微專題15RT－PCR、反向PCR與PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)考情速覽熱點(diǎn)考情RT－RCR、實(shí)時(shí)熒光定量、PCR與反向PCR2022·全國(guó)乙卷，38；2022·江蘇卷，24；2020·江蘇卷，33；2020·山東卷，25PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)2023·遼寧卷，25；2021·天津卷，16熱點(diǎn)1RT－PCR與反向PCR(2024·黑吉遼卷，25)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T－DNA轉(zhuǎn)移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對(duì)密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲害能力，進(jìn)行如下操作。回答下列問題。注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是____________________________________________________________________________________。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是______________________________________________________________________________________。(2)本操作中獲取目的基因的方法是________和________。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是________________________，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是___________________________________________________________________________________________。(4)根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用________基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是________和________。(6)本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是________(單選)。A.通過含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞B.將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)C.將1～1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白答案(1)水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA(2)PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成(3)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率(4)HygBR(5)F3R2(6)D解析(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離。提取過程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中獲取目的基因的方法是人工合成和PCR技術(shù)擴(kuò)增。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率。(4)結(jié)合基因表達(dá)載體的示意圖，根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用HygBR基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是F3和R2。(6)D項(xiàng)所述內(nèi)容制造了新的蛋白質(zhì)，屬于蛋白質(zhì)工程。情境素材反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過程如下圖所示。(1)要擴(kuò)增未知序列，應(yīng)選擇哪兩種引物？提示引物1和引物4。(2)上述PCR產(chǎn)物是環(huán)狀DNA分子還是鏈狀DNA分子？提示鏈狀DNA分子。(3)上述PCR過程中使用了哪些酶？提示限制酶、DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶。1.RT－PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴(kuò)增合成目的片段。命題要點(diǎn)提醒：由于RNA不穩(wěn)定，因此PCR不能直接擴(kuò)增RNA；需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.反向PCR：反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間的DNA片段。(1)原理①酶切：選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切；②連接：用DNA連接酶使靶序列環(huán)化連接；③擴(kuò)增：用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外的未知序列。(2)應(yīng)用通過反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，并可將僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長(zhǎng)的DNA探針。命題要點(diǎn)提醒：①選擇限制酶時(shí)，要保證其在已知序列內(nèi)部沒有限制酶切割位點(diǎn)；②選擇引物時(shí)，要選擇反向引物對(duì)(相對(duì)于已知序列)；若選擇的是相向引物對(duì)，則擴(kuò)增的是已知序列。[例1](2025·江蘇鹽城檢測(cè))常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩引物間的DNA區(qū)段，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)。反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.酶切階段，L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列B.PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸C.圖中引物應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)D.PCR擴(kuò)增時(shí)，每輪循環(huán)前應(yīng)加入限制酶將環(huán)狀DNA切割成線狀答案D解析在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列，不然會(huì)將已知序列L切斷，造成序列識(shí)別混亂，A正確；PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫使DNA變性、低溫復(fù)性(使DNA單鏈與引物結(jié)合)、中溫延伸，B正確；PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，為保證延伸的是已知序列兩側(cè)的未知序列，應(yīng)該選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)，C正確；PCR的擴(kuò)增只需要第一次循環(huán)前加入足夠的限制酶，并不需要每輪都加入，D錯(cuò)誤。[例2](2025·山東濱州高三模擬)某病毒的檢測(cè)可以采用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法，RT－PCR的具體過程如圖。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.過程①以mRNA為模板合成單鏈DNAB.過程②③擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行第n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上需要n個(gè)引物BC.該技術(shù)用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測(cè)，可提高檢測(cè)的靈敏度D.游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接答案B解析過程①是以mRNA形成單鏈DNA的過程，表示逆轉(zhuǎn)錄，A正確；過程②③擬對(duì)單鏈cDNA進(jìn)行第n次循環(huán)的擴(kuò)增，根據(jù)DNA分子半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，該過程理論上至少需要2n－1個(gè)引物B，B錯(cuò)誤；利用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR技術(shù)對(duì)某些微量RNA病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可提高檢測(cè)的靈敏度，是因?yàn)樵黾恿舜郎y(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測(cè)，C正確；游離的脫氧核苷酸只能從引物的3′端開始連接，D正確。熱點(diǎn)2PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)(2024·新課標(biāo)卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(diǎn)(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是________。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時(shí)，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點(diǎn)之間，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)可以形成的堿基對(duì)有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗(yàn)證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是________；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是___________________________________________________________________。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點(diǎn)是________________________________________________________________________________________________________________________(答出2點(diǎn)即可)。答案(1)磷酸二酯鍵保證N基因啟動(dòng)子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(dá)(2)C—G、U—A、A—T(3)菌株B2的基因組DNA無(wú)PCR產(chǎn)物(4)無(wú)空氣污染；更安全，無(wú)火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等解析(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯鍵。由題述可知，該過程是將重組質(zhì)粒特定位點(diǎn)，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替換區(qū)(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)，再接入B1基因組中，得到B2，因此在M1和M2之間，需要保證N基因完整性，同時(shí)需要保證N基因能夠正常表達(dá)，因此需要把M1接入啟動(dòng)子之前，M2接入終止子之后。(2)根據(jù)所給信息，向?qū)NA需要與對(duì)應(yīng)DNA進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合期間，RNA的堿基會(huì)和DNA的堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則配對(duì)方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要驗(yàn)證是否插入重組后的片段甲，因此所用模板為菌株B2的基因組DNA，如果有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中含有N基因，如果沒有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中不含N基因。因?yàn)槠渭妆惶鎿Q，因此在重組片段甲(M1＋啟動(dòng)子＋N基因＋終止子＋M2)中，沒有引物P4的結(jié)合位置，因此使用引物P3、P4進(jìn)行PCR時(shí)，無(wú)法獲得PCR產(chǎn)物。(4)秸稈焚燒嚴(yán)重污染環(huán)境，且有很大的火災(zāi)隱患，與此同時(shí)，焚燒對(duì)于有機(jī)物中的能量是極大的浪費(fèi)，可以從上述角度進(jìn)行論述。例如：無(wú)空氣污染；更安全，無(wú)火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等。情境素材一在基因工程實(shí)踐中，常用重疊延伸PCR技術(shù)。(1)操作中哪些引物應(yīng)含有擬突變位點(diǎn)？提示引物2和引物3。(2)進(jìn)行PCR1和PCR2時(shí)，應(yīng)分別選擇哪些引物？提示進(jìn)行PCR1時(shí)需選擇引物1和引物2，進(jìn)行PCR2時(shí)需選擇引物3和引物4。(3)為獲得大量目的基因序列，進(jìn)行PCR3時(shí)應(yīng)選擇哪兩種引物？提示引物1和引物4。情境素材二瑞典科學(xué)家斯萬(wàn)特·帕博憑借對(duì)已滅絕古人類基因組和人類進(jìn)化的發(fā)現(xiàn)榮獲2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。他在研究過程中使用了大引物PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變。基因定點(diǎn)突變的目的是通過定向改變基因內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基來(lái)改變多肽鏈上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。大引物PCR定點(diǎn)突變常用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過程如圖所示。(1)第一輪PCR所用的引物有哪些？提示誘變引物和側(cè)翼引物。(2)第二輪PCR所用的引物除了側(cè)翼引物外，還有大引物。該大引物是第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的①鏈還是②鏈？提示②鏈。(3)與常規(guī)引物相比，大引物有何特點(diǎn)？提示大引物特異性高。1.利用引物中引入突變位點(diǎn)——在目的基因一端引入突變位點(diǎn)(1)兩個(gè)引物均從內(nèi)部擴(kuò)增，在某一引物引入突變位點(diǎn)提醒若兩個(gè)引物均從內(nèi)部擴(kuò)增，其中一個(gè)引物引入突變位點(diǎn)，則至少第3次擴(kuò)增后才可獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA片段，第n輪擴(kuò)增后可獲得2n－2n個(gè)突變DNA。(2)一個(gè)引物從內(nèi)部擴(kuò)增，另一個(gè)引物從側(cè)翼擴(kuò)增，在某一引物引入突變位點(diǎn)提醒若一個(gè)引物從內(nèi)部擴(kuò)增，另一個(gè)引物從側(cè)翼擴(kuò)增，其中一個(gè)引物引入突變位點(diǎn)，則至少第2次擴(kuò)增可獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA片段，第n輪擴(kuò)增后可獲得2n－(n＋1)個(gè)突變DNA。2.利用重疊延伸PCR技術(shù)引入突變位點(diǎn)——在目的基因內(nèi)部引入突變位點(diǎn)重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點(diǎn)突變技術(shù)。如下圖所示，該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和引物3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點(diǎn))是可以互補(bǔ)的。因此，分別利用引物1和引物2，引物3和引物4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和引物3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過測(cè)序可檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。3.利用大引物PCR技術(shù)引入突變位點(diǎn)——在目的基因內(nèi)部引入突變位點(diǎn)大引物PCR需要用引物進(jìn)行兩次PCR，其操作步驟如下：①根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，得到兩個(gè)常規(guī)引物，分別為常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物；②根據(jù)突變堿基所處序列設(shè)計(jì)突變上游引物，突變位點(diǎn)位于突變引物序列的中間位置；③由突變上游引物與常規(guī)下游引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)得到下游大引物；④用得到的下游大引物和另一個(gè)常規(guī)上游引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到突變目的基因序列。1.(2025·廣東佛山質(zhì)檢)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)是一種基因工程技術(shù)，它可以通過人工合成的引物，使目標(biāo)DNA序列發(fā)生特定的突變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精確編輯。PCR定點(diǎn)突變技術(shù)的過程如圖所示(圖中對(duì)應(yīng)的字母為引物，黑點(diǎn)為定點(diǎn)誘變的位點(diǎn))。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1B.獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且1次循環(huán)即得片段2C.圖中兩種引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)D.圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)答案B解析根據(jù)圖示過程可知，獲得片段1所需要的引物為F和R_m，且2次循環(huán)即得片段1，A正確；獲得片段2所需要的引物為R和F_m，且2次循環(huán)即得片段2，B錯(cuò)誤；結(jié)合題圖分析，引物F_m和R_m之間，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，C正確；圖中PCR擴(kuò)增所需要的引物F和R最好不配對(duì)，以防引物發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而不能與模板結(jié)合，D正確。2.(2024·山東聊城高三模擬)α－環(huán)糊精是食品、醫(yī)藥等常用原料。α－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cgt)生產(chǎn)α－、β－和γ－環(huán)糊精的混合物，分離純化十分不便。cgt在芽孢桿菌中的產(chǎn)量較低，誘變效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶與底物作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，江南大學(xué)一實(shí)驗(yàn)室將它們分別替換為賴氨酸和精氨酸后，形成的重組cgt催化特異性提高了27倍。圖1(1)蛋白質(zhì)工程的第一步通常是________。重疊PCR是常用的DNA定點(diǎn)突變技術(shù)，其原理如圖1所示。與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR不需要用到________酶。要完成兩處位點(diǎn)的突變，至少要設(shè)計(jì)________種引物。(2)如圖2是該酶編碼鏈的部分序列，請(qǐng)你設(shè)計(jì)替換372位天冬氨酸(密碼子：GAU、GAC)為賴氨酸(密碼子：AAA、AAG)的引物FP2和RP1：________(只寫372位對(duì)應(yīng)的3個(gè)堿基)。5′－TAGACCGGCGAT,370GGCGACCCCAACAAC,375CGG－3′FP2：5′－TAGACCGGCGATGGC________CCCAACAACCGG－3′RP1：5′－CCGGTTGTTGGG________GCCATCGCCGGTCTA－3′圖2(3)用大腸桿菌大量生產(chǎn)重組cgt需要解決酶的分泌問題。重組cgt基因位于雙突變載體(簡(jiǎn)稱T載體)上，研究人員將重組cgt基因與pET－20b(＋)載體(簡(jiǎn)稱p載體)上的pelB信號(hào)肽序列連接，構(gòu)成重組載體cgt－p，該過程如圖3所示。應(yīng)選用________對(duì)T載體酶切處理，用________對(duì)p載體進(jìn)行酶切處理，并用________酶構(gòu)建重組載體cgt－p，導(dǎo)入目的工程菌。培養(yǎng)基中除基本營(yíng)養(yǎng)外，還需加入________完成篩選。圖3答案(1)確定預(yù)期的蛋白質(zhì)功能解旋6(2)AAA和TTT(或AAG和CTT)(不能顛倒順序)(3)XmaⅠ、BamHⅠXmaⅠ、BclⅠDNA連接氨芐青霉素解析(1)蛋白質(zhì)工程的第一步通常是確定預(yù)期的蛋白質(zhì)功能。與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR不需要用到解旋酶。由圖1可知，完成一處突變需要2種通用引物和2種突變引物，如果要完成兩種突變，則需要2種通用引物和4種突變引物，至少要設(shè)計(jì)6種引物。(2)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，替換372位天冬氨酸為賴氨酸的引物FP2和RP1的372位對(duì)應(yīng)的3個(gè)堿基為AAA和TTT(或AAG和CTT)(不能顛倒順序)。(3)應(yīng)選用XmaⅠ、BamHⅠ對(duì)T載體酶切處理，這兩種限制酶不會(huì)破壞重組cgt的完整性，由重組載體cgt－p上的順序可知，需要保持pelB的完整性，所以只能選用BclⅠ切一端，XmaⅠ和SmaⅠ的識(shí)別序列相同，為了保證重組cgt的反向連接，用XmaⅠ、BclⅠ對(duì)p載體進(jìn)行酶切處理，并用DNA連接酶構(gòu)建重組載體cgt－p，導(dǎo)入目的工程菌。培養(yǎng)基中除基本營(yíng)養(yǎng)外，還需加入氨芐青霉素完成篩選。專題練15RT－PCR、反向PCR與PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)(時(shí)間：40分鐘)1.(2025·山東青島模擬)將草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)?；卮鹣铝袉栴}：(1)草甘膦抗性基因一條鏈的兩端序列如圖1所示，采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增草甘膦抗性基因時(shí)應(yīng)選用的2種引物序列是____________________________(標(biāo)出5′端和3′端)。若初始加入1個(gè)草甘膦抗性基因，則歷經(jīng)4次PCR循環(huán)需要消耗引物數(shù)量為________個(gè)。(2)圖2中步驟③將農(nóng)桿菌與甘藍(lán)愈傷組織共培養(yǎng)后，在步驟④的培養(yǎng)基中添加________以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株。添加此抗生素而不選用添加另一種抗生素篩選的原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)若要獲得抗除草劑能力更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株，可以用草甘膦抗性基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到________工程。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株是否產(chǎn)生抗除草劑蛋白，所用的方法是________________。(4)為確定步驟③中T－DNA(堿基序列已知)的插入位置，往往需要用反向PCR技術(shù)測(cè)定插入部位的堿基序列，其原理如圖3：①不直接在圖3a中的DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是___________________________________________________________________。②PCR測(cè)序與反向PCR________(填“可以”或“不可以”)選用相同的一對(duì)引物，原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′30(2)潮霉素由圖可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段，所以潮霉素抗性基因可隨T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞中，并且隨其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上，從而使含目的基因的甘藍(lán)植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選含目的基因的甘藍(lán)植株(3)蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交(4)①T－DNA兩端序列未知，無(wú)法設(shè)計(jì)引物②可以PCR測(cè)序與反向PCR擴(kuò)增的片段相同，可選用相同的一對(duì)引物解析(1)圖1所示堿基序列磷酸端為5′端，羥基端為3′端，在進(jìn)行PCR操作時(shí)，引物應(yīng)分別從基因兩條鏈的3′端根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，根據(jù)圖中兩端序列可推知選用的2種引物序列是5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′。若初始加入1個(gè)草甘膦抗性基因，則歷經(jīng)4次PCR循環(huán)可形成16個(gè)DNA分子，其中原有2條母鏈的沒有引物，其余子鏈都有引物，故需要消耗引物數(shù)量為15×2＝30(個(gè))。(2)圖2中步驟③將農(nóng)桿菌與甘藍(lán)愈傷組織共培養(yǎng)后，在步驟④的培養(yǎng)基中添加潮霉素以便篩選出含目的基因的甘藍(lán)植株。由圖可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可隨T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且隨其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上，從而使含目的基因的甘藍(lán)植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選含目的基因的甘藍(lán)植株。(3)對(duì)草甘膦抗性基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到蛋白質(zhì)工程。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株是否產(chǎn)生抗除草劑蛋白，可以用抗原—抗體雜交的方法。(4)①不直接在圖3a中的DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是T－DNA兩端序列未知，無(wú)法設(shè)計(jì)引物。②由于PCR測(cè)序與反向PCR擴(kuò)增的片段相同，所以PCR測(cè)序與反向PCR可選用相同的一對(duì)引物。2.(2025·山西臨汾質(zhì)檢)沿海灘涂土壤鹽堿化程度高，作物產(chǎn)量低。實(shí)驗(yàn)人員將植物乙中的耐鹽堿基因a導(dǎo)入作物甲，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿的作物甲。實(shí)驗(yàn)人員通過PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物甲中的基因a進(jìn)行檢測(cè)，過程如圖1所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)實(shí)驗(yàn)人員提取轉(zhuǎn)基因作物甲的總DNA作為PCR擴(kuò)增的______，PCR擴(kuò)增所依據(jù)的原理是____________________________________________________________________________________________________________________________。(2)PCR擴(kuò)增時(shí)除要加入耐高溫的DNA聚合酶外，還需要引物。設(shè)計(jì)圖1中引物1和引物2的核苷酸序列時(shí)需要注意的事項(xiàng)有________________________________________________________________________________(答出1點(diǎn)即可)。(3)實(shí)驗(yàn)人員用引物1和引物2分別對(duì)植物乙(P1)，轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)和轉(zhuǎn)基因作物甲(P3)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。耐鹽堿基因a的長(zhǎng)度介于____________bp之間，轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)除含有耐鹽堿基因a的條帶外，還含有另外一條帶，推測(cè)該條帶出現(xiàn)的原因可能是______________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1點(diǎn)即可)。(4)常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩引物間的DNA片段，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)，反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖3所示。PCR擴(kuò)增時(shí)選用的一對(duì)引物是________________，從a到b的過程中是否需要使用限制酶將PCR產(chǎn)物剪切成鏈狀？________，理由是_________________________。答案(1)模板DNA半保留復(fù)制(2)引物1和引物2中的核苷酸序列能夠與耐鹽堿基因a母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、引物1和引物2中的核苷酸序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)、引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)、引物片段不能過短、引物片段不宜過長(zhǎng)(3)1000至1200轉(zhuǎn)基因作物甲基因組中存在其他能與引物1和引物2進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的DNA序列(4)引物3和引物4不需要可能會(huì)破壞已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列解析(1)進(jìn)行擴(kuò)增PCR時(shí)需要模板，可提取轉(zhuǎn)基因作物甲的總DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。(2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增的引物時(shí)，需要有一段已知的目的基因的脫氧核苷酸序列，使設(shè)計(jì)的引物能與目的基因堿基互補(bǔ)配對(duì)。此外，兩個(gè)引物之間以及引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，以免引物與引物結(jié)合影響擴(kuò)增，故設(shè)計(jì)圖1中引物1和引物2的核苷酸序列時(shí)需要注意的事項(xiàng)有引物1和引物2中的核苷酸序列能夠與耐鹽堿基因a母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、引物1和引物2中的核苷酸序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)、引物內(nèi)部的堿基序列不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)、引物片段不能過短、引物片段不宜過長(zhǎng)。(3)根據(jù)題意可知，實(shí)驗(yàn)人員將植物乙中的耐鹽堿基因a導(dǎo)入作物甲中，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽堿的作物甲，因此植物乙(P1)和轉(zhuǎn)基因作物甲(P2)中都含有耐鹽堿基因a。由圖2可知，耐鹽堿基因a的長(zhǎng)度介于1000bp至1200bp之間。P2組(轉(zhuǎn)基因作物甲)除含有耐鹽堿基因a的條帶外，還含有另外一條帶，由于這兩條條帶都是用引物1和引物2進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的，表明轉(zhuǎn)基因作物甲基因組中存在其他能與引物1和引物2進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的DNA序列。(4)PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，為保證延伸的是已知序列兩側(cè)的未知序列，應(yīng)該選擇引物3和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)。在反向PCR技術(shù)中，環(huán)狀DNA分子的形成是為了允許PCR擴(kuò)增跨越已知序列，進(jìn)入其兩側(cè)的未知區(qū)域，如果使用限制酶將PCR產(chǎn)物剪切成鏈狀，可能會(huì)破壞已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列。3.(2025·山東濟(jì)寧模擬)PCR技術(shù)的實(shí)用性和極強(qiáng)的生命力使其成為生物科學(xué)研究的一種重要方法，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。下面是兩個(gè)具體實(shí)驗(yàn)中的PCR技術(shù)應(yīng)用，請(qǐng)根據(jù)資料回答下列問題：(1)重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的方法。利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)誘變。它在需要誘變的位置合成兩個(gè)帶有變異基因堿基的互補(bǔ)引物，然后分別與引物a和引物d做PCR，這樣得到的兩個(gè)PCR引物產(chǎn)物都帶有變異基因，并且彼此重疊，再將重疊部位進(jìn)行重組PCR就能得到誘變PCR產(chǎn)物，如圖所示：①PCR擴(kuò)增DNA的過程中，引物a、b、c、d中，PCR1應(yīng)選擇圖1中引物________，大量擴(kuò)增突變產(chǎn)物AD則應(yīng)選擇引物________。②重疊延伸PCR通過________________________________________________實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行的原因是__________________________________________________________________________