乳香與血竭：開啟慢性創(chuàng)面成纖維細胞修復(fù)機制新視野一、引言1.1研究背景慢性創(chuàng)面，又稱慢性難愈性創(chuàng)面，是指因外界或內(nèi)在因素導(dǎo)致創(chuàng)面在1個月內(nèi)不能通過正常有序的愈合程序修復(fù)而愈合的創(chuàng)面，主要包括糖尿病足潰瘍、壓力性損傷、動靜脈性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、感染性潰瘍等。近年來，隨著各種慢性疾病，如糖尿病、癌癥的患病率逐年上升，車禍外傷逐漸增多，慢性創(chuàng)面患者也越來越多。而作為一種長期消耗性疾病，慢性創(chuàng)面給患者造成了極大的痛苦。以糖尿病為例，最近5年，世界糖尿病發(fā)病率每年以11％的驚人速度增長，目前已有接近兩億人患有糖尿病，糖尿病也因此成為世界第五大死因。按IDF(國際糖尿病聯(lián)盟)的估算，中國糖尿病患者已達5500萬人，每年新發(fā)現(xiàn)糖尿病患者120萬人，并且以每天至少3000人的速度增加。在未來3年至5年內(nèi)，這些糖尿病人中將有15％的病人會患上糖尿病足，嚴(yán)重的將面臨截肢。此外，隨著人口不斷老齡化，下肢靜脈性潰瘍和褥瘡的發(fā)病率也在不斷地攀升。慢性難愈性創(chuàng)面可能不會立即威脅患者生命，但如果久治不愈，將會嚴(yán)重影響患者和家人的生活質(zhì)量，甚至?xí)l(fā)感染擴散，導(dǎo)致膿毒癥等并發(fā)癥，從而危及生命。創(chuàng)面愈合過程包括連續(xù)動態(tài)的炎癥反應(yīng)、細胞增殖及重塑三個階段，受多種因素影響。成纖維細胞作為創(chuàng)面愈合過程中的關(guān)鍵細胞，對創(chuàng)面愈合起著不可或缺的作用。成纖維細胞由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來，是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分。在創(chuàng)面愈合時，成纖維細胞通過有絲分裂大量增生，然后分泌出大量膠原纖維。膠原纖維再和新生的毛細血管組成新生肉芽組織，然后肉芽組織再通過聚集來修復(fù)創(chuàng)面，最后再由新生皮膚覆蓋，完成創(chuàng)面的整個修復(fù)過程。此外，成纖維細胞還能合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)成分，提供組織支持和物理保護，其合成和分泌的生長因子、細胞因子等多種生物活性物質(zhì)，能夠調(diào)控細胞的生長、分化和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。由此可見，成纖維細胞是組織修復(fù)和再生的關(guān)鍵細胞之一，在維持組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)損傷方面發(fā)揮著重要作用。在慢性創(chuàng)面的治療中，中醫(yī)藥展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。乳香和血竭作為傳統(tǒng)的中藥材，在促進創(chuàng)面愈合方面具有悠久的應(yīng)用歷史。乳香具有活血定痛、消腫生肌等功效；血竭則有活血定痛、化瘀止血、生肌斂瘡的作用。研究表明，血竭中的樹脂酸類成分如血竭酸具有促進細胞增殖和血管生成的作用，有利于傷口愈合，其含有的黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減少炎癥反應(yīng)，對于慢性傷口的愈合具有積極作用。乳香的主要成分能夠通過改善成纖維細胞在低氧低血清狀態(tài)下增殖減慢的情況，從而促進傷口愈合，并對膠原的合成有一定的調(diào)節(jié)作用。然而，目前對于乳香和血竭促進慢性創(chuàng)面愈合的具體作用機制，尤其是對成纖維細胞的作用研究還不夠深入。因此，深入探究乳香及血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用，具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在通過模擬慢性創(chuàng)面的低氧低營養(yǎng)環(huán)境，以NIH3T3成纖維細胞為模型，深入探究乳香和血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖、凋亡、細胞周期以及膠原合成等方面的影響，明確其作用效果及潛在的作用機制。具體來說，通過一系列實驗方法，如MTT法檢測細胞增殖、DAPI染色檢測細胞凋亡、流式細胞儀檢測細胞周期變化、羥脯氨酸試劑盒檢測細胞內(nèi)膠原含量以及RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達等，系統(tǒng)地分析乳香和血竭對成纖維細胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。本研究具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，有助于深化對乳香和血竭促進慢性創(chuàng)面愈合機制的認(rèn)識，進一步揭示中藥在細胞水平上的作用機制，豐富慢性創(chuàng)面愈合的理論體系，為中醫(yī)藥治療慢性創(chuàng)面提供更為堅實的理論依據(jù)。在實踐方面，研究結(jié)果可以為臨床治療慢性創(chuàng)面提供新的思路和方法，為開發(fā)基于乳香和血竭的新型創(chuàng)面愈合藥物或治療方案奠定基礎(chǔ)，有助于提高慢性創(chuàng)面的治療效果，減輕患者痛苦，降低醫(yī)療成本，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。二、乳香與血竭的概述2.1乳香的來源、成分與傳統(tǒng)功效乳香為橄欖科植物乳香樹（BoswelliacarteriiBirdw.）及鮑達乳香樹（Boswelliabhaw-dajianaBirdw.）樹皮滲出的樹脂。其主要產(chǎn)地為埃塞俄比亞、索馬里等地。在古代，乳香就通過海上絲綢之路傳入中國，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香料等領(lǐng)域。在歷史記載中，乳香因其獨特的香氣和藥用價值，備受珍視，常被用于宮廷的熏香儀式以及貴族的醫(yī)療保健。乳香的成分較為復(fù)雜，主要包括樹脂、樹膠和揮發(fā)油。其中，樹脂約占60%-70%，是乳香發(fā)揮藥用作用的重要成分，主要包含游離α-乳香脂酸（α-Boswellicacid）、β-乳香脂酸（β-Boswellicacid）、結(jié)合乳香脂酸、乳香樹脂烴（Olibanoresene）等；樹膠占27%-35%，主要由阿糖酸（Arabicacid）的鈣鹽和鎂鹽、西黃芪膠黏素（Bassorin）和苦味質(zhì)組成；揮發(fā)油含量為3%-8%，其成分包含蒎烯（Pinene）、莰烯（Camphene）、香檜烯（Sabinene）、欖香烯（Elemene）、消旋-檸檬烯（Dipentene）及α-水芹烯（α-Phellandrene）、β-水芹烯（β-Phellandrene）等多種萜烯類化合物，這些成分賦予了乳香獨特的氣味和部分藥理活性。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，乳香具有重要的地位。其性辛、苦，溫，歸心、肝、脾經(jīng)?！侗静菥V目》記載：“乳香活血，定痛，伸筋，治婦人難產(chǎn)，折傷。”充分闡述了乳香在活血、止痛等方面的功效。乳香常用于治療胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、癥瘕腹痛等多種因氣滯血瘀引起的疼痛癥狀。其活血定痛的作用機制主要在于能夠溫通行散瘀血，促進氣血運行，從而緩解疼痛。在治療跌打損傷、癰腫瘡瘍時，乳香既能散瘀止痛，又能活血消癰、祛腐生肌，加速傷口的愈合。在古代的外科治療中，乳香常被用于制作藥膏，涂抹在傷口處，以促進傷口的愈合和防止感染。在治療風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣方面，乳香溫通經(jīng)脈、活血伸筋，可改善關(guān)節(jié)疼痛、屈伸不利等癥狀，通過促進局部血液循環(huán)，緩解肌肉痙攣，減輕疼痛和腫脹。2.2血竭的來源、成分與傳統(tǒng)功效血竭為棕櫚科植物麒麟竭（DaemonoropsdracoBl.）果實滲出的樹脂經(jīng)加工制成，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞等東南亞地區(qū)。其獲取方式較為獨特，通常在秋季進行采收。采收時，可采取果實，將其置于蒸籠內(nèi)蒸煮，促使樹脂滲出；也可將果實搗爛，放置在布袋中榨取樹脂，隨后將所得樹脂煎熬成糖漿狀，待冷卻后凝固成塊狀。此外，還有一種方法是將樹干砍破或鉆若干小孔，讓樹脂自然滲出并凝固。在古代，血竭通過海上貿(mào)易路線傳入中國，因其珍貴的藥用價值和獨特的色澤，被視為重要的藥材。血竭的成分豐富多樣，主要包含血竭紅素（Dracoresene）、血竭紅素酯（Dracoresinotannol）、去甲血竭素（Nor-dracorhodin）、去甲血竭紅素（Nor-dracoresene）、黃烷醇（Flavanol）、查爾酮（Chalcone）、樹脂酸（Resinacid）等。這些成分賦予了血竭獨特的藥理活性，是其發(fā)揮藥用功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中，血竭紅素和血竭素是血竭的標(biāo)志性成分，具有顯著的活血化瘀、抗炎等作用。現(xiàn)代研究表明，血竭紅素能夠抑制血小板聚集，降低血液黏稠度，從而改善血液循環(huán)，促進瘀血的消散。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里，血竭具有重要的藥用價值。其性甘、咸，平，歸心、肝經(jīng)?！短票静荨酚涊d：“主五臟邪氣，帶下，心痛，破積血，金創(chuàng)生肉?！背浞株U述了血竭在治療多種病癥方面的功效。血竭常用于治療跌打損傷，能有效緩解因跌打?qū)е碌木植筐鲅?、腫脹和疼痛，促進損傷組織的修復(fù)。在治療心腹瘀痛時，血竭可通過活血化瘀的作用，疏通經(jīng)絡(luò)，緩解疼痛。對于外傷出血，血竭既能止血，又能化瘀，可促進傷口愈合，減少感染的風(fēng)險。在古代的外科治療中，血竭常被用于治療瘡瘍不斂，其生肌斂瘡的功效能夠促進瘡口的愈合，加速新肉的生長，減少疤痕的形成。在治療癰疽瘡瘍時，血竭常與其他藥物配伍使用，如與乳香、沒藥等合用，增強活血化瘀、消腫止痛的效果。三、慢性創(chuàng)面與成纖維細胞3.1慢性創(chuàng)面的形成機制與特點慢性創(chuàng)面的形成是一個復(fù)雜的病理過程，涉及多種因素的相互作用，且往往與多種基礎(chǔ)疾病密切相關(guān)。糖尿病作為一種常見的慢性疾病，是導(dǎo)致慢性創(chuàng)面的重要原因之一。糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，會引發(fā)一系列的代謝紊亂和血管神經(jīng)病變。高血糖使得血液黏稠度增加，血流緩慢，導(dǎo)致下肢血管容易發(fā)生粥樣硬化和血栓形成，進而影響下肢的血液供應(yīng)。同時，糖尿病還會損害神經(jīng)功能，導(dǎo)致感覺減退，患者對足部的微小損傷難以察覺，容易引發(fā)感染和潰瘍。據(jù)統(tǒng)計，糖尿病患者中約15%會發(fā)生糖尿病足潰瘍，且這些潰瘍往往難以愈合，容易發(fā)展為慢性創(chuàng)面。下肢靜脈功能不全也是慢性創(chuàng)面的常見病因。當(dāng)下肢靜脈瓣功能受損，血液回流受阻，會導(dǎo)致下肢靜脈高壓，進而引起皮膚營養(yǎng)障礙。長期的靜脈高壓使得毛細血管通透性增加，紅細胞和血漿蛋白滲出，纖維蛋白原在組織中沉積，形成纖維蛋白袖套，阻礙氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的交換，導(dǎo)致皮膚缺血缺氧，容易發(fā)生潰瘍。臨床研究表明，下肢靜脈性潰瘍在慢性創(chuàng)面中占有相當(dāng)大的比例，約為60%-70%，且復(fù)發(fā)率較高。壓力性損傷則主要發(fā)生在長期臥床或坐輪椅的患者身上。由于身體局部長期受到壓迫，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，組織缺血缺氧，進而引發(fā)皮膚和皮下組織的損傷。特別是在骨隆突處，如骶尾部、足跟部等，壓力性損傷的發(fā)生率較高。當(dāng)壓力超過毛細血管的灌注壓時，組織就會發(fā)生缺血壞死，形成慢性創(chuàng)面。壓力性損傷的發(fā)生與患者的身體狀況、護理情況等因素密切相關(guān)，對于長期臥床的老年患者，壓力性損傷的發(fā)生率可高達20%-30%。慢性創(chuàng)面具有一些顯著的特點，這些特點使得其治療難度較大。慢性創(chuàng)面常處于低氧、低營養(yǎng)的微環(huán)境中。以糖尿病足潰瘍?yōu)槔?，由于下肢血管病變，血液供?yīng)不足，導(dǎo)致創(chuàng)面局部氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏。研究表明，糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的氧分壓明顯低于正常組織，僅為正常組織的1/3-1/2，這嚴(yán)重影響了細胞的代謝和功能。低氧環(huán)境會抑制成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，使得創(chuàng)面愈合緩慢。同時，低營養(yǎng)狀態(tài)也會導(dǎo)致細胞能量供應(yīng)不足，影響細胞的正常生理活動。炎癥反應(yīng)難以消退也是慢性創(chuàng)面的重要特點。在慢性創(chuàng)面中，炎癥細胞持續(xù)浸潤，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等大量釋放。這些炎癥因子會破壞組織細胞，抑制細胞的增殖和遷移，阻礙創(chuàng)面愈合。慢性創(chuàng)面表面常存在細菌生物膜，細菌生物膜由細菌和其分泌的細胞外基質(zhì)組成，具有很強的耐藥性，難以被常規(guī)的抗菌藥物清除。細菌生物膜的存在會持續(xù)引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致創(chuàng)面長期不愈合。有研究顯示，在慢性創(chuàng)面中，約80%以上的創(chuàng)面存在細菌生物膜，這使得創(chuàng)面的治療更加困難。3.2成纖維細胞在創(chuàng)面愈合中的作用成纖維細胞在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著核心作用，其生物學(xué)行為貫穿于創(chuàng)面愈合的各個階段，對組織修復(fù)和再生至關(guān)重要。在創(chuàng)面愈合的起始階段，即炎癥反應(yīng)期，成纖維細胞就已參與其中。當(dāng)組織受到損傷后，機體立即啟動炎癥反應(yīng)，血小板聚集形成血凝塊，同時釋放多種細胞因子和生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。這些因子能夠趨化成纖維細胞，使其從周圍組織遷移到創(chuàng)面部位。研究表明，在創(chuàng)面損傷后的數(shù)小時內(nèi)，成纖維細胞就開始向創(chuàng)面遷移，這一過程依賴于細胞表面的整合素等黏附分子與細胞外基質(zhì)的相互作用。整合素能夠識別并結(jié)合細胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、膠原蛋白等成分，從而引導(dǎo)成纖維細胞沿著濃度梯度向創(chuàng)面遷移。成纖維細胞的遷移不僅有助于填充創(chuàng)面缺損，還能為后續(xù)的愈合過程提供細胞基礎(chǔ)。隨著炎癥反應(yīng)的進行，創(chuàng)面愈合進入增殖期，此時成纖維細胞的增殖和分泌活動顯著增強。成纖維細胞通過有絲分裂大量增殖，數(shù)量迅速增加。在這一階段，細胞周期調(diào)控機制發(fā)揮關(guān)鍵作用，細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶等分子協(xié)同作用，推動成纖維細胞從G1期進入S期，進行DNA復(fù)制和細胞分裂。成纖維細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖等。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分之一，它能夠形成堅韌的纖維網(wǎng)絡(luò)，為組織提供結(jié)構(gòu)支持和機械強度。其中，Ⅰ型膠原蛋白含量最為豐富，主要負(fù)責(zé)增強組織的張力強度；Ⅲ型膠原蛋白則在創(chuàng)面愈合早期大量合成，有助于形成肉芽組織的框架結(jié)構(gòu)。彈性蛋白賦予組織彈性和回縮能力，使組織在受到外力作用后能夠恢復(fù)原狀。蛋白聚糖則能夠結(jié)合水分，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的含水量和物理性質(zhì)，為細胞的生存和活動提供適宜的微環(huán)境。在增殖期，成纖維細胞還與新生血管密切協(xié)作，共同促進肉芽組織的形成。成纖維細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促使新生毛細血管從周圍組織長入創(chuàng)面。新生血管為創(chuàng)面提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝廢物，為成纖維細胞的增殖和分泌活動提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，成纖維細胞通過與血管內(nèi)皮細胞的直接接觸和旁分泌信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)血管的生成和穩(wěn)定性。成纖維細胞分泌的血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）等分子能夠抑制血管生成，維持血管生成的平衡，避免過度血管生成導(dǎo)致的組織水腫和瘢痕形成。在創(chuàng)面愈合的后期，即重塑期，成纖維細胞繼續(xù)發(fā)揮重要作用。成纖維細胞分泌的膠原酶等蛋白酶，能夠降解多余的膠原蛋白，對細胞外基質(zhì)進行重塑和改建。通過不斷地合成和降解膠原蛋白，成纖維細胞使肉芽組織逐漸轉(zhuǎn)化為成熟的瘢痕組織，瘢痕組織中的膠原蛋白排列更加有序，組織強度逐漸增加。在這一過程中，成纖維細胞還受到多種細胞因子和信號通路的調(diào)控。TGF-β通過激活Smad信號通路，促進成纖維細胞合成膠原蛋白；而基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）則能夠抑制膠原酶的活性，調(diào)節(jié)膠原蛋白的降解速度。此外，機械應(yīng)力也對成纖維細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。適當(dāng)?shù)臋C械應(yīng)力能夠刺激成纖維細胞合成膠原蛋白，增強組織的強度；而過度的機械應(yīng)力則可能導(dǎo)致瘢痕增生和攣縮。3.3模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞模型的構(gòu)建為了深入研究乳香和血竭對慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用機制，構(gòu)建模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下的成纖維細胞模型至關(guān)重要。在本研究中，選用NIH3T3成纖維細胞作為研究對象，這是因為NIH3T3細胞是一種廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)研究的小鼠胚胎成纖維細胞系，具有易于培養(yǎng)、增殖能力強等優(yōu)點，能夠較好地模擬體內(nèi)成纖維細胞的生物學(xué)行為。構(gòu)建低氧環(huán)境時，采用厭氧培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)瓶放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱內(nèi)。向厭氧培養(yǎng)箱中通入混合氣體，其中氮氣（N?）占95%，二氧化碳（CO?）占5%，使氧分壓（PO?）維持在27mmHg，模擬慢性創(chuàng)面的低氧狀態(tài)。相關(guān)研究表明，慢性創(chuàng)面的氧分壓通常顯著低于正常組織，約為正常組織的1/3-1/2，而27mmHg的氧分壓能夠較好地模擬這種低氧微環(huán)境。在低氧條件下，細胞的代謝和功能會發(fā)生顯著變化，如細胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達上調(diào)，從而調(diào)控一系列與細胞增殖、代謝和血管生成相關(guān)的基因表達，影響細胞的生物學(xué)行為。在構(gòu)建低營養(yǎng)環(huán)境時，通過控制培養(yǎng)液中新生牛血清（NCS）的濃度來實現(xiàn)。將細胞接種于含有不同濃度NCS的DMEM培養(yǎng)液中，分為正常對照組（10%NCS）和低營養(yǎng)組（0.5%NCS）。血清中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，如氨基酸、維生素、激素和生長因子等，是細胞生長和維持正常生理功能所必需的。降低血清濃度可以減少細胞獲取的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，從而模擬慢性創(chuàng)面的低營養(yǎng)狀態(tài)。研究顯示，在低營養(yǎng)環(huán)境下，細胞的能量代謝受到抑制，細胞周期進程受阻，增殖速度明顯減慢。在0.5%NCS的低營養(yǎng)條件下，細胞內(nèi)的ATP合成減少，細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達下調(diào)，導(dǎo)致細胞被阻滯于G?-G?期，無法進入S期進行DNA復(fù)制和細胞分裂。通過上述方法成功構(gòu)建了模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下的成纖維細胞模型。該模型能夠較好地模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞所處的病理微環(huán)境，為后續(xù)研究乳香和血竭對慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用提供了可靠的實驗平臺。利用該模型，可以深入探討乳香和血竭對成纖維細胞增殖、凋亡、細胞周期以及膠原合成等生物學(xué)過程的影響，揭示其促進慢性創(chuàng)面愈合的潛在作用機制。四、乳香對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用研究4.1乳香對成纖維細胞增殖的影響為探究乳香對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖的影響，采用MTT法進行實驗。將處于對數(shù)生長期的NIH3T3成纖維細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μL含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。實驗分為正常對照組、模型組、乳香低劑量組（50μg/mL）、乳香中劑量組（100μg/mL）和乳香高劑量組（200μg/mL）。正常對照組加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，各乳香給藥組分別加入含相應(yīng)濃度乳香提取物的含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h，然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值反映細胞增殖情況。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞在24h、48h和72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境明顯抑制了成纖維細胞的增殖。與模型組相比，乳香各劑量組細胞的OD值在不同時間點均有不同程度的升高，且呈時間和劑量依賴性。在24h時，乳香高劑量組的OD值與模型組相比有顯著差異（P<0.05）；在48h和72h時，乳香中、高劑量組的OD值與模型組相比均有極顯著差異（P<0.01），且乳香高劑量組的促進作用最為明顯。這表明乳香能夠有效促進模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增加和作用時間的延長，促進作用增強。乳香促進成纖維細胞增殖的作用機制可能與多種因素有關(guān)。研究表明，乳香中的主要成分乳香酸能夠激活成纖維細胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，成纖維細胞內(nèi)的MAPK信號通路受到抑制，導(dǎo)致細胞增殖受阻。而乳香酸能夠與細胞表面的受體結(jié)合，激活下游的蛋白激酶，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，進而促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等相關(guān)蛋白的表達，推動細胞從G?-G?期進入S期，促進DNA合成和細胞分裂，從而促進成纖維細胞的增殖。乳香酸還可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激對細胞的損傷，從而為細胞增殖提供有利的環(huán)境。乳香中的揮發(fā)油成分也可能對成纖維細胞的增殖起到一定的促進作用，其具體機制還有待進一步研究。4.2乳香對成纖維細胞膠原合成的影響在創(chuàng)面愈合過程中，膠原蛋白的合成與代謝是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接影響著創(chuàng)面愈合的質(zhì)量和速度。為了深入探究乳香對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞膠原合成的影響，本研究采用了羥脯氨酸試劑盒檢測細胞內(nèi)膠原含量，并運用RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達。實驗過程如下：將NIH3T3成纖維細胞以2×10?個/瓶的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5mL含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。同樣分為正常對照組、模型組、乳香低劑量組（50μg/mL）、乳香中劑量組（100μg/mL）和乳香高劑量組（200μg/mL）。正常對照組加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，各乳香給藥組分別加入含相應(yīng)濃度乳香提取物的含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞。對于細胞內(nèi)膠原含量的檢測，先將收集的細胞用PBS洗滌2次，加入0.5mL0.1mol/LNaOH溶液，在4℃條件下裂解細胞過夜。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min離心15min，取上清液。按照羥脯氨酸試劑盒說明書的操作步驟，加入相應(yīng)的試劑進行顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在550nm波長處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞內(nèi)羥脯氨酸的含量，進而換算成膠原含量。對于Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達的檢測，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。Ⅰ型膠原上游引物序列為5'-CCGGAGAAGACAGCAAGAAA-3'，下游引物序列為5'-GCCATCAGTCCAGGAAGTGA-3'；Ⅲ型膠原上游引物序列為5'-GCAGAAGAAGCAGGAAGAGA-3'，下游引物序列為5'-TGGTGAGGGTTGGATGAAGT-3'。以GAPDH作為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，下游引物序列為5'-GGTGAAGACGCCAGAGAT-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計算Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞內(nèi)膠原含量顯著降低（P<0.01），Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量也明顯下調(diào)（P<0.01），這表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境抑制了成纖維細胞膠原的合成。與模型組相比，乳香各劑量組細胞內(nèi)膠原含量均有不同程度的升高，且呈劑量依賴性。乳香高劑量組的膠原含量與模型組相比有極顯著差異（P<0.01）。在Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達方面，乳香各劑量組的表達水平均高于模型組，其中乳香中、高劑量組與模型組相比有顯著差異（P<0.05）。這表明乳香能夠促進模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞膠原的合成，上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達。乳香促進成纖維細胞膠原合成的作用機制可能與TGF-β/Smad信號通路有關(guān)。TGF-β是一種重要的細胞因子，在創(chuàng)面愈合過程中對膠原合成起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在正常情況下，TGF-β與細胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進入細胞核后，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質(zhì)成分的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。在慢性創(chuàng)面的低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，TGF-β/Smad信號通路受到抑制，導(dǎo)致膠原合成減少。乳香中的活性成分可能通過激活TGF-β/Smad信號通路，增強Smad蛋白的磷酸化水平，促進其核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，增加膠原的合成。乳香還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如PI3K/Akt信號通路，間接影響膠原的合成。PI3K/Akt信號通路在細胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮重要作用，激活該信號通路可以促進成纖維細胞的增殖和膠原合成。乳香中的成分可能通過激活PI3K，使Akt發(fā)生磷酸化，進而調(diào)節(jié)下游與膠原合成相關(guān)的分子，促進膠原的合成。4.3乳香對成纖維細胞相關(guān)信號通路的影響為了深入探究乳香促進模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖和膠原合成的內(nèi)在機制，本研究對成纖維細胞內(nèi)相關(guān)信號通路進行了研究。實驗主要聚焦于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/Smad信號通路，這兩條信號通路在細胞增殖、分化以及細胞外基質(zhì)合成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)。將NIH3T3成纖維細胞按照之前的分組方式進行培養(yǎng)，在不同處理條件下作用相應(yīng)時間后，收集細胞。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測細胞內(nèi)MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達水平，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38MAPK及其磷酸化形式。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞中p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達水平顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境抑制了MAPK信號通路的激活。而在給予乳香處理后，乳香各劑量組細胞中p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達水平均有不同程度的升高，且呈劑量依賴性。乳香高劑量組的p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK表達水平與模型組相比有極顯著差異（P<0.01）。這表明乳香能夠激活模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞的MAPK信號通路，促進相關(guān)蛋白的磷酸化，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖和功能。在TGF-β/Smad信號通路的研究中，同樣采用Westernblot法檢測細胞內(nèi)TGF-β、Smad2/3及其磷酸化形式的表達水平。實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組細胞中TGF-β、p-Smad2/3的表達水平明顯降低（P<0.01），說明低氧低營養(yǎng)環(huán)境抑制了TGF-β/Smad信號通路。與模型組相比，乳香各劑量組細胞中TGF-β、p-Smad2/3的表達水平顯著升高，且乳香高劑量組的升高最為明顯（P<0.01）。這表明乳香能夠激活TGF-β/Smad信號通路，促進TGF-β的表達和Smad2/3的磷酸化，從而調(diào)節(jié)成纖維細胞的膠原合成。進一步的機制研究表明，乳香中的活性成分乳香酸可能是激活上述信號通路的關(guān)鍵物質(zhì)。乳香酸能夠與細胞表面的特異性受體結(jié)合，啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在MAPK信號通路中，乳香酸可能通過激活受體酪氨酸激酶，進而激活下游的Ras蛋白，Ras蛋白再依次激活Raf、MEK等激酶，最終使ERK、JNK和p38MAPK發(fā)生磷酸化，激活的MAPK進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，促進細胞增殖。在TGF-β/Smad信號通路中，乳香酸可能通過促進TGF-β的分泌或增強TGF-β與受體的結(jié)合能力，激活受體的激酶活性，使Smad2/3發(fā)生磷酸化。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物進入細胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質(zhì)成分的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。五、血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用研究5.1血竭對成纖維細胞增殖的影響為了探究血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖的影響，本研究同樣采用MTT法進行實驗。將處于對數(shù)生長期的NIH3T3成纖維細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μL含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。實驗分組如下：正常對照組、模型組、血竭低劑量組（25μg/mL）、血竭中劑量組（50μg/mL）和血竭高劑量組（100μg/mL）。正常對照組加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，各血竭給藥組分別加入含相應(yīng)濃度血竭提取物的含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h，然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值反映細胞增殖情況。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞在24h、48h和72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境明顯抑制了成纖維細胞的增殖。與模型組相比，血竭各劑量組細胞的OD值在不同時間點均有不同程度的升高，且呈時間和劑量依賴性。在24h時，血竭高劑量組的OD值與模型組相比有顯著差異（P<0.05）；在48h和72h時，血竭中、高劑量組的OD值與模型組相比均有極顯著差異（P<0.01），且血竭高劑量組的促進作用最為明顯。這表明血竭能夠有效促進模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增加和作用時間的延長，促進作用增強。血竭促進成纖維細胞增殖的作用機制可能與多條信號通路的激活有關(guān)。研究表明，血竭中的活性成分能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。在正常情況下，PI3K/Akt信號通路在細胞生長、增殖和存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)細胞受到刺激時，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP?），PIP?招募Akt到細胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以通過調(diào)節(jié)下游多種靶蛋白的活性，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等相關(guān)蛋白的表達，推動細胞從G?-G?期進入S期，促進DNA合成和細胞分裂，從而促進成纖維細胞的增殖。在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，PI3K/Akt信號通路受到抑制，而血竭中的成分能夠激活該信號通路，從而促進細胞增殖。血竭還可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來促進成纖維細胞增殖。MAPK信號通路在細胞生長、分化和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。血竭中的活性成分能夠使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等發(fā)生磷酸化激活。激活的ERK可以促進細胞增殖相關(guān)基因的表達，JNK和p38MAPK則參與細胞的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)。在慢性創(chuàng)面的低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，MAPK信號通路的活性降低，血竭能夠激活該信號通路，增強ERK等激酶的活性，促進成纖維細胞的增殖。血竭可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和抑制因子，使細胞從G?期進入S期，促進細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，血竭能夠上調(diào)細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達，這些蛋白在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，能夠促進細胞周期的進程，從而促進成纖維細胞的增殖。5.2血竭對成纖維細胞遷移和分化的影響為進一步探究血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的作用，本研究采用劃痕實驗和免疫熒光染色法，分別檢測血竭對成纖維細胞遷移能力和向肌成纖維細胞分化的影響。劃痕實驗具體步驟如下：將NIH3T3成纖維細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞融合度達到80%-90%時，用10μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，然后用PBS輕輕沖洗3次，以去除劃下的細胞。實驗分組為正常對照組、模型組、血竭低劑量組（25μg/mL）、血竭中劑量組（50μg/mL）和血竭高劑量組（100μg/mL）。正常對照組加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，各血竭給藥組分別加入含相應(yīng)濃度血竭提取物的含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。分別在劃痕后0h、24h和48h，使用倒置顯微鏡觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，遷移率=（0h劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。免疫熒光染色法用于檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，以評估成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化情況。將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)方法同劃痕實驗。待細胞處理結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS沖洗3次，每次5min。用0.1%TritonX-100破膜10min，PBS沖洗3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄去封閉液，加入α-SMA一抗（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入熒光二抗（1:500稀釋），室溫避光孵育1h。PBS沖洗3次，每次5min，用DAPI染核5min，PBS沖洗3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)α-SMA陽性細胞數(shù)，計算α-SMA陽性細胞率。劃痕實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞在24h和48h的遷移率顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境抑制了成纖維細胞的遷移能力。與模型組相比，血竭各劑量組細胞的遷移率在不同時間點均有不同程度的升高，且呈劑量依賴性。在24h時，血竭高劑量組的遷移率與模型組相比有顯著差異（P<0.05）；在48h時，血竭中、高劑量組的遷移率與模型組相比均有極顯著差異（P<0.01）。這表明血竭能夠促進模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞的遷移，增強其修復(fù)創(chuàng)面的能力。免疫熒光染色結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組α-SMA陽性細胞率顯著升高（P<0.01），說明低氧低營養(yǎng)環(huán)境促進了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。與模型組相比，血竭各劑量組α-SMA陽性細胞率均有不同程度的降低，且呈劑量依賴性。血竭高劑量組的α-SMA陽性細胞率與模型組相比有極顯著差異（P<0.01）。這表明血竭能夠抑制模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞向肌成纖維細胞的過度分化，維持成纖維細胞的正常生物學(xué)功能。血竭促進成纖維細胞遷移的機制可能與激活相關(guān)信號通路有關(guān)。研究表明，血竭中的活性成分能夠激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進細胞骨架的重組和細胞遷移相關(guān)蛋白的表達。在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，成纖維細胞內(nèi)的MAPK信號通路受到抑制，細胞遷移能力下降。血竭中的成分能夠激活MAPK信號通路，使細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等發(fā)生磷酸化激活，進而調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白如肌動蛋白的聚合和解聚，促進細胞的遷移。血竭還可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，降解細胞外基質(zhì)，為細胞遷移提供有利的微環(huán)境。MMPs能夠分解細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖維連接蛋白等成分，使細胞能夠更容易地穿過細胞外基質(zhì)進行遷移。血竭抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞過度分化的機制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子和信號通路有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是誘導(dǎo)成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的關(guān)鍵細胞因子。在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，TGF-β1的表達上調(diào)，促進了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。血竭中的活性成分可能通過抑制TGF-β1的表達或阻斷其信號傳導(dǎo)通路，減少α-SMA的表達，從而抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的過度分化。研究表明，血竭中的成分能夠降低TGF-β1的mRNA和蛋白表達水平，抑制TGF-β1與其受體的結(jié)合，阻斷Smad信號通路的激活，從而減少α-SMA的合成，維持成纖維細胞的正常表型。5.3血竭對成纖維細胞相關(guān)細胞因子表達的影響為探究血竭對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞相關(guān)細胞因子表達的影響，本研究采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測細胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）mRNA的表達水平，同時運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)上清液中這些細胞因子的蛋白含量。實驗步驟如下：將NIH3T3成纖維細胞以2×10?個/瓶的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5mL含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。實驗分組為正常對照組、模型組、血竭低劑量組（25μg/mL）、血竭中劑量組（50μg/mL）和血竭高劑量組（100μg/mL）。正常對照組加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，各血竭給藥組分別加入含相應(yīng)濃度血竭提取物的含0.5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液。對于細胞中VEGF、TGF-β1和bFGFmRNA表達水平的檢測，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行RT-qPCR擴增。VEGF上游引物序列為5'-TGAAGCGCAGCATTTCTCAA-3'，下游引物序列為5'-TCACTCGCTGGGATCTTTGT-3'；TGF-β1上游引物序列為5'-CAGGCAACATGAACACCCTG-3'，下游引物序列為5'-TGTGGGGTCTGAGGAGTTGG-3'；bFGF上游引物序列為5'-TGGAACCTCAAGGAAACACC-3'，下游引物序列為5'-CAGCAGTGTGAGCAGGTCTT-3'。以GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列同前。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^-ΔΔCt法計算各細胞因子mRNA的相對表達量。對于細胞培養(yǎng)上清液中VEGF、TGF-β1和bFGF蛋白含量的檢測，按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行。將細胞培養(yǎng)上清液加入到包被有特異性抗體的酶標(biāo)板中，孵育后洗滌，加入酶標(biāo)二抗，再次孵育和洗滌，然后加入底物顯色，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞因子的蛋白含量。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞中VEGF、TGF-β1和bFGFmRNA的相對表達量以及細胞培養(yǎng)上清液中這些細胞因子的蛋白含量均顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境抑制了成纖維細胞相關(guān)細胞因子的表達和分泌。與模型組相比，血竭各劑量組細胞中VEGF、TGF-β1和bFGFmRNA的相對表達量以及細胞培養(yǎng)上清液中這些細胞因子的蛋白含量均有不同程度的升高，且呈劑量依賴性。血竭高劑量組的VEGF、TGF-β1和bFGFmRNA相對表達量以及蛋白含量與模型組相比均有極顯著差異（P<0.01）。這表明血竭能夠促進模擬慢性創(chuàng)面低氧低營養(yǎng)環(huán)境下成纖維細胞VEGF、TGF-β1和bFGF等細胞因子的表達和分泌。血竭促進成纖維細胞相關(guān)細胞因子表達和分泌的機制可能與激活相關(guān)信號通路有關(guān)。研究表明，血竭中的活性成分能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，該信號通路可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如核因子-κB（NF-κB）等，從而促進VEGF、TGF-β1和bFGF等細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。在低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，PI3K/Akt信號通路受到抑制，而血竭能夠激活該信號通路，增強轉(zhuǎn)錄因子與細胞因子基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，促進細胞因子的表達和分泌。血竭還可能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，促進細胞因子的表達。MAPK信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等可以磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白-1（AP-1）等，從而促進VEGF、TGF-β1和bFGF等細胞因子的表達。六、乳香和血竭聯(lián)合作用對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的影響6.1聯(lián)合作用對成纖維細胞增殖和功能的影響為探究乳香和血竭聯(lián)合使用對模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞的影響，設(shè)計了一系列實驗。實驗分組包括正常對照組、模型組、乳香單獨給藥組（100μg/mL）、血竭單獨給藥組（50μg/mL）以及乳香和血竭聯(lián)合給藥組（乳香100μg/mL+血竭50μg/mL）。采用MTT法檢測細胞增殖能力，通過羥脯氨酸試劑盒檢測細胞內(nèi)膠原含量，運用RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達水平。MTT實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞的OD值顯著降低（P<0.01），表明低氧低營養(yǎng)環(huán)境明顯抑制了成纖維細胞的增殖。乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組的OD值均高于模型組（P<0.05），說明乳香和血竭單獨使用均能促進成纖維細胞的增殖。而聯(lián)合給藥組的OD值在24h、48h和72h時均顯著高于乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組（P<0.01），且呈現(xiàn)出時間依賴性，表明乳香和血竭聯(lián)合使用對成纖維細胞增殖具有顯著的協(xié)同促進作用。在24h時，聯(lián)合給藥組的OD值較乳香單獨給藥組提高了20.5%，較血竭單獨給藥組提高了25.3%；在48h時，聯(lián)合給藥組的OD值較乳香單獨給藥組提高了28.7%，較血竭單獨給藥組提高了32.6%；在72h時，聯(lián)合給藥組的OD值較乳香單獨給藥組提高了35.2%，較血竭單獨給藥組提高了39.8%。在細胞內(nèi)膠原含量檢測方面，與正常對照組相比，模型組細胞內(nèi)膠原含量顯著降低（P<0.01）。乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組的膠原含量均高于模型組（P<0.05），表明乳香和血竭單獨使用能促進成纖維細胞合成膠原。聯(lián)合給藥組的膠原含量顯著高于乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組（P<0.01），說明乳香和血竭聯(lián)合使用對成纖維細胞膠原合成具有協(xié)同促進作用。聯(lián)合給藥組的膠原含量較乳香單獨給藥組提高了35.8%，較血竭單獨給藥組提高了42.6%。在Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達檢測中，與正常對照組相比，模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量明顯下調(diào)（P<0.01）。乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達水平均高于模型組（P<0.05）。聯(lián)合給藥組的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達水平顯著高于乳香單獨給藥組和血竭單獨給藥組（P<0.01），進一步證實了乳香和血竭聯(lián)合使用對成纖維細胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原具有協(xié)同促進作用。聯(lián)合給藥組Ⅰ型膠原mRNA表達水平較乳香單獨給藥組提高了48.5%，較血竭單獨給藥組提高了56.3%；Ⅲ型膠原mRNA表達水平較乳香單獨給藥組提高了52.7%，較血竭單獨給藥組提高了60.4%。乳香和血竭聯(lián)合使用對成纖維細胞增殖和膠原合成的協(xié)同促進作用可能與多種機制有關(guān)。從信號通路角度來看，乳香中的乳香酸和血竭中的活性成分可能分別激活了不同的信號通路，這些信號通路之間存在相互作用和協(xié)同效應(yīng)，從而共同促進成纖維細胞的增殖和功能。在PI3K/Akt信號通路中，血竭中的成分能夠激活PI3K，使Akt發(fā)生磷酸化，進而促進細胞增殖相關(guān)基因的表達。而乳香中的成分可能通過調(diào)節(jié)其他信號分子，增強PI3K/Akt信號通路的激活程度，從而與血竭產(chǎn)生協(xié)同作用。在TGF-β/Smad信號通路中，乳香和血竭可能共同促進TGF-β的表達和Smad蛋白的磷酸化，增強該信號通路對Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的調(diào)控作用。乳香和血竭聯(lián)合使用可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、促進細胞因子的分泌等方式，為成纖維細胞的增殖和功能發(fā)揮創(chuàng)造更有利的微環(huán)境。乳香和血竭中的抗氧化成分能夠清除細胞內(nèi)的活性氧（ROS），減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，從而促進細胞的增殖和膠原合成。它們還可能促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等細胞因子的分泌，這些細胞因子能夠刺激成纖維細胞的增殖和遷移，促進血管生成，為創(chuàng)面愈合提供必要的條件。6.2聯(lián)合作用的機制探討乳香和血竭聯(lián)合作用促進模擬慢性創(chuàng)面成纖維細胞增殖和功能的機制可能涉及多個層面，包括信號通路的協(xié)同激活以及細胞因子調(diào)節(jié)等。在信號通路方面，研究表明，PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、增殖和存活中起著核心作用。血竭中的活性成分能夠激活PI3K，促使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP?），進而招募并激活A(yù)kt，激活的Akt通過調(diào)節(jié)下游多種靶蛋白的活性，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等相關(guān)蛋白的表達，推動細胞從G?-G?期進入S期，促進DNA合成和細胞分裂，從而促進成纖維細胞的增殖。而乳香中的成分可能通過調(diào)節(jié)其他信號分子，增強PI3K/Akt信號通路的激活程度。乳香中的乳香酸可能與細胞膜上的特定受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)受體的活性或下游信號分子的磷酸化狀態(tài)，增強PI3K的活性，使Akt的磷酸化水平進一步提高，從而與血竭產(chǎn)生協(xié)同作用，共同促進成纖維細胞的增殖。TGF-β/Smad信號通路在細胞外基質(zhì)合成，尤其是膠原合成的調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β與細胞表面的受體結(jié)合，激活受體的激酶活性，使Smad2/3發(fā)生磷酸化。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物進入細胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質(zhì)成分的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。在慢性創(chuàng)面的低氧低營養(yǎng)環(huán)境下，TGF-β/Smad信號通路受到抑制，導(dǎo)致膠原合成減少。乳香和血竭聯(lián)合使用可能共同促進TGF-β的表達和Smad蛋白的磷酸化，增強該信號通路對Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的調(diào)控作用。乳香中的成分可能通過促進TGF-β的分泌或增強TGF-β與受體的結(jié)合能力，而血竭中的成分可能通過抑制Smad蛋白的降解或增強其核轉(zhuǎn)位能力，共同作用于TGF-β/Smad信號通路，促進膠原的合成。從細胞因子調(diào)節(jié)層面來看，乳香和血竭聯(lián)合使用可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、促進細胞因子的分泌等方式，為成纖維細胞的增殖和功能發(fā)揮創(chuàng)造更有利的微環(huán)境。慢性創(chuàng)面的低氧低營養(yǎng)環(huán)境會導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，氧化應(yīng)激增強，從而損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能，抑制細胞的增殖和膠原合成。乳香和血竭中富含多種抗氧化成分，如多酚類、黃酮類化合物等，這些成分能夠清除細胞內(nèi)的ROS，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷。研究表明，乳香中的揮發(fā)油成分具有較強的抗氧化活性，能夠降低細胞內(nèi)ROS的含量，提高細胞內(nèi)抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，從而減輕氧化應(yīng)激對成纖維細胞的損傷，促進細胞的增殖和膠原合成。血竭中的黃酮類化合物也具有抗氧化作用，能夠清除自由基，穩(wěn)定細胞膜，保護細胞免受氧化損傷，為成纖維細胞的功能發(fā)揮提供良好的環(huán)境。乳香和血竭聯(lián)合使用還可能促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等細胞因子的分泌。VEGF是一種重要的促血管生成因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進新生血管的形成。在創(chuàng)面愈合過程中，新生血管為創(chuàng)面提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝廢物，對成纖維細胞的增殖和功能發(fā)揮至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，血竭中的活性成分能夠上調(diào)VEGF的表達和分泌，通過激活相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。乳香中的成