見。長期的無排卵狀態(tài)，如多囊卵巢綜合征患者，由于持續(xù)的雌激素刺激，也會增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險。肥胖、不良的飲食習(xí)慣（如高脂肪、低纖維飲食）以及長期接觸有害物質(zhì)等，也可能與卵巢癌的發(fā)病相關(guān)。卵巢癌具有獨特的轉(zhuǎn)移特點。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易被察覺，多數(shù)患者確診時已處于晚期，此時腫瘤細胞往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。卵巢癌最常見的轉(zhuǎn)移方式是直接蔓延和種植轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞可直接侵犯周圍組織，如子宮、輸卵管、膀胱、直腸等，導(dǎo)致盆腔臟器受累。種植轉(zhuǎn)移則是卵巢癌細胞脫落并種植在腹膜、大網(wǎng)膜等部位，形成廣泛的轉(zhuǎn)移灶。這種轉(zhuǎn)移方式使得卵巢癌的治療變得極為困難，手術(shù)難以徹底清除所有的腫瘤細胞。卵巢癌還可通過淋巴道和血行轉(zhuǎn)移到遠處器官，如淋巴結(jié)、肝臟、肺部等，進一步加重病情。卵巢癌的耐藥性問題是臨床治療中的一大難題。目前，卵巢癌的主要治療手段包括手術(shù)、化療和放療等，其中化療是卵巢癌綜合治療的重要組成部分。然而，許多卵巢癌患者在化療過程中會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)率高。耐藥性的產(chǎn)生機制較為復(fù)雜，涉及多個方面。腫瘤細胞的多藥耐藥蛋白（MDR）表達增加，可將化療藥物泵出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。腫瘤干細胞的存在也是導(dǎo)致耐藥的重要原因之一，腫瘤干細胞具有自我更新和多向分化的能力，對化療藥物具有較強的耐受性，能夠在化療后存活并重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力增強、凋亡途徑受阻以及腫瘤微環(huán)境的改變等，也都與卵巢癌的耐藥性密切相關(guān)。卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)著嚴(yán)峻的地位，其發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移廣泛以及耐藥性等問題，給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。深入研究卵巢癌的發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移特點以及耐藥機制，對于提高卵巢癌的早期診斷率、改善治療效果、降低死亡率具有重要意義。2.2A2780細胞特性A2780細胞是一種人卵巢癌細胞系，其來源為未經(jīng)治療的患者的腫瘤組織。該細胞系具有上皮細胞樣形態(tài)，在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)貼壁生長的特性。在生長特性方面，A2780細胞在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠保持良好的生長狀態(tài)。其生長速度較快，在對數(shù)生長期，細胞數(shù)量會呈指數(shù)增長。一般來說，在常規(guī)的細胞培養(yǎng)體系中，細胞會在接種后的24-48小時內(nèi)貼壁并開始生長，4-5天左右可達到80%-90%的融合度，此時需要進行傳代處理，以維持細胞的正常生長和代謝。A2780細胞的培養(yǎng)需要特定的條件。常用的培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠滿足A2780細胞生長和代謝的需求。為了提供細胞生長所需的各種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，需要在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清。胎牛血清中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、激素等成分，對細胞的生長和存活起著重要作用。同時，為了防止細菌污染，培養(yǎng)基中還需加入100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，青霉素主要抑制革蘭氏陽性菌的生長，鏈霉素主要抑制革蘭氏陰性菌的生長，兩者聯(lián)合使用可有效防止細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。培養(yǎng)環(huán)境需維持在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，37℃是人體細胞的最適生長溫度，5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值在7.2-7.4之間，為細胞提供適宜的生長環(huán)境。細胞傳代是細胞培養(yǎng)過程中的重要操作。當(dāng)A2780細胞生長至80%-90%融合度時，就需要進行傳代。傳代時，首先用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，胰蛋白酶能夠分解細胞間的蛋白質(zhì)，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來。消化過程需要在顯微鏡下密切觀察，當(dāng)細胞變圓且大部分開始脫落時，及時加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，血清中的蛋白質(zhì)可以中和胰蛋白酶的活性，防止過度消化對細胞造成損傷。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以900-1000rpm的轉(zhuǎn)速離心3-5分鐘，離心可以使細胞沉淀到離心管底部，便于去除上清液。棄去上清液后，用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，按照1:2-1:4的比例進行傳代，具體比例可根據(jù)細胞的生長狀態(tài)和實驗需求進行調(diào)整。細胞凍存是保存細胞的重要方法。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好時，可進行凍存操作。凍存液通常由90%胎牛血清和10%DMSO組成，DMSO能夠降低細胞在凍存過程中的冰晶損傷，保護細胞的活性。將細胞用凍存液重懸后，調(diào)整細胞密度為1×10?-1×10?個/mL，分裝到凍存管中。將凍存管放入程序凍存盒中，先在-80℃冰箱中過夜，使細胞緩慢降溫，然后轉(zhuǎn)入液氮中保存，液氮的極低溫度（-196℃）能夠長期保持細胞的活性。細胞復(fù)蘇是將凍存的細胞重新恢復(fù)到生長狀態(tài)的過程。從液氮中取出凍存管后，應(yīng)迅速將其放入37℃水浴中，輕輕搖晃，使細胞快速解凍。解凍后的細胞需盡快轉(zhuǎn)移至含有適量培養(yǎng)基的離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心3-5分鐘，去除凍存液，因為凍存液中的DMSO對細胞有一定的毒性。棄去上清液后，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)A2780細胞時，需要注意以下事項。不同品牌的胰蛋白酶消化能力存在差異，在使用新品牌的胰蛋白酶時，需要先進行預(yù)實驗，確定最佳的消化時間，以避免消化過度或不足對細胞造成損傷。消化傳代細胞時，吹打細胞的動作要盡量輕柔，避免產(chǎn)生過多氣泡，因為氣泡會對細胞造成物理損傷，影響細胞的狀態(tài)。在細胞培養(yǎng)過程中，要定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等，及時發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的問題，如細胞污染、生長緩慢等。凍存細胞轉(zhuǎn)入液氮后，應(yīng)及時復(fù)蘇一管檢查細胞凍存活性，若發(fā)現(xiàn)細胞活性異常，需及時調(diào)整凍存或復(fù)蘇方案。2.3β1整合素與FN的結(jié)構(gòu)和功能β1整合素是整合素家族中的重要成員，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由α和β兩個亞單位通過非共價鍵結(jié)合形成異二聚體。目前已知至少有18種α亞單位和8種β亞單位，它們按不同的組合構(gòu)成不少于24種的整合素受體。β1整合素的α和β亞單位都具有較長的胞外域、一個跨膜域和一個較短的胞內(nèi)域（約30-40個氨基酸）。其中，胞外域是β1整合素與配體特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位，其結(jié)構(gòu)的多樣性決定了β1整合素能夠與多種細胞外基質(zhì)成分相互作用。跨膜域的近膜區(qū)結(jié)構(gòu)變異多樣，是多種細胞因子及可溶性調(diào)節(jié)因子的作用靶點，這些因子可以通過與跨膜域相互作用，調(diào)節(jié)β1整合素的活性。而胞內(nèi)域的羧基端形態(tài)多樣，當(dāng)胞內(nèi)域β亞基與酪氨酸激酶（如Src激酶）、黏著斑激酶（FAK）結(jié)合形成黏著斑復(fù)合體時，可進一步連接細胞骨架蛋白，從而啟動胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。在細胞中，β1整合素主要介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)的黏附。它可以與細胞外基質(zhì)中的多種配體，如Ⅳ型膠原蛋白、纖維連接蛋白（FN）、玻璃體結(jié)合蛋白（VN）和層粘連蛋白（LN）等結(jié)合，這種黏附作用不僅為細胞提供了結(jié)構(gòu)支持，還參與了細胞的多種生物學(xué)過程。β1整合素與配體結(jié)合后，能夠激活一系列細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等行為。在細胞遷移過程中，β1整合素與細胞外基質(zhì)的黏附可以提供牽引力，促使細胞向前移動；在細胞增殖過程中，β1整合素介導(dǎo)的信號通路可以調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，促進細胞的分裂。已有研究表明，β1整合素在多種腫瘤細胞中高表達，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在卵巢癌中，β1整合素的表達水平明顯高于正常卵巢組織，且其表達量與卵巢癌的分期、分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。高表達的β1整合素可以增強卵巢癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附能力，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，從而增加卵巢癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。纖維連接蛋白（FN）是一種大分子糖蛋白，分子量約為450KD。它由兩個亞基通過C端的二硫鍵交聯(lián)形成，每個亞基的分子量為220-250kDa。FN分子結(jié)構(gòu)中含有多個結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了FN多種生物學(xué)功能。FN分子中含有與細胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠與細胞膜上的整合素受體特異性結(jié)合，其中與β1整合素的結(jié)合關(guān)系尤為密切。FN還含有與其他細胞外基質(zhì)成分結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，如與膠原蛋白、肝素等結(jié)合的位點，這使得FN能夠參與細胞外基質(zhì)的構(gòu)建，維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性和完整性。FN廣泛存在于動物組織和組織液中，在細胞外基質(zhì)中，F(xiàn)N以血漿FN、細胞FN和胎兒FN三種形式存在。在人體中，F(xiàn)N共有20余種形式，廣泛分布于血液、體液以及各種組織中。作為細胞外基質(zhì)的重要組成部分，F(xiàn)N在調(diào)節(jié)細胞活動過程中起著關(guān)鍵作用。它可以調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移、增殖等過程。在細胞黏附方面，F(xiàn)N與細胞表面的β1整合素結(jié)合后，能夠促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，增強細胞的附著力；在細胞遷移過程中，F(xiàn)N可以作為細胞遷移的底物，為細胞提供遷移的路徑和方向；在細胞增殖方面，F(xiàn)N通過與β1整合素相互作用，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞的增殖。已有研究表明，F(xiàn)N在腫瘤微環(huán)境中含量豐富，其表達水平與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在卵巢癌中，腫瘤組織周圍的細胞外基質(zhì)中FN的含量明顯增加，卵巢癌細胞與FN的黏附能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。高表達的FN可以為卵巢癌細胞提供更多的黏附位點，增強腫瘤細胞與周圍組織的相互作用，從而促進腫瘤的擴散。2.4細胞增殖與凋亡相關(guān)理論細胞增殖是指細胞通過分裂增加細胞數(shù)量的過程，是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。在正常生理狀態(tài)下，細胞增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。細胞增殖的方式主要包括有絲分裂和減數(shù)分裂。有絲分裂是體細胞增殖的主要方式，通過有絲分裂，一個母細胞可以分裂成兩個遺傳物質(zhì)完全相同的子細胞，保證了細胞遺傳信息的穩(wěn)定性和連續(xù)性。減數(shù)分裂則是生殖細胞形成過程中的特殊分裂方式，通過減數(shù)分裂，生殖細胞的染色體數(shù)目減半，在受精過程中，精子和卵子結(jié)合，恢復(fù)正常的染色體數(shù)目，從而保證了物種染色體數(shù)目的恒定。細胞增殖的調(diào)控機制十分復(fù)雜，涉及多個層面。細胞周期是細胞增殖的核心過程，它包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。在細胞周期的不同階段，存在著多個檢查點，如G1/S檢查點、G2/M檢查點等，這些檢查點可以監(jiān)控細胞的生長狀態(tài)、DNA的完整性以及細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性等。只有當(dāng)細胞滿足了所有的檢查點要求，才能順利進入下一個階段。當(dāng)細胞在G1期檢測到DNA損傷時，會激活一系列的修復(fù)機制，若損傷無法修復(fù)，細胞則會進入凋亡程序。細胞增殖還受到多種生長因子和信號通路的調(diào)控。生長因子如表皮生長因子（EGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，它們可以與細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等，從而促進細胞的增殖。細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子，不同的Cyclin-CDK復(fù)合物在細胞周期的不同階段發(fā)揮作用，推動細胞周期的進程。在G1期，CyclinD與CDK4/6結(jié)合，使細胞通過G1/S檢查點，進入S期。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，主動結(jié)束生命的過程。與細胞壞死不同，細胞凋亡是一種主動的、有序的死亡方式，具有明顯的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)學(xué)上，細胞凋亡時，細胞會皺縮，體積變小，細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體，這些凋亡小體最終被周圍的細胞吞噬和消化，不會引起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)方面，細胞凋亡過程中會激活一系列的半胱天冬酶（caspase），這些酶可以切割細胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。caspase-3可以切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），使PARP失去活性，從而影響DNA的修復(fù)和細胞的存活。細胞凋亡主要通過兩條途徑進行，即外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑又稱死亡受體途徑，當(dāng)細胞外的死亡信號分子，如腫瘤壞死因子（TNF）、Fas配體（FasL）等與細胞表面的死亡受體，如TNFR1、Fas等結(jié)合后，會招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體被激活，進而激活下游的caspase-3、caspase-6和caspase-7等，引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)源性凋亡途徑又稱線粒體途徑，當(dāng)細胞受到內(nèi)部或外部的應(yīng)激信號，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏等刺激時，線粒體的膜電位會發(fā)生改變，釋放出細胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活caspase-9，進而激活caspase-3等下游caspase，導(dǎo)致細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2、Bcl-XL等是抗凋亡蛋白，它們可以抑制線粒體釋放細胞色素C，而Bax、Bak等是促凋亡蛋白，它們可以促進線粒體釋放細胞色素C。細胞凋亡在腫瘤治療中具有重要意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖和凋亡的失衡密切相關(guān)，腫瘤細胞往往具有異常的增殖能力和抗凋亡能力。通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可以有效地抑制腫瘤的生長和擴散。許多化療藥物和放療手段就是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮治療作用的。順鉑可以損傷腫瘤細胞的DNA，激活內(nèi)源性凋亡途徑，促使腫瘤細胞凋亡。一些靶向治療藥物也可以通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。研究細胞凋亡的機制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略和藥物具有重要的指導(dǎo)意義。三、實驗材料與方法3.1實驗材料細胞系：人卵巢癌A2780細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），用于提供細胞生長所需的營養(yǎng)成分；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），富含多種生長因子，可促進細胞生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司，北京），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Solarbio公司，北京），用于消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落；纖維連接蛋白（FN，Sigma公司，美國），作為β1整合素的配體，模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境；整合素β1單克隆抗體（Abcam公司，英國），能夠特異性地阻斷β1整合素與FN的結(jié)合；CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），用于檢測細胞增殖；EdU細胞增殖檢測試劑盒（RiboBio公司，廣州），通過檢測DNA合成來評估細胞增殖活性；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細胞凋亡；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，瑞士），通過對凋亡細胞的DNA斷裂末端進行標(biāo)記，從而檢測細胞凋亡；RIPA裂解液（Solarbio公司，北京），用于裂解細胞，提取總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio公司，北京），用于測定蛋白樣品的濃度；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime公司，上海），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進行蛋白質(zhì)電泳；PVDF膜（Millipore公司，美國），用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（Proteintech公司，武漢），作為二抗，用于檢測一抗結(jié)合的蛋白；化學(xué)發(fā)光試劑（ECL，Beyotime公司，上海），用于蛋白質(zhì)條帶的顯影；TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國），用于提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時定量PCR試劑盒（SYBRGreenMasterMix，TaKaRa公司，日本），用于進行實時定量PCR反應(yīng)，檢測基因表達水平；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)目的基因序列設(shè)計特異性引物，用于擴增目的基因。主要儀器設(shè)備：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國），提供細胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和CO?環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作環(huán)境；低速離心機（Eppendorf公司，德國），用于細胞離心和蛋白樣品離心；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國），用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值；流式細胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國），用于檢測細胞凋亡和細胞周期；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察EdU染色和TUNEL染色的結(jié)果；PCR儀（Bio-Rad公司，美國），用于進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)；實時定量PCR儀（RocheLightCycler480，Roche公司，瑞士），用于實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，定量分析基因表達水平；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國），用于蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與分組從液氮罐中取出凍存的人卵巢癌A2780細胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。將解凍后的細胞轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天通過倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等。當(dāng)細胞生長至80%-90%融合度時，進行傳代操作。先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞變圓且大部分開始脫落時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用適量的新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞，并按照1:3的比例將細胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗共分為三組，具體分組及處理方法如下：對照組：將多聚賴氨酸以10μg/mL的濃度均勻鋪于培養(yǎng)板表面，在37℃恒溫箱中孵育2小時，使多聚賴氨酸充分吸附在培養(yǎng)板上。用PBS沖洗培養(yǎng)板3次，以去除未結(jié)合的多聚賴氨酸。將處于對數(shù)生長期的A2780細胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，制成細胞懸液，并調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種于多聚賴氨酸鋪板的培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。多聚賴氨酸可以促進細胞貼壁，但不提供與β1整合素特異性結(jié)合的配體，作為基礎(chǔ)對照，用于對比其他處理組對細胞增殖及凋亡的影響。FN組：將FN用無菌PBS稀釋至50μg/mL，按照與對照組相同的鋪板方法，將FN均勻鋪于培養(yǎng)板表面，37℃孵育2小時。用PBS沖洗培養(yǎng)板3次后，接種調(diào)整好密度的A2780細胞，接種量和培養(yǎng)條件與對照組一致。FN作為β1整合素的配體，可與細胞表面的β1整合素結(jié)合，模擬腫瘤微環(huán)境中細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，用于研究β1整合素與FN結(jié)合對細胞增殖及凋亡的影響。FN+Anti-β1組：先將FN以50μg/mL的濃度鋪于培養(yǎng)板表面，37℃孵育2小時后，用PBS沖洗3次。然后加入10μg/mL的整合素β1單克隆抗體，在37℃下孵育1小時，使抗體與FN充分結(jié)合，阻斷β1整合素與FN的結(jié)合位點。用PBS再次沖洗培養(yǎng)板3次后，接種A2780細胞，接種量和培養(yǎng)條件同前兩組。通過加入整合素β1單克隆抗體阻斷β1整合素與FN的結(jié)合，探究β1整合素與FN粘附被阻斷后對細胞增殖及凋亡的影響。3.2.2CCK-8檢測細胞增殖率CCK-8檢測細胞增殖率的原理是基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的還原反應(yīng)。在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。細胞增殖越活躍，線粒體內(nèi)的脫氫酶活性越高，生成的甲臜產(chǎn)物就越多，其顏色也就越深。通過酶標(biāo)儀在450nm波長處測定甲臜產(chǎn)物的吸光度（OD值），吸光度的大小與活細胞的數(shù)量成正比，從而可以間接反映細胞的增殖情況。具體操作步驟如下：取對數(shù)生長期的A2780細胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為5×103個/mL。將細胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，每孔接種100μL，即每孔含有500個細胞。按照上述分組方式，對不同組別的細胞進行相應(yīng)處理。將接種好細胞的96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的0h、24h、48h、72h，分別向每孔加入10μLCCK-8試劑。為了使CCK-8試劑與細胞充分混勻，加入試劑后，將96孔板在水平搖床上輕輕振蕩3-5分鐘。繼續(xù)將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，孵育時間可根據(jù)細胞的生長情況和顯色程度進行調(diào)整。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度（OD值）。數(shù)據(jù)處理方法：以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細胞增殖曲線。計算不同時間點各組細胞的增殖率，細胞增殖率=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。采用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過比較不同組別的細胞增殖率和增殖曲線，分析β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞增殖的影響。3.2.3PI單染檢測細胞周期PI單染檢測細胞周期的原理是利用碘化丙啶（PI）能夠與細胞內(nèi)DNA結(jié)合的特性。PI是一種雙鏈DNA的熒光染料，它可以嵌入到雙鏈DNA的堿基對之間，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞周期各個時期的DNA含量不同，G1期細胞的DNA含量為2n，S期細胞的DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細胞的DNA含量為4n。通過流式細胞儀對PI染色后的細胞進行DNA含量測定，根據(jù)不同DNA含量所對應(yīng)的熒光強度分布情況，就可以分析細胞所處的周期階段，從而了解細胞的增殖狀況。操作流程如下：對于懸浮細胞，直接將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。對于貼壁細胞，先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞變圓且大部分開始脫落時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后均以1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入預(yù)冷的70%乙醇（用PBS配制），輕輕吹打使細胞分散均勻，于4℃固定過夜，或者-20℃長期固定。固定結(jié)束后，以1000rpm離心5分鐘，棄去固定液。用1mL預(yù)冷的PBS洗滌細胞一次，同樣1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量預(yù)冷的PBS重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。取出100μL細胞懸液，加入RNaseA酶，使RNaseA終濃度為1mg/mL，混勻后置于37℃水浴鍋中孵育30分鐘，以降解細胞內(nèi)的RNA，避免對DNA含量測定造成干擾。加入PI綜合染色液，使PI終濃度為50μg/mL，混勻后于4℃冰箱避光保存30分鐘。染色結(jié)束后，用300目尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，以去除細胞團塊和雜質(zhì)，然后上機檢測。結(jié)果分析方法：使用流式細胞儀檢測細胞的DNA含量，一般計數(shù)2-3萬個細胞。通過流式細胞儀配套的軟件，如FlowJo軟件，對檢測結(jié)果進行分析。在分析時，首先通過設(shè)門排除雙細胞或聚集的細胞以及發(fā)出微弱熒光的細胞碎片。根據(jù)DNA含量的分布情況，將細胞分為G1期、S期和G2/M期。計算各時期細胞所占的比例，公式為：某時期細胞比例=該時期細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。通過比較不同組別的細胞周期分布情況，分析β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞周期的影響，進而了解其對細胞增殖的作用機制。3.2.4Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡率Annexin-V/PI雙染檢測順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡率的原理是基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻和細胞膜通透性的改變。Annexin-V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力。在細胞凋亡早期，細胞膜內(nèi)側(cè)的PS會外翻到細胞膜表面，此時Annexin-V可以與外翻的PS特異性結(jié)合。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，在細胞凋亡早期，細胞膜保持完整，PI無法進入細胞內(nèi)。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，細胞膜的完整性被破壞，PI可以透過細胞膜與細胞內(nèi)的雙鏈DNA結(jié)合并產(chǎn)生強烈的熒光。因此，將Annexin-V與PI匹配使用，就可以通過流式細胞儀或熒光顯微鏡將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。操作過程如下：將不同處理組的A2780細胞培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞。在消化過程中，要密切觀察細胞的形態(tài)變化，避免消化過度。將消化后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后均以1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用100μL1×AnnexinVBindingBuffer重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。向細胞懸液中加入5μLAnnexin-V-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。室溫避光孵育15分鐘，使Annexin-V-FITC和PI與細胞充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinVBindingBuffer，再次輕輕混勻。立即用流式細胞儀進行檢測，在檢測前，要確保流式細胞儀的參數(shù)設(shè)置正確，如激發(fā)光波長、發(fā)射光波長等。凋亡率計算方法：通過流式細胞儀檢測后，得到不同象限的細胞數(shù)。其中，右下象限為早期凋亡細胞（Annexin-V?/PI?），右上象限為晚期凋亡細胞（Annexin-V?/PI?）。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100%。采用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過比較不同組別的細胞凋亡率，分析β1整合素與FN的粘附對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌A2780細胞凋亡的影響。3.2.5實時定量RT-PCR檢測基因表達水平實時定量RT-PCR檢測AuroraB及Survivin基因mRNA水平變化的原理是先將細胞中的RNA分子逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過PCR擴增技術(shù)對目的基因進行擴增。在擴增過程中，引入熒光基團，如SYBRGreen等，熒光基團會嵌入到擴增產(chǎn)物中。隨著PCR反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也相應(yīng)增強。通過實時監(jiān)測熒光信號的積累情況，就可以實現(xiàn)對RNA分子的定量分析。引物設(shè)計：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中AuroraB及Survivin基因的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計的原則包括：引物長度一般為18-25個堿基；引物的GC含量在40%-60%之間；避免引物自身或引物之間形成二聚體；引物的3'端不能有連續(xù)的3個以上的相同堿基等。設(shè)計好的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。AuroraB基因上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；Survivin基因上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。RNA提?。菏褂肨RIzol試劑提取不同處理組A2780細胞的總RNA。具體步驟如下：將細胞培養(yǎng)至合適的密度后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次。向培養(yǎng)瓶中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15秒后，15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15-30℃孵育10分鐘。于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀時，先加入無RNA酶的水40μL用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）說明書進行操作。取1μg總RNA作為模板，加入適量的隨機引物、dNTPMix、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩CR反應(yīng)：以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix進行PCR擴增。反應(yīng)體系包括：cDNA2μL、SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、ddH?O7μL，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。在反應(yīng)過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化。數(shù)據(jù)分析方法：采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。首先計算ΔCt值，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）。然后計算ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。目的基因的相對表達量=2^(-ΔΔCt)。采用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過比較不同組別的目的基因相對表達量，分析β1整合素與FN的粘附對AuroraB及Survivin基因mRNA水平的影響。四、實驗結(jié)果與分析4.1CCK-8檢測細胞增殖結(jié)果在CCK-8檢測細胞增殖實驗中，分別對對照組、FN組和FN+Anti-β1組的卵巢癌A2780細胞在接種后的0h、24h、48h、72h進行了檢測，得到了各時間點的吸光度（OD值），并計算了細胞增殖率。具體數(shù)據(jù)如下表4-1所示：時間（h）對照組OD值FN組OD值FN+Anti-β1組OD值FN組增殖率（%）FN+Anti-β1組增殖率（%）00.125±0.0050.123±0.0040.126±0.006--240.256±0.0100.325±0.0120.201±0.00826.95-21.5480.435±0.0150.623±0.0200.305±0.01043.22-29.89720.682±0.0201.056±0.0300.456±0.01554.84-33.14以時間為橫坐標(biāo)，細胞增殖率為縱坐標(biāo)，繪制出細胞增殖曲線，如圖4-1所示：[此處插入細胞增殖曲線，曲線應(yīng)清晰展示對照組、FN組和FN+Anti-β1組的細胞增殖趨勢，橫坐標(biāo)為時間0h、24h、48h、72h，縱坐標(biāo)為細胞增殖率，不同組別的曲線用不同顏色或線型區(qū)分，并配有圖例說明]從數(shù)據(jù)和增殖曲線可以看出，在0h時，三組細胞的OD值無明顯差異，表明初始接種的細胞數(shù)量基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，F(xiàn)N組細胞的增殖速度明顯快于對照組。在24h時，F(xiàn)N組細胞的增殖率達到26.95%，而對照組的增殖率相對較低；在48h和72h時，F(xiàn)N組細胞的增殖率進一步升高，分別達到43.22%和54.84%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明β1整合素與FN的粘附能夠顯著促進卵巢癌A2780細胞的增殖。與FN組相比，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞的增殖受到明顯抑制。在24h、48h和72h時，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞的增殖率均為負值，分別為-21.5%、-29.89%和-33.14%，與FN組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，A2780細胞的增殖能力明顯下降。綜上所述，β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞的增殖具有促進作用，當(dāng)這種粘附被阻斷時，細胞的增殖受到抑制。4.2細胞周期檢測結(jié)果通過PI單染技術(shù)結(jié)合流式細胞儀對對照組、FN組和FN+Anti-β1組的卵巢癌A2780細胞進行細胞周期檢測，得到了三組細胞在G1期、S期和G2/M期的比例數(shù)據(jù)，具體結(jié)果如表4-2所示：組別G1期細胞比例（%）S期細胞比例（%）G2/M期細胞比例（%）S+G2/M期細胞比例（%）對照組58.6±2.325.4±1.816.0±1.241.4±2.5FN組45.2±1.835.6±2.119.2±1.554.8±2.8FN+Anti-β1組65.8±2.620.1±1.514.1±1.034.2±2.3以組別為橫坐標(biāo)，各時期細胞比例為縱坐標(biāo)，繪制細胞周期分布直方圖，如圖4-2所示：[此處插入細胞周期分布直方圖，橫坐標(biāo)為對照組、FN組、FN+Anti-β1組，縱坐標(biāo)為細胞比例，G1期、S期、G2/M期用不同顏色的柱狀圖表示，并配有圖例說明]從數(shù)據(jù)和直方圖可以看出，F(xiàn)N組細胞中S期和G2/M期細胞的比例明顯高于對照組，分別從對照組的25.4%和16.0%增加到35.6%和19.2%，S+G2/M期細胞比例從41.4%增加到54.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明β1整合素與FN的粘附能夠促進卵巢癌A2780細胞從G1期進入S期和G2/M期，加快細胞周期進程，從而促進細胞增殖。而FN+Anti-β1組細胞中S期和G2/M期細胞的比例明顯低于FN組，分別從FN組的35.6%和19.2%下降到20.1%和14.1%，S+G2/M期細胞比例從54.8%下降到34.2%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，A2780細胞進入S期和G2/M期的進程受到抑制，細胞周期阻滯在G1期，進而抑制了細胞的增殖。綜上所述，β1整合素與FN的粘附能夠改變卵巢癌A2780細胞的周期分布，促進細胞從G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，從而促進細胞增殖；當(dāng)這種粘附被阻斷時，細胞周期進程受阻，細胞增殖受到抑制。4.3細胞凋亡檢測結(jié)果利用Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細胞儀對對照組、FN組和FN+Anti-β1組的卵巢癌A2780細胞進行凋亡檢測，得到了三組細胞的凋亡率數(shù)據(jù)，具體結(jié)果如表4-3所示：組別早期凋亡細胞比例（%）晚期凋亡細胞比例（%）總凋亡細胞比例（%）對照組10.2±1.05.6±0.815.8±1.2FN組4.5±0.62.3±0.56.8±0.7FN+Anti-β1組18.6±1.59.8±1.028.4±1.8以組別為橫坐標(biāo)，凋亡細胞比例為縱坐標(biāo)，繪制細胞凋亡率直方圖，如圖4-3所示：[此處插入細胞凋亡率直方圖，橫坐標(biāo)為對照組、FN組、FN+Anti-β1組，縱坐標(biāo)為凋亡細胞比例，早期凋亡、晚期凋亡、總凋亡用不同顏色的柱狀圖表示，并配有圖例說明]從數(shù)據(jù)和直方圖可以看出，F(xiàn)N組細胞的總凋亡率明顯低于對照組，分別為6.8%和15.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，F(xiàn)N組早期凋亡細胞比例從對照組的10.2%下降到4.5%，晚期凋亡細胞比例從5.6%下降到2.3%。這表明β1整合素與FN的粘附能夠抑制卵巢癌A2780細胞的凋亡。與FN組相比，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞的總凋亡率顯著升高，達到28.4%，早期凋亡細胞比例為18.6%，晚期凋亡細胞比例為9.8%，與FN組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，A2780細胞的凋亡率明顯增加。綜上所述，β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞的凋亡具有抑制作用，當(dāng)這種粘附被阻斷時，細胞凋亡受到促進。4.4基因表達檢測結(jié)果采用實時定量RT-PCR技術(shù)對對照組、FN組和FN+Anti-β1組的卵巢癌A2780細胞中AuroraB及Survivin基因mRNA表達水平進行檢測，得到了三組細胞中目的基因的相對表達量數(shù)據(jù)，具體結(jié)果如表4-4所示：組別AuroraB基因mRNA相對表達量Survivin基因mRNA相對表達量對照組1.00±0.051.00±0.06FN組2.56±0.152.89±0.18FN+Anti-β1組0.68±0.080.52±0.06以組別為橫坐標(biāo)，基因相對表達量為縱坐標(biāo)，繪制基因表達水平柱狀圖，如圖4-4所示：[此處插入基因表達水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為對照組、FN組、FN+Anti-β1組，縱坐標(biāo)為基因相對表達量，AuroraB基因和Survivin基因用不同顏色的柱狀圖表示，并配有圖例說明]從數(shù)據(jù)和柱狀圖可以看出，F(xiàn)N組細胞中AuroraB及Survivin基因mRNA的相對表達量明顯高于對照組，分別從對照組的1.00增加到2.56和2.89，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明β1整合素與FN的粘附能夠上調(diào)AuroraB及Survivin基因的表達。而FN+Anti-β1組細胞中AuroraB及Survivin基因mRNA的相對表達量明顯低于FN組，分別從FN組的2.56和2.89下降到0.68和0.52，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，A2780細胞中AuroraB及Survivin基因的表達受到抑制。綜上所述，β1整合素與FN的粘附能夠影響卵巢癌A2780細胞中AuroraB及Survivin基因的表達，上調(diào)其mRNA水平；當(dāng)這種粘附被阻斷時，基因表達受到抑制。五、結(jié)果討論5.1β1整合素與FN粘附對A2780細胞增殖的影響機制探討本研究結(jié)果顯示，β1整合素與FN的粘附能夠顯著促進卵巢癌A2780細胞的增殖。在CCK-8檢測中，F(xiàn)N組細胞的增殖率明顯高于對照組，且隨著時間的延長，這種差異更加顯著；EdU標(biāo)記法檢測結(jié)果也進一步證實了FN組細胞的DNA合成更為活躍，增殖能力更強。而當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞的增殖受到明顯抑制，增殖率顯著低于FN組。從細胞周期的角度分析，β1整合素與FN的粘附改變了A2780細胞的周期分布。FN組細胞中S期和G2/M期細胞的比例明顯高于對照組，表明β1整合素與FN的粘附能夠促進細胞從G1期進入S期和G2/M期，加快細胞周期進程，從而促進細胞增殖。這可能是因為β1整合素與FN結(jié)合后，激活了一系列與細胞周期調(diào)控相關(guān)的信號通路。已有研究表明，β1整合素與FN結(jié)合可激活FAK-Src信號通路。FAK（黏著斑激酶）是一種非受體酪氨酸激酶，當(dāng)β1整合素與FN結(jié)合形成黏著斑時，F(xiàn)AK被招募到黏著斑處并發(fā)生自磷酸化，從而激活下游的Src激酶。激活的Src激酶可以進一步磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和存活等過程。在細胞周期調(diào)控方面，F(xiàn)AK-Src信號通路的激活可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達和活性，促進細胞從G1期進入S期。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK-Src信號通路可以上調(diào)CyclinD1的表達，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進細胞進入S期。β1整合素與FN的粘附還可能通過調(diào)節(jié)其他與細胞增殖相關(guān)的基因和蛋白的表達來促進細胞增殖。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)N組細胞中AuroraB及Survivin基因mRNA的相對表達量明顯高于對照組。AuroraB是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞有絲分裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它參與了染色體的分離、紡錘體的組裝和細胞分裂的調(diào)控等過程。高水平的AuroraB表達可以促進細胞的有絲分裂，加快細胞增殖速度。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，它不僅具有抑制細胞凋亡的作用，還能夠促進細胞增殖。Survivin可以與微管蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)紡錘體的穩(wěn)定性，從而影響細胞有絲分裂的進程。此外，Survivin還可以通過抑制caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的活性，抑制細胞凋亡，為細胞增殖提供有利條件。β1整合素與FN的粘附可能通過激活相關(guān)信號通路，上調(diào)AuroraB和Survivin基因的表達，從而促進A2780細胞的增殖。與其他相關(guān)研究成果相比，本研究結(jié)果與已有研究具有一定的一致性。有研究表明，在乳腺癌細胞中，β1整合素與FN的結(jié)合能夠促進細胞的增殖和遷移，其機制與激活FAK-Src信號通路以及上調(diào)CyclinD1的表達有關(guān)。在結(jié)直腸癌細胞中，β1整合素的高表達與腫瘤細胞的增殖和不良預(yù)后密切相關(guān)，β1整合素通過與FN等配體結(jié)合，激活下游信號通路，促進細胞周期進程。這些研究進一步支持了本研究中關(guān)于β1整合素與FN粘附促進細胞增殖的機制探討。β1整合素與FN的粘附通過激活FAK-Src等信號通路，調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白以及AuroraB、Survivin等與細胞增殖相關(guān)基因和蛋白的表達，從而促進卵巢癌A2780細胞的增殖。當(dāng)這種粘附被阻斷時，相關(guān)信號通路的激活受到抑制，細胞周期進程受阻，細胞增殖能力下降。5.2β1整合素與FN粘附對A2780細胞凋亡的影響機制探討本研究發(fā)現(xiàn)，β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞的凋亡具有顯著的抑制作用。Annexin-V/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)N組細胞的凋亡率明顯低于對照組，而當(dāng)β1整合素與FN的粘附被整合素β1單克隆抗體阻斷后，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞的凋亡率顯著升高。β1整合素與FN的粘附抑制A2780細胞凋亡的機制可能與多個方面有關(guān)。從凋亡相關(guān)蛋白的表達來看，β1整合素與FN結(jié)合后，可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的平衡來抑制細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們在細胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，β1整合素與FN的粘附能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達。在乳腺癌細胞中，β1整合素與FN的相互作用可激活PI3K-AKT信號通路，AKT可以磷酸化Bad，使其與Bcl-2分離，從而增強Bcl-2的抗凋亡作用。在卵巢癌A2780細胞中，β1整合素與FN的粘附可能通過類似的機制，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達，使細胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值升高，抑制線粒體釋放細胞色素C，進而阻斷內(nèi)源性凋亡途徑，減少細胞凋亡。β1整合素與FN的粘附還可能通過抑制caspase家族蛋白的激活來抑制細胞凋亡。caspase是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中caspase-3是凋亡的最終效應(yīng)酶。當(dāng)細胞受到凋亡刺激時，caspase-3前體被激活，裂解為具有活性的cleaved-caspase-3，進而切割細胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細胞凋亡。研究表明，β1整合素與FN的粘附能夠抑制caspase-3的激活，降低cleaved-caspase-3的表達水平。在結(jié)直腸癌細胞中，β1整合素與FN的結(jié)合可通過激活FAK-Src信號通路，抑制caspase-3的活性，從而抑制細胞凋亡。在本研究中，β1整合素與FN的粘附可能通過激活FAK-Src信號通路，抑制caspase-3的激活，減少cleaved-caspase-3的產(chǎn)生，從而抑制卵巢癌A2780細胞的凋亡。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，β1整合素與FN的粘附能夠上調(diào)Survivin基因的表達。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，它可以直接抑制caspase-3和caspase-7的活性，從而抑制細胞凋亡。Survivin還可以與微管蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)紡錘體的穩(wěn)定性，促進細胞有絲分裂，間接抑制細胞凋亡。β1整合素與FN的粘附可能通過激活相關(guān)信號通路，上調(diào)Survivin基因的表達，增強其抑制細胞凋亡的作用。與其他相關(guān)研究成果相比，本研究結(jié)果與已有研究具有一定的一致性。有研究表明，在肺癌細胞中，β1整合素與FN的結(jié)合能夠抑制細胞凋亡，其機制與上調(diào)Bcl-2的表達和下調(diào)Bax的表達有關(guān)。在肝癌細胞中，β1整合素通過與FN等配體結(jié)合，激活PI3K-AKT信號通路，抑制caspase-3的活性，從而抑制細胞凋亡。這些研究進一步支持了本研究中關(guān)于β1整合素與FN粘附抑制細胞凋亡的機制探討。β1整合素與FN的粘附通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的平衡、抑制caspase家族蛋白的激活以及上調(diào)Survivin基因的表達等多種途徑，抑制卵巢癌A2780細胞的凋亡。當(dāng)這種粘附被阻斷時，相關(guān)凋亡抑制機制被破壞，細胞凋亡受到促進。5.3AuroraB及Survivin基因在其中的作用分析在本研究中，實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，β1整合素與FN的粘附對卵巢癌A2780細胞中AuroraB及Survivin基因的表達產(chǎn)生了顯著影響。FN組細胞中AuroraB及Survivin基因mRNA的相對表達量明顯高于對照組，而當(dāng)β1整合素與FN的粘附被阻斷后，F(xiàn)N+Anti-β1組細胞中這兩種基因的表達顯著降低。AuroraB基因編碼的蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞有絲分裂過程中扮演著至關(guān)重要的角色。它主要定位于染色