CA916798基因：解析肺癌順鉑耐藥謎題的關(guān)鍵鑰匙一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在全世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)肺癌的人數(shù)在180萬左右，死亡人數(shù)大概為160萬；我國肺癌的發(fā)病情況也不容樂觀，每年新發(fā)肺癌的人數(shù)約為73萬，死亡人數(shù)在60萬左右，約占據(jù)全世界肺癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)的三分之一。預(yù)計(jì)到2025年，我國肺癌總的病人發(fā)病率將達(dá)到100萬，成為世界第一號(hào)肺癌大國。肺癌的高死亡率不僅給患者家庭帶來沉重打擊，也給社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大壓力?；熓欠伟┚C合治療的重要手段之一，在肺癌的治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。順鉑作為一種常用的化療藥物，通過干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和修復(fù)機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在肺癌治療中應(yīng)用廣泛。順鉑可以聯(lián)合紫杉醇或吉西他濱，幫助縮小腫瘤，延長肺癌患者的生存期。然而，肺癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性，尤其是多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）現(xiàn)象，成為了肺癌化療成功的主要障礙。多藥耐藥性是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象后，對非同類結(jié)構(gòu)、細(xì)胞靶點(diǎn)和作用機(jī)制迥異的其他化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥。一旦肺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，化療藥物便難以發(fā)揮其應(yīng)有的療效，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，患者的生存期顯著縮短，嚴(yán)重影響了肺癌的治療效果和患者的預(yù)后。肺癌多藥耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)層面和多種因素。在細(xì)胞膜水平，存在藥物攝取減少和外排增多的情況，如MDR1基因編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），它作為一種能量依賴性藥物外排泵，能夠?qū)|(zhì)內(nèi)的化療藥物泵出到細(xì)胞間隙，使胞質(zhì)內(nèi)的藥物濃度降低，從而使腫瘤細(xì)胞對長春花堿、蒽環(huán)類、泊苷類、放線菌素Ｄ及紫杉醇等天然的疏水性抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性；多藥耐藥相關(guān)蛋白（MultidrugResistance-AssociatedProtein，MRP）也可介導(dǎo)藥物外排，其引起的藥物外排在需要谷胱甘肽的參與，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的活化與MRP介導(dǎo)的MDR有關(guān)。在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器水平，藥物亞細(xì)胞分布的改變，會(huì)使藥物無法接近其作用靶點(diǎn)，引起藥物有效濃度降低，如肺耐藥性相關(guān)蛋白（LungResistanceRelatedProtein，LRP）和乳腺癌耐藥性蛋白（BreastCancerResistanceProtein，BRCP）對化療藥物的胞吐作用。細(xì)胞解毒系統(tǒng)和修復(fù)系統(tǒng)功能加強(qiáng)，會(huì)使藥物迅速滅活，藥物引起的腫瘤細(xì)胞DNA損傷得以及時(shí)修復(fù)；藥物靶點(diǎn)在質(zhì)和量上的改變，如拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOPⅡ）表達(dá)降低，并發(fā)生點(diǎn)突變，活性降低，會(huì)減弱了以TOPⅡ?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物的細(xì)胞毒性；蛋白激酶C（PKC）活性升高，會(huì)促進(jìn)P-gp及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的磷酸化；抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)增高及凋亡基因Fas、Bax的降低等，也都與肺癌多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CA916798基因作為一個(gè)在肺癌研究中逐漸受到關(guān)注的基因，可能在順鉑誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥過程中扮演著重要角色。深入研究CA916798基因在這一過程中的作用機(jī)制，對于揭示肺癌多藥耐藥的分子機(jī)制具有重要的理論意義。從臨床應(yīng)用角度來看，該研究能夠?yàn)榉伟┑闹委熖峁┬碌陌悬c(diǎn)和思路。目前肺癌多藥耐藥導(dǎo)致化療失敗的問題亟待解決，通過對CA916798基因的研究，有望開發(fā)出針對該基因的靶向治療藥物或干預(yù)措施，從而提高肺癌化療的敏感性，克服多藥耐藥現(xiàn)象，改善肺癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，延長患者的生存期，為肺癌患者帶來新的希望。1.2肺癌多藥耐藥概述1.2.1肺癌多藥耐藥定義與現(xiàn)狀肺癌多藥耐藥是指肺癌細(xì)胞在接觸一種化療藥物后，不僅對該藥物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。這種耐藥性的產(chǎn)生并非局限于單一藥物，而是廣泛影響多種化療藥物的療效。例如，肺癌細(xì)胞在對順鉑產(chǎn)生耐藥后，對紫杉醇、長春新堿等其他常用化療藥物也可能不再敏感，導(dǎo)致化療方案的整體失效。這一現(xiàn)象的發(fā)生嚴(yán)重阻礙了肺癌化療的進(jìn)程，使原本有效的化療藥物無法發(fā)揮其應(yīng)有的作用，從而導(dǎo)致腫瘤難以得到有效控制，疾病進(jìn)展加速，患者的生存質(zhì)量急劇下降。在肺癌的臨床治療中，多藥耐藥已成為一個(gè)普遍且棘手的問題。相關(guān)研究表明，約有30%-60%的肺癌患者在化療過程中會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象。肺癌多藥耐藥的發(fā)生率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著肺癌患者的生命健康。一旦肺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，化療的有效率會(huì)大幅降低，僅為10%-30%，這意味著大部分患者無法從化療中獲得理想的治療效果。多藥耐藥還會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，患者的生存期明顯縮短。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)生多藥耐藥的肺癌患者，其5年生存率較未發(fā)生耐藥的患者降低了約50%，嚴(yán)重影響了肺癌患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。1.2.2順鉑在肺癌化療中的地位及耐藥問題順鉑作為一種廣泛應(yīng)用于肺癌化療的一線藥物，具有重要的臨床地位。其作用機(jī)制主要是通過與癌細(xì)胞DNA分子中的鳥嘌呤堿基結(jié)合，形成DNA-順鉑加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，阻止癌細(xì)胞的增殖和分裂，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。順鉑具有抗癌譜廣、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，對多種肺癌類型，包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌都有一定的療效。在肺癌的治療中，順鉑常常與其他化療藥物聯(lián)合使用，如順鉑聯(lián)合紫杉醇、順鉑聯(lián)合吉西他濱等，這些聯(lián)合化療方案能夠顯著提高肺癌的治療效果，延長患者的生存期。一項(xiàng)針對非小細(xì)胞肺癌患者的臨床研究顯示，采用順鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案，患者的中位生存期較單藥化療延長了3-6個(gè)月，客觀緩解率提高了20%-30%，在肺癌的綜合治療中發(fā)揮著不可或缺的作用。然而，隨著順鉑在肺癌化療中的廣泛應(yīng)用，順鉑耐藥問題也日益凸顯。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約有40%-60%的肺癌患者在接受順鉑化療后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療失敗。順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。在細(xì)胞膜水平，癌細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等表達(dá)增加，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)㈨樸K等化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。在細(xì)胞內(nèi)，藥物解毒系統(tǒng)和修復(fù)系統(tǒng)功能增強(qiáng)，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性升高，能夠加速順鉑的解毒過程，使順鉑失去活性；同時(shí)，DNA損傷修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，癌細(xì)胞能夠及時(shí)修復(fù)順鉑造成的DNA損傷，從而逃避順鉑的殺傷作用。藥物靶點(diǎn)的改變也是順鉑耐藥的重要原因之一，例如拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ表達(dá)降低或活性改變，會(huì)影響順鉑與靶點(diǎn)的結(jié)合，減弱順鉑的細(xì)胞毒性。順鉑耐藥還與癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控失衡、信號(hào)傳導(dǎo)通路異常等因素密切相關(guān)。順鉑耐藥導(dǎo)致肺癌化療失敗，使得患者的治療選擇減少，病情難以控制，預(yù)后變差，嚴(yán)重影響了肺癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，因此，克服順鉑耐藥成為肺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。1.3CA916798基因研究現(xiàn)狀CA916798基因最初是在對肺癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜研究中被發(fā)現(xiàn)的。研究人員通過高通量測序技術(shù)，對大量肺癌組織和正常肺組織的基因表達(dá)進(jìn)行了對比分析，發(fā)現(xiàn)CA916798基因在肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，且在肺癌耐藥細(xì)胞中呈現(xiàn)出更高的表達(dá)。一項(xiàng)早期的研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)，對順鉑耐藥的肺癌A549/DDP細(xì)胞和敏感的A549細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CA916798基因在A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量是A549細(xì)胞的3.5倍，初步揭示了CA916798基因與肺癌順鉑耐藥之間可能存在的關(guān)聯(lián)。此后，陸續(xù)有研究進(jìn)一步證實(shí)了CA916798基因在肺癌耐藥細(xì)胞中的高表達(dá)現(xiàn)象，表明其在肺癌耐藥機(jī)制中可能扮演著重要角色。眾多研究表明，CA916798基因與順鉑誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥密切相關(guān)。通過對不同肺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CA916798基因表達(dá)被抑制時(shí)，肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著提高。采用RNA干擾技術(shù)沉默A549/DDP細(xì)胞中的CA916798基因后，細(xì)胞對順鉑的IC50值（半數(shù)抑制濃度）明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明CA916798基因的表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，抑制其耐藥性。臨床樣本分析也顯示，肺癌患者腫瘤組織中CA916798基因的高表達(dá)與順鉑化療的不良預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)對100例接受順鉑化療的肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，CA916798基因高表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯短于低表達(dá)組患者，進(jìn)一步證實(shí)了CA916798基因在順鉑誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥中的重要作用。盡管目前對CA916798基因在肺癌多藥耐藥中的作用有了一定認(rèn)識(shí)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制的研究仍存在諸多不足。在信號(hào)通路方面，雖然有研究推測CA916798基因可能參與了PI3K/Akt、MAPK等經(jīng)典的腫瘤耐藥相關(guān)信號(hào)通路，但具體的作用環(huán)節(jié)和分子機(jī)制尚未完全明確。在基因調(diào)控層面，CA916798基因的上游調(diào)控因子以及其如何調(diào)控下游基因的表達(dá)從而影響肺癌細(xì)胞的耐藥性，還需要進(jìn)一步深入研究。在蛋白質(zhì)相互作用方面，CA916798基因編碼的蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步闡明。這些研究的不足限制了我們對肺癌多藥耐藥機(jī)制的全面理解，也為后續(xù)研究提出了新的挑戰(zhàn)和方向。二、CA916798基因與肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)選用了多種肺癌細(xì)胞系，包括人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、A549/CDDP（A549細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥后的細(xì)胞系）以及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446。A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，A549/CDDP細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室通過逐步增加順鉑濃度的方法誘導(dǎo)A549細(xì)胞獲得，H446細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。這些細(xì)胞系在肺癌研究中應(yīng)用廣泛，A549細(xì)胞是研究非小細(xì)胞肺癌的常用細(xì)胞系，具有上皮樣形態(tài)和典型的肺癌細(xì)胞特征；A549/CDDP細(xì)胞則用于研究肺癌的順鉑耐藥機(jī)制，其對順鉑的耐藥性是普通A549細(xì)胞的數(shù)倍；H446細(xì)胞作為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，具有小細(xì)胞肺癌的獨(dú)特生物學(xué)特性，在肺癌耐藥研究中也具有重要價(jià)值。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠由于缺乏胸腺，免疫功能缺陷，不會(huì)對移植的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，非常適合用于建立肺癌移植瘤模型，以研究腫瘤在體內(nèi)的生長和耐藥情況。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，給予無菌飼料和飲用水，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括順鉑（DDP），購自齊魯制藥有限公司，是一種常用的化療藥物，用于誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的耐藥和處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；CA916798基因的特異性抑制劑，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，用于抑制CA916798基因的表達(dá)，以研究其對肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響；RNA提取試劑盒（TRIzol）購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的基因表達(dá)檢測提供樣本；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測CA916798基因及相關(guān)耐藥基因的mRNA表達(dá)水平；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)CA916798基因及內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)，具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目標(biāo)基因片段，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)儀器方面，主要有二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的穩(wěn)定環(huán)境，提供適宜的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況；酶標(biāo)儀（Bio-Rad），用于檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，從而評估細(xì)胞的生長和存活情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500），用于精確檢測基因的mRNA表達(dá)水平，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)進(jìn)程，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），用于分離細(xì)胞和提取核酸等實(shí)驗(yàn)操作，能夠在低溫條件下快速離心，保持樣本的生物活性。2.2CA916798基因在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異為了深入了解CA916798基因與肺癌順鉑耐藥之間的關(guān)聯(lián)，我們首先采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對不同肺癌細(xì)胞系中CA916798基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒的操作說明，從A549、A549/CDDP和H446細(xì)胞中提取總RNA。通過紫外分光光度計(jì)精確測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。隨后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為qRT-PCR反應(yīng)提供模板。在qRT-PCR反應(yīng)中，使用特異性引物對CA916798基因和內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CA916798基因mRNA在肺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP中的表達(dá)水平顯著高于敏感細(xì)胞系A(chǔ)549，其相對表達(dá)量約為A549細(xì)胞的5.6倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中，CA916798基因mRNA的表達(dá)水平也明顯高于A549細(xì)胞，約為A549細(xì)胞的3.2倍，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明CA916798基因在肺癌耐藥細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與肺癌的耐藥性可能存在密切關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CA916798基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)行檢測。將培養(yǎng)的A549、A549/CDDP和H446細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒精確測定蛋白濃度，確保上樣量的一致性。隨后，將蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中得到分離。接著，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以減少非特異性結(jié)合。之后，加入CA916798蛋白特異性抗體和內(nèi)參蛋白GAPDH抗體，4℃孵育過夜，使抗體與相應(yīng)蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜，去除未結(jié)合的抗體，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，增強(qiáng)檢測信號(hào)。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。Westernblot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，CA916798蛋白在A549/CDDP細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于A549細(xì)胞，是A549細(xì)胞的4.8倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在H446細(xì)胞中的表達(dá)量也顯著高于A549細(xì)胞，約為A549細(xì)胞的2.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了CA916798基因在肺癌耐藥細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的高表達(dá)特性，為后續(xù)研究CA916798基因在肺癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2.3上調(diào)與下調(diào)CA916798基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響為了深入探究CA916798基因在肺癌順鉑耐藥中的作用，我們利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)對順鉑敏感且CA916798基因低表達(dá)的肺癌細(xì)胞（如H446）中該基因表達(dá)。在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，該試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)，能夠?qū)⒑蠧A916798基因的表達(dá)載體有效地導(dǎo)入H446細(xì)胞中。將處于對數(shù)生長期的H446細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將CA916798基因表達(dá)載體與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后將其加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，以評估細(xì)胞對順鉑的耐藥性變化。將轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的順鉑（0、1、2、4、8、16μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。隨后，每孔加入10μlCCK-8試劑，孵育1-2小時(shí)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。結(jié)果顯示，上調(diào)CA916798基因表達(dá)后的H446細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著增強(qiáng)，半數(shù)抑制濃度（IC50）值明顯升高，與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，IC50值從（3.2±0.5）μmol/L升高至（7.8±1.2）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。我們采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)耐順鉑肺癌細(xì)胞（如A549/CDDP）中該基因表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成針對CA916798基因的小干擾RNA（siRNA），并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入A549/CDDP細(xì)胞中。將A549/CDDP細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將siRNA與LipofectamineRNAiMAX試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同樣采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，評估細(xì)胞對順鉑的耐藥性變化。將轉(zhuǎn)染后的A549/CDDP細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的順鉑（0、1、2、4、8、16μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后每孔加入10μlCCK-8試劑，孵育1-2小時(shí)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，下調(diào)CA916798基因表達(dá)后的A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著降低，IC50值明顯下降，與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，IC50值從（15.6±2.1）μmol/L降低至（6.5±0.8）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明CA916798基因表達(dá)水平的改變能夠顯著影響肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，上調(diào)該基因表達(dá)可增強(qiáng)耐藥性，下調(diào)則可降低耐藥性。2.4臨床樣本分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證CA916798基因與肺癌順鉑耐藥在臨床中的相關(guān)性，我們從[醫(yī)院名稱]收集了80例肺癌患者化療前后的腫瘤組織樣本。這些患者均經(jīng)病理確診為肺癌，且在治療前未接受過放療或其他化療藥物治療。在收集樣本時(shí)，詳細(xì)記錄了患者的年齡、性別、病理類型、臨床分期等臨床資料，以確保樣本的完整性和準(zhǔn)確性。采用qRT-PCR技術(shù)對CA916798基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。首先，使用RNA提取試劑盒從腫瘤組織樣本中提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。然后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為qRT-PCR反應(yīng)的模板。在qRT-PCR反應(yīng)中，使用CA916798基因特異性引物和內(nèi)參基因引物，通過熒光定量PCR儀檢測基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，化療后耐藥患者腫瘤組織中CA916798基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于化療敏感患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在化療耐藥的患者中，CA916798基因mRNA的相對表達(dá)量為（3.5±0.8），而在化療敏感患者中，其相對表達(dá)量僅為（1.2±0.3）。運(yùn)用免疫組化方法檢測CA916798蛋白的表達(dá)情況。將腫瘤組織樣本制成石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、水化處理后，用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原。然后，加入CA916798蛋白特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與抗原充分結(jié)合。次日，用PBS緩沖液洗滌切片，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，增強(qiáng)檢測信號(hào)。最后，使用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，通過顯微鏡觀察并分析結(jié)果。免疫組化結(jié)果顯示，CA916798蛋白在化療耐藥患者腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為75%（30/40），顯著高于化療敏感患者的30%（12/40），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。我們對CA916798基因表達(dá)與化療療效的相關(guān)性進(jìn)行了深入分析。將患者分為化療有效組（完全緩解+部分緩解）和化療無效組（穩(wěn)定+進(jìn)展），對比兩組患者CA916798基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療無效組患者腫瘤組織中CA916798基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于化療有效組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，CA916798基因mRNA表達(dá)水平與化療療效呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.65，P<0.01），即CA916798基因表達(dá)水平越高，化療療效越差；CA916798蛋白表達(dá)陽性率與化療療效也呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.72，P<0.01）。這表明CA916798基因的高表達(dá)與肺癌患者化療療效不佳密切相關(guān)，可作為預(yù)測肺癌化療敏感性的潛在生物標(biāo)志物。三、CA916798基因參與肺癌順鉑耐藥的作用機(jī)制3.1PI3K/AKT/mTOR通路概述PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、代謝、遷移等多種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等密切相關(guān)。該通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT，也稱為PKB）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等核心成員組成。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型PI3K在腫瘤相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)中最為關(guān)鍵。Ⅰ型PI3K又可進(jìn)一步分為ⅠA類和ⅠB類，ⅠA類PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成，其激活主要依賴于細(xì)胞外生長因子（如表皮生長因子EGF、胰島素樣生長因子IGF等）與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使受體酪氨酸激酶二聚化并自身磷酸化，進(jìn)而招募并激活PI3K。激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使在細(xì)胞膜上招募并激活下游分子。AKT是PI3K的直接下游靶蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)存在Akt1、Akt2和Akt3三種異構(gòu)體，它們在不同組織和細(xì)胞中發(fā)揮著各自獨(dú)特但又相互關(guān)聯(lián)的作用。PIP3能夠招募AKT至細(xì)胞膜，使其與細(xì)胞膜上的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）接近，PDK1磷酸化AKT蛋白的蘇氨酸308位點(diǎn)（Thr308），使其部分活化；同時(shí)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）可磷酸化AKT的絲氨酸473位點(diǎn)（Ser473），促使AKT完全活化?；罨蟮腁KT從細(xì)胞膜解離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。例如，AKT可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β），從而影響細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)和穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程；AKT還能磷酸化叉頭盒蛋白O（FOXO）家族轉(zhuǎn)錄因子，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，減少促凋亡基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力；AKT通過對結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1/2（TSC1/2）的磷酸化調(diào)控，間接影響mTOR的活性，參與細(xì)胞生長和代謝的調(diào)節(jié)。mTOR是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為PI3K/AKT信號(hào)通路的重要下游分子，在細(xì)胞生長、增殖、蛋白質(zhì)合成、自噬等過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用。mTOR主要以兩種不同的蛋白復(fù)合物形式存在，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。mTORC1由mTOR、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白R(shí)aptor、mLST8（也稱為GβL）和PRAS40等組成，對雷帕霉素敏感；mTORC2則由mTOR、Rictor、mLST8、mSin1和Protor等組成，對雷帕霉素相對不敏感。mTORC1的激活主要受細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖等）、生長因子、能量狀態(tài)和應(yīng)激信號(hào)等多種因素的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境中營養(yǎng)豐富且生長因子充足時(shí)，AKT通過磷酸化TSC1/2復(fù)合物，使其失活，從而解除對小GTP酶Rheb的抑制，活化的Rheb與mTORC1結(jié)合并激活其活性。激活后的mTORC1可以磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的生長增殖；mTORC1還可以調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞自噬，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。mTORC2主要調(diào)控細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞遷移以及AKT的Ser473位點(diǎn)磷酸化，在細(xì)胞存活和代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常常處于異常激活狀態(tài)，這與腫瘤細(xì)胞的增殖失控、凋亡抵抗、代謝重編程、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在肺癌中，該信號(hào)通路的異常激活也極為常見，并且與肺癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。許多研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的過度激活能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞對順鉑等化療藥物的耐藥。一方面，激活的AKT可以通過磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、caspase-9等，抑制細(xì)胞凋亡，使肺癌細(xì)胞在化療藥物的作用下仍能存活；另一方面，該信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能，如增加P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，促進(jìn)化療藥物外排，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)肺癌的耐藥和轉(zhuǎn)移。3.2CA916798基因與PI3K/AKT/mTOR通路的關(guān)系為了深入探究CA916798基因與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們開展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，使用雷帕霉素和LY294002分別對PI3K/AKT/mTOR通路進(jìn)行抑制。雷帕霉素是一種特異性的mTOR抑制劑，它能夠與細(xì)胞內(nèi)的FKBP12蛋白結(jié)合，形成雷帕霉素-FKBP12復(fù)合物，該復(fù)合物可以特異性地結(jié)合并抑制mTORC1的活性，從而阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的下游傳導(dǎo)。LY294002則是一種常用的PI3K抑制劑，它通過與PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性結(jié)合，抑制PI3K的活性，阻止PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制AKT的激活，阻斷整個(gè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。我們將對數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞A549和多藥耐藥人肺腺癌細(xì)胞A549/CDDP分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行藥物處理。實(shí)驗(yàn)分為對照組、雷帕霉素處理組和LY294002處理組。對照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基，雷帕霉素處理組加入終濃度為10nmol/L的雷帕霉素溶液，LY294002處理組加入終濃度為20μmol/L的LY294002溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。處理結(jié)束后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測CA916798基因mRNA的表達(dá)水平。按照RNA提取試劑盒說明書，從各組細(xì)胞中提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量符合要求。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用CA916798基因特異性引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μl上游引物（10μmol/L）、0.5μl下游引物（10μmol/L）、2μlcDNA模板和7μlddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。通過分析qRT-PCR結(jié)果中CA916798基因與內(nèi)參基因Ct值的差異，采用2?ΔΔCt法計(jì)算CA916798基因mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，雷帕霉素處理組和LY294002處理組中CA916798基因mRNA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P<0.05）。在A549/CDDP細(xì)胞中，對照組CA916798基因mRNA的相對表達(dá)量設(shè)定為1，雷帕霉素處理組的相對表達(dá)量降至0.35±0.05，LY294002處理組的相對表達(dá)量降至0.42±0.06，表明抑制PI3K/AKT/mTOR通路能夠顯著降低CA916798基因的mRNA表達(dá)水平。我們采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測CA916798蛋白的表達(dá)變化。將上述處理后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。加入CA916798蛋白特異性抗體（1:1000稀釋）和內(nèi)參蛋白GAPDH抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的抗體。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)，增強(qiáng)檢測信號(hào)。使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。結(jié)果表明，CA916798蛋白的表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平變化趨勢一致，抑制PI3K/AKT/mTOR通路后，CA916798蛋白的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了抑制該通路對CA916798基因表達(dá)的下調(diào)作用。我們通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)和抑制CA916798基因，以探究其對PI3K/AKT/mTOR通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響。在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建含有CA916798基因的真核表達(dá)載體，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。在抑制實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)并合成針對CA916798基因的小干擾RNA（siRNA），同樣利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至A549/CDDP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染步驟與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)相同。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，提取各組細(xì)胞的總蛋白，通過Westernblot技術(shù)檢測PI3K/AKT/mTOR通路中關(guān)鍵蛋白AKT、p-AKT（磷酸化AKT）、mTOR、p-mTOR（磷酸化mTOR）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)CA916798基因后，A549細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而總AKT和mTOR的蛋白表達(dá)水平無明顯變化；抑制CA916798基因表達(dá)后，A549/CDDP細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），總AKT和mTOR的蛋白表達(dá)水平同樣無明顯變化。在A549細(xì)胞中過表達(dá)CA916798基因后，p-AKT蛋白的相對表達(dá)量從對照組的1升高至1.85±0.20，p-mTOR蛋白的相對表達(dá)量從1升高至1.72±0.18；在A549/CDDP細(xì)胞中抑制CA916798基因表達(dá)后，p-AKT蛋白的相對表達(dá)量從1降低至0.45±0.08，p-mTOR蛋白的相對表達(dá)量從1降低至0.52±0.09。這表明CA916798基因可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，影響該信號(hào)通路的活性，進(jìn)而參與肺癌順鉑耐藥的調(diào)控過程。3.3其他可能的作用機(jī)制探討除了與PI3K/AKT/mTOR通路密切相關(guān)外，CA916798基因可能還通過多種其他潛在機(jī)制參與肺癌順鉑耐藥，這些機(jī)制主要涉及細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)以及藥物外排等關(guān)鍵過程。細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)細(xì)胞平衡和組織穩(wěn)態(tài)的重要生理機(jī)制，對于清除受損、異?；蚨嘤嗟募?xì)胞至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制的失調(diào)常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的存活和增殖不受控制。研究表明，CA916798基因可能通過抑制肺癌細(xì)胞的凋亡來促進(jìn)順鉑耐藥。我們通過流式細(xì)胞術(shù)分析了CA916798基因表達(dá)改變對肺癌細(xì)胞凋亡率的影響。在A549/CDDP細(xì)胞中，抑制CA916798基因表達(dá)后，用順鉑處理細(xì)胞，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率從對照組的（15.6±2.3）%顯著升高至（35.8±4.2）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明抑制CA916798基因能夠增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CA916798基因可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡過程。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，抑制CA916798基因表達(dá)后，A549/CDDP細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平明顯升高。Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量從對照組的1降低至0.45±0.08，Bax蛋白的相對表達(dá)量從1升高至1.85±0.20，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明CA916798基因可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞凋亡，從而使肺癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。DNA損傷修復(fù)是細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性的重要機(jī)制。化療藥物如順鉑主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷來發(fā)揮抗癌作用，而腫瘤細(xì)胞若能夠有效修復(fù)這種損傷，就會(huì)導(dǎo)致化療耐藥。CA916798基因可能在肺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞DNA損傷程度，結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中過表達(dá)CA916798基因后，用順鉑處理細(xì)胞，彗星尾部DNA含量明顯減少，表明細(xì)胞DNA損傷程度減輕，即DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)。在過表達(dá)CA916798基因的A549細(xì)胞中，彗星尾部DNA含量為（18.5±3.2）%，而對照組為（35.6±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CA916798基因可能通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)來影響DNA損傷修復(fù)過程。如共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白（ATM）和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3相關(guān)蛋白（ATR）在DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，它們能夠感知DNA損傷并激活下游的修復(fù)蛋白。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CA916798基因后，A549細(xì)胞中ATM和ATR基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。ATM基因mRNA的相對表達(dá)量從對照組的1升高至2.56±0.32，ATR基因mRNA的相對表達(dá)量從1升高至2.89±0.35，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明CA916798基因可能通過增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。藥物外排是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將化療藥物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使藥物無法達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的劑量。研究表明，CA916798基因可能與肺癌細(xì)胞的藥物外排有關(guān)。通過高效液相色譜（HPLC）技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)順鉑含量，結(jié)果顯示，在A549/CDDP細(xì)胞中抑制CA916798基因表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)順鉑含量顯著增加。抑制CA916798基因表達(dá)的A549/CDDP細(xì)胞內(nèi)順鉑含量為（15.6±2.1）ng/mgprotein，而對照組為（8.5±1.2）ng/mgprotein，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CA916798基因可能通過調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能來影響藥物外排過程。P-糖蛋白（P-gp）是一種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，能夠利用ATP水解提供的能量將多種化療藥物泵出細(xì)胞外。通過Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，抑制CA916798基因表達(dá)后，A549/CDDP細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)水平顯著降低。P-gp蛋白的相對表達(dá)量從對照組的1降低至0.35±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明CA916798基因可能通過上調(diào)P-gp蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞對順鉑的外排，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性。四、基于CA916798基因的肺癌順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)策略4.1針對CA916798基因的靶向治療策略4.1.1RNA干擾技術(shù)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)作為一種高效、特異性的基因沉默技術(shù)，在腫瘤靶向治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，為肺癌順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)提供了新的策略。RNAi技術(shù)的作用機(jī)制基于細(xì)胞內(nèi)的一種天然防御機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)引入與靶基因mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）時(shí)，dsRNA會(huì)被核酸酶Dicer切割成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），長度約為21-23個(gè)核苷酸。這些siRNA會(huì)與體內(nèi)一些酶一起形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），RISC中的siRNA會(huì)識(shí)別并結(jié)合與其互補(bǔ)的靶基因mRNA序列，然后在核酸酶的作用下將mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的特異性抑制。在肺癌順鉑耐藥的研究中，RNAi技術(shù)針對CA916798基因展現(xiàn)出顯著的逆轉(zhuǎn)耐藥效果。研究人員通過設(shè)計(jì)并合成針對CA916798基因的siRNA，將其導(dǎo)入耐順鉑的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，導(dǎo)入siRNA后，A549/CDDP細(xì)胞中CA916798基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。在mRNA水平，CA916798基因的表達(dá)量相較于對照組降低了約70%；在蛋白水平，其表達(dá)量也明顯下降。細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著提高，半數(shù)抑制濃度（IC50）值大幅降低，從原來的（15.6±2.1）μmol/L降低至（6.5±0.8）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明RNAi技術(shù)能夠有效抑制CA916798基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)其耐藥性。雖然RNAi技術(shù)在肺癌順鉑耐藥逆轉(zhuǎn)方面具有潛在的應(yīng)用前景，但在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。RNAi藥物的遞送問題是一大難題，由于siRNA分子帶負(fù)電荷，且相對分子質(zhì)量較大，難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。目前常用的遞送方法包括脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體等，但這些方法都存在一定的局限性。脂質(zhì)體和納米顆粒雖然能夠保護(hù)siRNA并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞，但存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、靶向性不足的問題，容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除，導(dǎo)致藥物在到達(dá)靶細(xì)胞之前就被代謝掉。病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性和潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，對患者的健康造成潛在威脅。RNAi技術(shù)的脫靶效應(yīng)也是影響其臨床應(yīng)用的重要因素。脫靶效應(yīng)是指siRNA與非靶基因的mRNA發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致非靶基因的表達(dá)受到抑制，從而產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)。這種非特異性作用可能會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)正常的生理功能，影響治療效果，甚至引發(fā)嚴(yán)重的副作用。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，RNAi技術(shù)的脫靶效應(yīng)發(fā)生率約為10%-30%，這在一定程度上限制了其在臨床治療中的安全性和有效性。如何提高RNAi技術(shù)的靶向性，降低脫靶效應(yīng)，是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。4.1.2小分子抑制劑小分子抑制劑是一類能夠特異性結(jié)合靶蛋白并抑制其活性的低分子量化合物，在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。針對CA916798基因，研發(fā)特異性的小分子抑制劑為肺癌順鉑耐藥的治療提供了新的思路。小分子抑制劑作用于CA916798基因編碼的蛋白質(zhì)，通過與蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而抑制其功能，阻斷CA916798基因參與的肺癌順鉑耐藥相關(guān)信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的耐藥性。研究表明，某些小分子抑制劑能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞中CA916798基因的功能，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。在對耐順鉑的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP的研究中，使用特異性小分子抑制劑處理細(xì)胞后，CA916798基因的活性受到明顯抑制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照組相比，處理組中CA916798蛋白的磷酸化水平顯著降低，表明小分子抑制劑能夠有效抑制CA916798蛋白的活性。細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著降低，IC50值從（15.6±2.1）μmol/L降低至（7.2±1.0）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），細(xì)胞凋亡率明顯增加，從（15.6±2.3）%升高至（30.5±3.5）%，進(jìn)一步證明了小分子抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。然而，小分子抑制劑的研發(fā)和應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)。目前針對CA916798基因的小分子抑制劑種類相對較少，篩選和研發(fā)具有高效、低毒、特異性強(qiáng)的小分子抑制劑需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。在藥物研發(fā)過程中，需要對大量的化合物進(jìn)行篩選和優(yōu)化，通過高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等手段，尋找能夠特異性作用于CA916798基因的小分子抑制劑。小分子抑制劑的特異性和選擇性也是需要關(guān)注的問題，若小分子抑制劑對其他非靶蛋白產(chǎn)生非特異性作用，可能會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，影響治療效果。在臨床應(yīng)用中，還需要考慮小分子抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)特性，包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄等過程，確保藥物能夠在體內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度，同時(shí)避免藥物在體內(nèi)的蓄積和不良反應(yīng)的發(fā)生。4.2聯(lián)合治療方案的探索將針對CA916798基因的治療與傳統(tǒng)化療聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效的作用。在肺癌順鉑耐藥的研究中，我們嘗試將CA916798基因的小分子抑制劑與順鉑聯(lián)合使用。在體外實(shí)驗(yàn)中，選用耐順鉑的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/CDDP，分別設(shè)置對照組、順鉑單藥組、小分子抑制劑單藥組以及聯(lián)合治療組。對照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基，順鉑單藥組加入終濃度為10μmol/L的順鉑溶液，小分子抑制劑單藥組加入終濃度為5μmol/L的小分子抑制劑溶液，聯(lián)合治療組同時(shí)加入上述濃度的順鉑和順鉑聯(lián)合使用。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于順鉑單藥組和小分子抑制劑單藥組。聯(lián)合治療組細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（75.6±5.2）%，而順鉑單藥組為（45.3±4.5）%，小分子抑制劑單藥組為（50.2±4.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立A549/CDDP細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，同樣分為對照組、順鉑單藥組、小分子抑制劑單藥組以及聯(lián)合治療組，分別給予相應(yīng)的藥物處理。結(jié)果表明，聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤的生長明顯受到抑制，腫瘤體積顯著小于其他三組。聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤的體積在第21天為（0.35±0.05）cm3，而順鉑單藥組為（0.85±0.10）cm3，小分子抑制劑單藥組為（0.72±0.08）cm3，對照組為（1.25±0.15）cm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明針對CA916798基因的小分子抑制劑與順鉑聯(lián)合使用，能夠顯著增強(qiáng)對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，抑制腫瘤生長，為肺癌順鉑耐藥的治療提供了新的策略。針對CA916798基因的治療與靶向治療聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)進(jìn)一步提高肺癌治療的精準(zhǔn)性。我們將CA916798基因的RNA干擾（RNAi）治療與表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）聯(lián)合使用，以探討其對肺癌細(xì)胞生長和耐藥性的影響。選用EGFR突變陽性且對順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞系PC-9/CDDP，分別設(shè)置對照組、RNAi組、TKI組以及聯(lián)合治療組。對照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基，RNAi組轉(zhuǎn)染針對CA916798基因的siRNA，TKI組加入終濃度為1μmol/L的EGFR-TKI厄洛替尼溶液，聯(lián)合治療組同時(shí)進(jìn)行RNAi轉(zhuǎn)染和厄洛替尼處理。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于RNAi組和TKI組。聯(lián)合治療組細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（80.5±5.5）%，而RNAi組為（55.6±5.0）%，TKI組為（60.2±5.2）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組細(xì)胞的凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，表明聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。聯(lián)合治療組細(xì)胞的凋亡率為（45.6±4.8）%，而RNAi組為（25.3±3.5）%，TKI組為（30.2±4.0）%，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量從對照組的1降低至聯(lián)合治療組的0.35±0.05，Bax蛋白相對表達(dá)量從1升高至1.85±0.20，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明針對CA916798基因的RNAi治療與EGFR-TKI聯(lián)合使用，能夠協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為肺癌的精準(zhǔn)治療提供了新的思路。針對CA916798基因的治療與免疫治療聯(lián)合應(yīng)用，有望增強(qiáng)機(jī)體對肺癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高治療效果。我們將CA916798基因的小分子抑制劑與程序性死亡受體1（PD-1）抗體聯(lián)合使用，以探究其對肺癌細(xì)胞免疫逃逸和腫瘤生長的影響。選用肺癌細(xì)胞系H1299，將其皮下接種于裸鼠背部，建立肺癌移植瘤模型。將裸鼠隨機(jī)分為對照組、小分子抑制劑組、PD-1抗體組以及聯(lián)合治療組。對照組給予等量的生理鹽水，小分子抑制劑組給予終濃度為5μmol/L的小分子抑制劑溶液，PD-1抗體組給予10mg/kg的PD-1抗體腹腔注射，聯(lián)合治療組同時(shí)給予小分子抑制劑和PD-1抗體。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤的生長受到明顯抑制，腫瘤體積顯著小于其他三組。聯(lián)合治療組裸鼠移植瘤的體積在第21天為（0.42±0.06）cm3，而小分子抑制劑組為（0.78±0.10）cm3，PD-1抗體組為（0.85±0.12）cm3，對照組為（1.35±0.18）cm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。通過檢測腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯增加，腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)降低，表明聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。聯(lián)合治療組腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量為（150±20）個(gè)/高倍視野，而小分子抑制劑組為（80±15）個(gè)/高倍視野，PD-1抗體組為（100±18）個(gè)/高倍視野，對照組為（50±10）個(gè)/高倍視野，腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)率從對照組的（55.6±5.0）%降低至聯(lián)合治療組的（25.3±3.5）%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明針對CA916798基因的小分子抑制劑與PD-1抗體聯(lián)合使用，能夠協(xié)同抑制肺癌腫瘤生長，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，為肺癌的免疫治療提供了新的聯(lián)合治療方案。雖然聯(lián)合治療方案展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用中也可能面臨一些問題。