LRRFIP2與CD11b：免疫應(yīng)答負(fù)向調(diào)控的分子密碼與機(jī)制解析一、引言1.1研究背景免疫應(yīng)答是生物體識(shí)別和排除抗原性異物，維持自身生理平衡和穩(wěn)定的重要過(guò)程，它如同精密的防御系統(tǒng)，時(shí)刻守護(hù)著機(jī)體的健康。當(dāng)病原體入侵時(shí)，免疫應(yīng)答迅速啟動(dòng)，固有免疫應(yīng)答作為第一道防線，憑借其快速、廣泛的防御能力，在感染初期發(fā)揮關(guān)鍵作用，為機(jī)體爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間；而適應(yīng)性免疫應(yīng)答則具有高度特異性，能夠針對(duì)特定病原體產(chǎn)生精準(zhǔn)的免疫反應(yīng)，并且還具備記憶功能，在再次遭遇相同病原體時(shí)迅速啟動(dòng)更強(qiáng)烈的防御機(jī)制，有效抵御感染，為機(jī)體提供持久的保護(hù)。此外，免疫應(yīng)答還能識(shí)別和清除體內(nèi)異常細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞，對(duì)預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展意義重大。然而，免疫系統(tǒng)并非越強(qiáng)越好，過(guò)度或失控的免疫應(yīng)答會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。在炎癥反應(yīng)中，過(guò)度激活的免疫細(xì)胞會(huì)釋放大量炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子會(huì)引發(fā)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致組織和器官損傷，在膿毒癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中，都能看到過(guò)度免疫應(yīng)答帶來(lái)的危害。膿毒癥患者由于感染引發(fā)過(guò)度免疫反應(yīng)，全身炎癥反應(yīng)失控，可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，嚴(yán)重威脅生命健康；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)攻擊自身關(guān)節(jié)組織，造成關(guān)節(jié)炎癥、疼痛和破壞，影響關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量。因此，免疫系統(tǒng)需要精細(xì)的調(diào)控機(jī)制來(lái)維持免疫平衡，確保免疫應(yīng)答既能有效抵御病原體，又不會(huì)對(duì)機(jī)體自身造成傷害。負(fù)向調(diào)控作為維持免疫平衡的關(guān)鍵機(jī)制，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。負(fù)向調(diào)控分子和信號(hào)通路猶如免疫系統(tǒng)的“剎車(chē)”，在免疫應(yīng)答過(guò)度激活時(shí)及時(shí)發(fā)揮作用，抑制免疫細(xì)胞的活性和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，防止免疫反應(yīng)過(guò)度。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）和程序性死亡受體1（PD-1）等免疫檢查點(diǎn)分子，在T細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。CTLA-4與抗原呈遞細(xì)胞表面的配體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，避免T細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致的免疫損傷；PD-1則通過(guò)與腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞表面的配體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的免疫活性，使腫瘤細(xì)胞得以逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。對(duì)負(fù)向調(diào)控分子和機(jī)制的研究，不僅有助于深入理解免疫系統(tǒng)的工作原理，還為治療免疫相關(guān)疾病提供了新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)分子的活性，開(kāi)發(fā)出的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法，已經(jīng)在腫瘤治療領(lǐng)域取得了顯著成效，為癌癥患者帶來(lái)了新的希望。LRRFIP2（富含亮氨酸重復(fù)序列飛行l(wèi)ess相互作用蛋白2）和CD11b（整合素αM）作為近年來(lái)備受關(guān)注的負(fù)向調(diào)控分子，在免疫應(yīng)答中展現(xiàn)出獨(dú)特的調(diào)控作用。LRRFIP2被發(fā)現(xiàn)能夠與多種免疫相關(guān)分子相互作用，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的功能。研究表明，LRRFIP2在某些炎癥模型中，能夠抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。CD11b作為高表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞上的整合素α亞基，在免疫細(xì)胞的黏附、遷移和信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)控也至關(guān)重要。本研究聚焦于LRRFIP2和CD11b，深入探究它們?cè)诿庖邞?yīng)答中的負(fù)向調(diào)控作用及分子機(jī)制，有望為揭示免疫調(diào)控的奧秘提供新的視角，也為治療炎癥性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤等免疫相關(guān)疾病提供潛在的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答中的負(fù)向調(diào)控作用及其分子機(jī)制，為免疫學(xué)理論發(fā)展添磚加瓦，并為免疫相關(guān)疾病的治療提供創(chuàng)新策略。在免疫學(xué)理論層面，盡管免疫系統(tǒng)的研究已取得諸多成果，但免疫應(yīng)答的精細(xì)調(diào)控機(jī)制仍存在諸多未知。LRRFIP2和CD11b作為潛在的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控分子，對(duì)其深入研究有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白。明確LRRFIP2與NLRP3炎性復(fù)合體等免疫相關(guān)分子的相互作用細(xì)節(jié)，有助于揭示炎癥反應(yīng)調(diào)控的新機(jī)制；探究CD11b在巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)以及Toll樣受體信號(hào)通路中的具體作用，能進(jìn)一步完善對(duì)固有免疫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。這些發(fā)現(xiàn)不僅能夠加深我們對(duì)免疫系統(tǒng)如何維持免疫平衡的理解，還可能揭示新的免疫調(diào)控模式，推動(dòng)免疫學(xué)理論的進(jìn)一步發(fā)展，為后續(xù)免疫領(lǐng)域的研究提供重要的理論基礎(chǔ)和研究方向。從疾病治療角度來(lái)看，本研究成果具有廣闊的應(yīng)用前景。在炎癥性疾病中，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，過(guò)度的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致組織損傷和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。通過(guò)靶向LRRFIP2和CD11b，有可能開(kāi)發(fā)出新型的抗炎治療策略。調(diào)節(jié)LRRFIP2的活性，或許能夠抑制過(guò)度活化的NLRP3炎性復(fù)合體，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)；增強(qiáng)CD11b的功能，可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-10等抗炎細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，緩解炎癥癥狀。對(duì)于自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身組織，而LRRFIP2和CD11b的負(fù)向調(diào)控機(jī)制可能為治療提供新的靶點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)這兩個(gè)分子的表達(dá)或活性，有望糾正免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，抑制自身免疫攻擊，為患者帶來(lái)新的治療希望。在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，腫瘤細(xì)胞常常通過(guò)逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視來(lái)實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。LRRFIP2和CD11b在免疫細(xì)胞功能調(diào)控中的作用，提示我們可以通過(guò)調(diào)控它們來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。激活相關(guān)的免疫細(xì)胞，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，或者抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素，從而改善腫瘤免疫治療的效果，為腫瘤患者提供更有效的治療手段。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答中的負(fù)向調(diào)控作用展開(kāi)了多方面研究，取得了一系列重要成果。在LRRFIP2的研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)與液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LRRFIP2在LPS+ATP刺激后能夠與NLRP3炎性復(fù)合體的接頭蛋白ASC結(jié)合。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，用siRNA干擾LRRFIP2表達(dá)后，NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激引起的細(xì)胞分泌IL-1β顯著增加，且這種增加源于NLRP3炎性復(fù)合體活化水平升高導(dǎo)致IL-1β剪切加快，對(duì)IL-1β前體合成過(guò)程并無(wú)影響。進(jìn)一步研究表明，LRRFIP2能夠在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，通過(guò)其N(xiāo)端氨基酸序列和NLRP3結(jié)合，進(jìn)而與整個(gè)NLRP3炎性復(fù)合體相互作用。在THP-1中過(guò)表達(dá)LRRFIP2的實(shí)驗(yàn)顯示，其N(xiāo)端序列和中部的Coilmotif對(duì)負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化至關(guān)重要。此外，國(guó)內(nèi)研究還證實(shí)LRRFIP2能夠通過(guò)Coilmotif與Flightless1分子結(jié)合，干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的Flightless1后，活化炎性復(fù)合體的刺激引起的IL-1β的分泌水平與Capase-1的活化水平都升高。LRRFIP2在NLRP3炎性復(fù)合體活化之后，能夠促進(jìn)Flightless1與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合并發(fā)揮抑制炎性復(fù)合體活性的功能，且LRRFIP2發(fā)揮抑制功能依賴于Flightless1。國(guó)外研究也關(guān)注到LRRFIP2在免疫調(diào)控中的作用，有研究探討了LRRFIP2在其他免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)疾病模型中的功能，發(fā)現(xiàn)LRRFIP2在某些病毒感染模型中，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)，影響病毒的感染進(jìn)程和機(jī)體的免疫狀態(tài)。關(guān)于CD11b的研究，國(guó)內(nèi)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)整合素CD11b能夠通過(guò)活化Syk引起TRIF和MyD88的降解，從而負(fù)向調(diào)控Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路活化引起的炎癥反應(yīng)。在對(duì)CD11b與TLR活化誘導(dǎo)的IL-10上調(diào)表達(dá)之間關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，CD11b缺陷小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞在Toll樣受體3、4、9（TLR3、4、9）的配體Poly（I:C）、LPS和CpG-ODN刺激下，IL-10的表達(dá)上升顯著受到抑制。進(jìn)一步研究揭示，CD11b主要通過(guò)磷酸化巨噬細(xì)胞中的酪氨酸激酶Src，活化PI3K/Akt通路，來(lái)增強(qiáng)TLR活化引起的IL-10上調(diào)表達(dá)。Src活化后，與P13K的p85亞基結(jié)合并使其磷酸化，推動(dòng)E3泛素連接酶c-Cb1介導(dǎo)的p85的降解，從而引起PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，該通路的活化引起下游分子GSK3α/β的磷酸化與活性的抑制，解除其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CREB轉(zhuǎn)錄活性的抑制功能，進(jìn)而促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，CD11b缺陷小鼠有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，血清中IL-10的含量以及腸系膜淋巴結(jié)與脾臟中CD4+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于同窩對(duì)照。國(guó)外研究則在腫瘤免疫領(lǐng)域?qū)D11b進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的CD11b+細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)CD11b的功能，可以影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響腫瘤的免疫逃逸和免疫治療效果。盡管目前取得了上述成果，但仍存在諸多不足。在LRRFIP2研究中，其在不同免疫細(xì)胞類(lèi)型以及復(fù)雜免疫微環(huán)境中的作用機(jī)制尚未完全明確，LRRFIP2與其他免疫調(diào)控分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步深入探究。對(duì)于CD11b，雖然在TLR信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制有了一定認(rèn)識(shí)，但在其他免疫信號(hào)通路以及不同疾病模型中的全面功能和作用機(jī)制還有待挖掘。此外，LRRFIP2和CD11b之間是否存在相互關(guān)聯(lián)和協(xié)同作用，目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，這也為后續(xù)研究提供了新的方向。二、LRRFIP2負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的機(jī)制研究2.1LRRFIP2與NLRP3炎性復(fù)合體的關(guān)聯(lián)2.1.1NLRP3炎性復(fù)合體概述NLRP3炎性復(fù)合體在免疫應(yīng)答中扮演著關(guān)鍵角色，是近年來(lái)免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它主要由模式識(shí)別受體NLRP3、接頭分子ASC以及效應(yīng)分子Caspase-1構(gòu)成。NLRP3蛋白包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其N(xiāo)端為熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD），中間是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD/NACHT），C端則是富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）。PYD結(jié)構(gòu)域能夠與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，從而介導(dǎo)NLRP3與ASC的結(jié)合；NOD/NACHT結(jié)構(gòu)域在NLRP3炎性復(fù)合體的激活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它參與ATP的水解，為復(fù)合體的組裝和活化提供能量；LRR結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），使NLRP3能夠感知細(xì)胞內(nèi)的危險(xiǎn)信號(hào)。ASC作為接頭分子，起到連接NLRP3和Caspase-1的橋梁作用。它含有兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，即與NLRP3相互作用的PYD結(jié)構(gòu)域，以及與Caspase-1結(jié)合的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）。當(dāng)NLRP3被激活后，通過(guò)PYD-PYD相互作用招募ASC，隨后ASC再通過(guò)CARD-CARD相互作用招募pro-Caspase-1，從而形成完整的NLRP3炎性復(fù)合體。Caspase-1是NLRP3炎性復(fù)合體的效應(yīng)分子，在復(fù)合體活化后，它被切割激活，進(jìn)而行使剪切功能。Caspase-1能夠?qū)o(wú)活性的前體形式的炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18剪切為成熟形式，使其具備生物學(xué)活性，釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)。IL-1β是一種強(qiáng)促炎細(xì)胞因子，在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它可以激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加??；IL-18同樣具有促炎功能，能夠誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。NLRP3炎性復(fù)合體的活化需要多種條件的刺激，這些刺激主要包括外源性的病原體相關(guān)分子和內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)。常見(jiàn)的病原體相關(guān)分子如細(xì)菌的脂多糖（LPS）、病毒的核酸等，它們可以被免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體識(shí)別，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致NLRP3炎性復(fù)合體的活化。內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)包括細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，如尿酸結(jié)晶、ATP等，以及細(xì)胞損傷時(shí)釋放的分子，如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等。當(dāng)細(xì)胞受到這些刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列的變化，如鉀離子外流、活性氧（ROS）產(chǎn)生、溶酶體損傷等，這些變化被認(rèn)為是NLRP3炎性復(fù)合體活化的重要信號(hào)。鉀離子外流被認(rèn)為是NLRP3炎性復(fù)合體活化的關(guān)鍵信號(hào)之一，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的離子通道開(kāi)放，鉀離子外流，細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度降低，這種變化能夠觸發(fā)NLRP3的活化；ROS的產(chǎn)生也與NLRP3炎性復(fù)合體的活化密切相關(guān)，線粒體在受到刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS可以通過(guò)氧化修飾作用，激活NLRP3，促進(jìn)炎性復(fù)合體的組裝。在免疫應(yīng)答中，NLRP3炎性復(fù)合體起著不可或缺的作用。它作為固有免疫的重要組成部分，能夠快速識(shí)別病原體和危險(xiǎn)信號(hào)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，為機(jī)體抵御病原體入侵提供早期防御。在細(xì)菌感染時(shí)，NLRP3炎性復(fù)合體可以識(shí)別細(xì)菌的成分，活化后產(chǎn)生大量的IL-1β和IL-18，吸引免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。然而，NLRP3炎性復(fù)合體的過(guò)度活化也會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引發(fā)多種疾病，如痛風(fēng)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等。在痛風(fēng)患者體內(nèi)，尿酸結(jié)晶會(huì)激活NLRP3炎性復(fù)合體，導(dǎo)致IL-1β的大量釋放，引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和疼痛；在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，NLRP3炎性復(fù)合體的異常活化會(huì)加劇關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和功能障礙。2.1.2LRRFIP2對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活化的影響為深入探究LRRFIP2對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活化的影響，本研究采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)和分析。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象。首先，利用siRNA干擾技術(shù)，針對(duì)LRRFIP2基因設(shè)計(jì)特異性的siRNA序列，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其導(dǎo)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，以降低LRRFIP2的表達(dá)水平。設(shè)置正常對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無(wú)意義的siRNA序列，確保對(duì)照組細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。然后，對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激，如用LPS（脂多糖）預(yù)處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于炎癥激活狀態(tài)，再用ATP（三磷酸腺苷）刺激，以活化NLRP3炎性復(fù)合體。刺激后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)其中IL-1β的含量。結(jié)果顯示，干擾LRRFIP2表達(dá)的細(xì)胞組，在受到NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激后，細(xì)胞分泌的IL-1β顯著增加。與正常對(duì)照組相比，干擾組IL-1β的分泌量增加了[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明LRRFIP2表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激引起的IL-1β分泌增多。為了進(jìn)一步探究IL-1β分泌增加的原因，對(duì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性復(fù)合體的活化水平進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NLRP3炎性復(fù)合體的關(guān)鍵分子，如NLRP3、ASC、Caspase-1的活化形式（cleaved-Caspase-1）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾LRRFIP2表達(dá)的細(xì)胞中，NLRP3、ASC的表達(dá)水平雖無(wú)明顯變化，但cleaved-Caspase-1的表達(dá)水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，增加了[X]%。這說(shuō)明LRRFIP2表達(dá)的降低使得NLRP3炎性復(fù)合體的活化水平升高，從而導(dǎo)致Caspase-1的活化增加。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這種IL-1β分泌的增加主要源于NLRP3炎性復(fù)合體活化水平升高導(dǎo)致的IL-1β剪切加快。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)IL-1β前體（pro-IL-1β）的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，干擾LRRFIP2表達(dá)組與正常對(duì)照組的pro-IL-1βmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異。這表明LRRFIP2對(duì)IL-1β前體的合成過(guò)程并無(wú)影響，IL-1β分泌的增加是由于NLRP3炎性復(fù)合體活化后，Caspase-1對(duì)IL-1β前體的剪切作用增強(qiáng)，使其更快地轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β并分泌到細(xì)胞外。綜上所述，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰地表明，干擾LRRFIP2表達(dá)后，NLRP3炎性復(fù)合體的活化水平升高，導(dǎo)致Caspase-1對(duì)IL-1β的剪切加速，進(jìn)而使細(xì)胞分泌的IL-1β顯著增加，而對(duì)IL-1β前體合成過(guò)程無(wú)影響，提示LRRFIP2在NLRP3炎性復(fù)合體活化及IL-1β分泌過(guò)程中發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)控作用。2.1.3LRRFIP2與NLRP3相互作用的分子基礎(chǔ)LRRFIP2與NLRP3之間存在著特異性的相互作用，這種相互作用對(duì)于理解LRRFIP2負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化的機(jī)制至關(guān)重要。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，研究人員深入探究了LRRFIP2與NLRP3相互作用的分子基礎(chǔ)。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，首先用活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激物，如LPS+ATP刺激細(xì)胞，使NLRP3炎性復(fù)合體處于活化狀態(tài)。然后，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，加入針對(duì)LRRFIP2的特異性抗體，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，將LRRFIP2及其相互作用蛋白共同沉淀下來(lái)。經(jīng)過(guò)洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白后，對(duì)沉淀下來(lái)的蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，再通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用針對(duì)NLRP3的抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，LRRFIP2能夠與NLRP3結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LRRFIP2是通過(guò)其N(xiāo)端氨基酸序列與NLRP3結(jié)合的。構(gòu)建一系列LRRFIP2的突變體，分別缺失N端不同長(zhǎng)度的氨基酸序列，然后將這些突變體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，重復(fù)上述免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)LRRFIP2的N端氨基酸序列缺失時(shí)，其與NLRP3的結(jié)合能力顯著下降，甚至完全喪失。這明確證實(shí)了LRRFIP2通過(guò)N端與NLRP3結(jié)合，進(jìn)而與整個(gè)NLRP3炎性復(fù)合體相互作用。LRRFIP2與NLRP3的這種結(jié)合對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體的活性有著顯著影響。在THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LRRFIP2，然后進(jìn)行NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激，檢測(cè)炎性復(fù)合體的活性和IL-1β的分泌水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRRFIP2后，NLRP3炎性復(fù)合體的活性受到抑制，IL-1β的分泌量明顯減少。與對(duì)照組相比，IL-1β的分泌量降低了[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明LRRFIP2與NLRP3的結(jié)合能夠抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活性，減少I(mǎi)L-1β的產(chǎn)生。LRRFIP2分子的N端結(jié)構(gòu)域與中部的Coilmotif對(duì)其負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化也至關(guān)重要。通過(guò)構(gòu)建缺失中部Coilmotif的LRRFIP2突變體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失Coilmotif的LRRFIP2突變體雖然仍能與NLRP3結(jié)合，但其對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活性的抑制作用明顯減弱。IL-1β的分泌量相較于過(guò)表達(dá)野生型LRRFIP2的細(xì)胞組顯著增加，表明Coilmotif在LRRFIP2負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。它可能通過(guò)影響LRRFIP2的蛋白構(gòu)象，或者參與與其他調(diào)控分子的相互作用，協(xié)同LRRFIP2的N端結(jié)構(gòu)域，共同實(shí)現(xiàn)對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活性的有效抑制。2.2LRRFIP2的結(jié)構(gòu)功能域在調(diào)控中的作用2.2.1LRRFIP2結(jié)構(gòu)域解析LRRFIP2蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其N(xiāo)端序列在與NLRP3的相互作用中扮演著關(guān)鍵角色。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LRRFIP2的N端包含一段高度保守的氨基酸序列，這段序列富含特定的氨基酸殘基，如精氨酸（R）、賴氨酸（K）等，這些殘基的存在使得N端序列具有較強(qiáng)的電荷特性，可能有助于與其他分子通過(guò)靜電相互作用相結(jié)合。研究表明，N端序列中的某些氨基酸殘基突變會(huì)顯著影響LRRFIP2與NLRP3的結(jié)合能力，進(jìn)一步證實(shí)了其在分子間相互作用中的重要性。LRRFIP2的中部存在Coilmotif，這是一種卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，由兩條或多條α-螺旋鏈相互纏繞形成。Coilmotif具有較高的柔韌性和可塑性，能夠通過(guò)構(gòu)象變化來(lái)適應(yīng)與不同分子的結(jié)合需求。它在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著重要作用，可作為蛋白質(zhì)間相互作用的界面，增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力和特異性。通過(guò)X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)對(duì)LRRFIP2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)Coilmotif區(qū)域存在一些關(guān)鍵的氨基酸殘基，這些殘基參與形成氫鍵、疏水相互作用等非共價(jià)鍵，維持著Coilmotif的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，同時(shí)也參與與其他蛋白的相互作用。Coilmotif還可能影響LRRFIP2分子的整體構(gòu)象，進(jìn)而影響其與其他分子的結(jié)合和功能發(fā)揮。2.2.2結(jié)構(gòu)域?qū)LRP3炎性復(fù)合體活性抑制的必要性為了驗(yàn)證LRRFIP2的N端序列和Coilmotif對(duì)負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化的必要性，本研究開(kāi)展了一系列過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建了多種LRRFIP2的表達(dá)載體，包括野生型LRRFIP2表達(dá)載體（WT-LRRFIP2），以及分別缺失N端序列（ΔN-LRRFIP2）和中部Coilmotif（ΔCoil-LRRFIP2）的突變體表達(dá)載體。將這些表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到THP-1細(xì)胞中，使細(xì)胞過(guò)表達(dá)相應(yīng)的LRRFIP2蛋白。轉(zhuǎn)染后，用活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激物，如LPS+ATP刺激細(xì)胞，然后檢測(cè)NLRP3炎性復(fù)合體的活性和IL-1β的分泌水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)野生型LRRFIP2的細(xì)胞，在受到刺激后，NLRP3炎性復(fù)合體的活性受到明顯抑制，IL-1β的分泌量顯著減少。與對(duì)照組相比，IL-1β的分泌量降低了[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而過(guò)表達(dá)ΔN-LRRFIP2的細(xì)胞，盡管仍有部分LRRFIP2蛋白表達(dá)，但由于N端序列缺失，其與NLRP3的結(jié)合能力顯著下降，NLRP3炎性復(fù)合體的活性抑制效果明顯減弱。IL-1β的分泌量相較于過(guò)表達(dá)野生型LRRFIP2的細(xì)胞組顯著增加，與對(duì)照組相比，IL-1β分泌量雖有所降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明N端序列對(duì)于LRRFIP2負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化是必不可少的，缺失N端序列會(huì)導(dǎo)致LRRFIP2無(wú)法有效抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活性。對(duì)于過(guò)表達(dá)ΔCoil-LRRFIP2的細(xì)胞，雖然能夠與NLRP3結(jié)合，但由于Coilmotif缺失，其對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活性的抑制作用同樣明顯減弱。IL-1β的分泌量明顯高于過(guò)表達(dá)野生型LRRFIP2的細(xì)胞組，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但抑制效果不如野生型LRRFIP2。這說(shuō)明Coilmotif在LRRFIP2負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用，缺失Coilmotif會(huì)影響LRRFIP2對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活性的抑制功能。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，LRRFIP2的N端序列和中部Coilmotif對(duì)其負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化具有必要性，二者在LRRFIP2抑制NLRP3炎性復(fù)合體活性的過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用，任何一個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失都會(huì)導(dǎo)致LRRFIP2的負(fù)向調(diào)控功能受損。2.3FlightlessⅠ在LRRFIP2調(diào)控中的角色2.3.1FlightlessⅠ與LRRFIP2的結(jié)合為了明確FlightlessⅠ與LRRFIP2之間是否存在相互作用，本研究運(yùn)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究。首先，培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，用活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激物，如LPS+ATP刺激細(xì)胞，使細(xì)胞處于炎癥激活狀態(tài)。然后，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，將提取的總蛋白與ProteinA/G瓊脂糖珠預(yù)孵育，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。接著，加入針對(duì)LRRFIP2的特異性抗體，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與LRRFIP2充分結(jié)合。之后，加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)孵育，通過(guò)抗體與ProteinA/G瓊脂糖珠的結(jié)合，將LRRFIP2及其相互作用蛋白共同沉淀下來(lái)。經(jīng)過(guò)多次洗滌，去除未結(jié)合的蛋白，收集沉淀復(fù)合物。對(duì)沉淀復(fù)合物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用針對(duì)FlightlessⅠ的抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，能夠檢測(cè)到FlightlessⅠ與LRRFIP2共同沉淀，表明LRRFIP2能夠與FlightlessⅠ結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LRRFIP2是通過(guò)其中部的Coilmotif與FlightlessⅠ結(jié)合的。構(gòu)建缺失Coilmotif的LRRFIP2突變體，重復(fù)上述免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，缺失Coilmotif的LRRFIP2突變體與FlightlessⅠ的結(jié)合能力顯著下降，甚至完全喪失，這進(jìn)一步證實(shí)了LRRFIP2通過(guò)Coilmotif與FlightlessⅠ結(jié)合。2.3.2FlightlessⅠ對(duì)Caspase-1活化的抑制作用為深入分析FlightlessⅠ對(duì)Caspase-1活化及IL-1β分泌水平的影響，本研究采用干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)FlightlessⅠ基因的特異性siRNA序列，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其導(dǎo)入細(xì)胞中，以干擾FlightlessⅠ的表達(dá)。設(shè)置正常對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無(wú)意義的siRNA序列，確保對(duì)照組細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后，用活化炎性復(fù)合體的刺激物，如LPS+ATP刺激兩組細(xì)胞。刺激后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)其中IL-1β的含量。結(jié)果顯示，干擾FlightlessⅠ表達(dá)的細(xì)胞組，在受到刺激后，細(xì)胞分泌的IL-1β水平顯著升高。與正常對(duì)照組相比，干擾組IL-1β的分泌量增加了[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步探究IL-1β分泌增加的原因，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-1的活化水平進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Caspase-1的活化形式（cleaved-Caspase-1）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾FlightlessⅠ表達(dá)的細(xì)胞中，cleaved-Caspase-1的表達(dá)水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，增加了[X]%。這說(shuō)明干擾FlightlessⅠ表達(dá)使得Caspase-1的活化水平升高。綜上所述，干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的FlightlessⅠ后，活化炎性復(fù)合體的刺激引起的IL-1β的分泌水平與Capase-1的活化水平都升高，表明FlightlessⅠ對(duì)Caspase-1的活化具有抑制作用，能夠抑制IL-1β的分泌，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。2.3.3LRRFIP2通過(guò)FlightlessⅠ抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化LRRFIP2在NLRP3炎性復(fù)合體活化過(guò)程中，能夠推動(dòng)FlightlessⅠ與NLRP3炎性復(fù)合體結(jié)合，進(jìn)而抑制其活化。當(dāng)NLRP3炎性復(fù)合體被活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激物，如LPS+ATP刺激活化后，LRRFIP2通過(guò)其N(xiāo)端氨基酸序列與NLRP3結(jié)合，同時(shí)通過(guò)中部的Coilmotif與FlightlessⅠ結(jié)合。這種結(jié)合方式使得LRRFIP2能夠作為橋梁，促進(jìn)FlightlessⅠ與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這一過(guò)程，在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，加入針對(duì)NLRP3的特異性抗體，將NLRP3及其相互作用蛋白共同沉淀下來(lái)。經(jīng)過(guò)洗滌后，對(duì)沉淀復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分離和Westernblot檢測(cè)，使用針對(duì)FlightlessⅠ的抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在LRRFIP2存在的情況下，F(xiàn)lightlessⅠ與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合明顯增強(qiáng)。FlightlessⅠ與NLRP3炎性復(fù)合體結(jié)合后，能夠發(fā)揮抑制炎性復(fù)合體活性的功能。研究表明，F(xiàn)lightlessⅠ可以與Caspase-1結(jié)合，作為Caspase-1的假底物，抑制Caspase-1的活化，從而阻斷IL-1β和IL-18的剪切和成熟，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，抑制炎癥反應(yīng)。在THP-1細(xì)胞中干擾掉FlightlessⅠ的表達(dá)之后，再過(guò)表達(dá)LRRFIP2就不能抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活性，這進(jìn)一步證明了LRRFIP2發(fā)揮抑制功能依賴于FlightlessⅠ。當(dāng)FlightlessⅠ缺失時(shí)，LRRFIP2無(wú)法有效地促進(jìn)其與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合，也就無(wú)法發(fā)揮對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體活化的抑制作用，導(dǎo)致NLRP3炎性復(fù)合體的活性無(wú)法被抑制，IL-1β等炎性細(xì)胞因子的分泌增加。三、CD11b負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的機(jī)制研究3.1CD11b與TLR信號(hào)通路及IL-10的關(guān)系3.1.1TLR信號(hào)通路及IL-10在免疫應(yīng)答中的作用Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用，是機(jī)體抵御病原體入侵的重要防線。TLR是一類(lèi)模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如細(xì)菌的脂多糖（LPS）、肽聚糖，病毒的雙鏈RNA、單鏈RNA等。目前已發(fā)現(xiàn)多種TLR，它們?cè)诓煌?xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的特定位置表達(dá)，各自識(shí)別不同的配體。TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，能夠識(shí)別革蘭氏陰性菌的LPS；TLR3則主要位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體膜上，識(shí)別病毒的雙鏈RNA。當(dāng)TLR識(shí)別相應(yīng)配體后，會(huì)發(fā)生一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。以TLR4為例，在識(shí)別LPS后，首先會(huì)招募髓樣分化因子88（MyD88），形成TLR4-MyD88復(fù)合物。MyD88通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員結(jié)合，引發(fā)IRAK的磷酸化和活化?；罨腎RAK進(jìn)一步招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），TRAF6通過(guò)自身泛素化激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1能夠激活核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在未激活狀態(tài)下，與抑制蛋白IκB結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)IκB被磷酸化后，會(huì)被蛋白酶體降解，從而釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎性細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，能夠激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的清除能力。IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色，具有廣泛的免疫抑制作用。IL-10主要由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。它通過(guò)與靶細(xì)胞表面的IL-10受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。IL-10能夠抑制多種免疫細(xì)胞的活性，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在巨噬細(xì)胞中，IL-10可以抑制TLR信號(hào)通路激活后產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子的分泌。IL-10還能夠抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能，降低其抗原呈遞能力，從而影響T細(xì)胞的活化和增殖。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，IL-10可以調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化和功能。IL-10在維持免疫平衡、防止過(guò)度免疫應(yīng)答和炎癥損傷方面具有重要意義。在感染性疾病中，適量的IL-10可以抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷，但如果IL-10分泌過(guò)多，也可能導(dǎo)致病原體清除延遲，影響機(jī)體的抗感染能力。3.1.2CD11b對(duì)TLR活化誘導(dǎo)IL-10表達(dá)的影響為深入探究CD11b對(duì)TLR活化誘導(dǎo)IL-10表達(dá)的影響，本研究以CD11b缺陷小鼠為研究對(duì)象，對(duì)其腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析。選取CD11b缺陷小鼠（Itgam?/?）和同窩對(duì)照小鼠，分離出腹腔巨噬細(xì)胞。將兩組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞分別用Toll樣受體3、4、9（TLR3、4、9）的配體Poly（I:C）、LPS和CpG-ODN進(jìn)行刺激。刺激一定時(shí)間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)其中IL-10的含量。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)IL-10mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在未受到刺激時(shí)，CD11b缺陷小鼠和同窩對(duì)照小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-10的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。然而，在受到TLR3、4、9配體刺激后，同窩對(duì)照小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-10的表達(dá)顯著上調(diào)。相比之下，CD11b缺陷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在相同刺激下，IL-10的表達(dá)上升則顯著受到抑制。在LPS刺激6小時(shí)后，同窩對(duì)照小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10的含量達(dá)到[X]pg/mL，而CD11b缺陷小鼠僅為[X]pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果也表明，CD11b缺陷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-10mRNA的表達(dá)水平在刺激后的升高幅度明顯低于同窩對(duì)照小鼠。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞系中進(jìn)行了CD11b過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將CD11b表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞系中，使其過(guò)表達(dá)CD11b。然后用LPS刺激轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)IL-10的表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CD11b的巨噬細(xì)胞在LPS刺激后，IL-10的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD11b對(duì)TLR活化誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)具有促進(jìn)作用，CD11b缺陷會(huì)導(dǎo)致TLR活化后IL-10表達(dá)上調(diào)受阻，提示CD11b在調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，通過(guò)影響IL-10的表達(dá)發(fā)揮重要作用。3.2CD11b活化下游信號(hào)通路促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的機(jī)制3.2.1CD11b對(duì)Src和Akt激酶的活化CD11b在巨噬細(xì)胞中對(duì)Src和Akt激酶的活化起著關(guān)鍵作用，這一過(guò)程涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到Toll樣受體（TLR）配體刺激時(shí)，CD11b被激活，其胞內(nèi)段發(fā)生一系列變化。研究表明，CD11b主要通過(guò)磷酸化巨噬細(xì)胞中的酪氨酸激酶Src來(lái)啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)。在巨噬細(xì)胞中，CD11b與Src之間存在著密切的相互作用。通過(guò)免疫共沉淀和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在TLR配體，如LPS刺激后，CD11b能夠與Src結(jié)合，并且這種結(jié)合伴隨著Src酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化。具體而言，CD11b的激活導(dǎo)致其與Src分子靠近，使得Src的特定酪氨酸殘基（如Y416）被磷酸化。磷酸化的Src獲得了更高的激酶活性，從而能夠進(jìn)一步作用于下游分子。Src激酶活性的增加使其能夠磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85，進(jìn)而活化PI3K/Akt通路。PI3K是一種異源二聚體，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成。當(dāng)Src磷酸化p85的特定酪氨酸位點(diǎn)后，p85與p110的結(jié)合更加緊密，從而激活PI3K的催化活性?；罨腜I3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募蛋白激酶B（Akt）到細(xì)胞膜上。在細(xì)胞膜上，Akt與PIP3結(jié)合后，其蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）被磷酸化，從而使Akt被完全激活。Akt的激活標(biāo)志著PI3K/Akt通路的成功活化，這一通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，在免疫應(yīng)答中，它對(duì)于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有關(guān)鍵意義。3.2.2Src對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活機(jī)制Src活化后，與PI3K的p85亞基之間發(fā)生了一系列相互作用，這些作用對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活至關(guān)重要。Src通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與p85亞基上磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，這種特異性的結(jié)合使得Src能夠緊密地與PI3K相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，Src與p85亞基結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)p85亞基發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出其與p110亞基結(jié)合的位點(diǎn)，從而促進(jìn)p85與p110形成穩(wěn)定的異源二聚體，激活PI3K的催化活性。Src還能夠推動(dòng)E3泛素連接酶c-Cb1介導(dǎo)的p85的降解，這一過(guò)程進(jìn)一步調(diào)節(jié)了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。當(dāng)Src與p85結(jié)合后，它能夠招募c-Cb1到p85附近。c-Cb1是一種重要的E3泛素連接酶，它能夠識(shí)別并結(jié)合p85，然后將泛素分子連接到p85上。泛素化修飾的p85會(huì)被蛋白酶體識(shí)別并降解。p85的降解看似會(huì)破壞PI3K的結(jié)構(gòu)，但實(shí)際上，它在一定程度上解除了p85對(duì)p110的抑制作用。在正常情況下，p85與p110結(jié)合形成的PI3K處于相對(duì)低活性狀態(tài)，p85的降解使得p110能夠更加自由地發(fā)揮其催化功能，從而引起PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。這種通過(guò)降解調(diào)節(jié)亞基來(lái)激活信號(hào)通路的機(jī)制在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中較為獨(dú)特，它能夠在特定條件下，快速而有效地激活PI3K/Akt通路，對(duì)細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生重要影響。3.2.3PI3K/Akt通路對(duì)IL-10轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控PI3K/Akt通路的活化對(duì)下游分子GSK3α/β及轉(zhuǎn)錄因子CREB產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)PI3K/Akt通路被激活后，Akt作為關(guān)鍵的激酶，能夠磷酸化糖原合成酶激酶3α/β（GSK3α/β）。Akt主要磷酸化GSK3α/β的絲氨酸殘基，使其活性受到抑制。在未被磷酸化的情況下，GSK3α/β具有較高的活性，它能夠磷酸化多種底物，其中包括轉(zhuǎn)錄因子CREB。當(dāng)GSK3α/β磷酸化CREB時(shí)，會(huì)抑制CREB的轉(zhuǎn)錄活性，從而阻礙IL-10等基因的轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)PI3K/Akt通路活化，Akt磷酸化GSK3α/β后，GSK3α/β的活性被抑制，無(wú)法再對(duì)CREB進(jìn)行磷酸化。這就解除了GSK3α/β對(duì)CREB轉(zhuǎn)錄活性的抑制功能，使得CREB能夠發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。CREB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠結(jié)合到IL-10基因的啟動(dòng)子區(qū)域，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，促進(jìn)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)這一系列的信號(hào)傳遞和分子間相互作用，PI3K/Akt通路的活化最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)IL-10轉(zhuǎn)錄表達(dá)的促進(jìn)作用。在巨噬細(xì)胞受到TLR配體刺激時(shí)，CD11b通過(guò)激活PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)GSK3α/β和CREB的活性，從而增加IL-10的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)。3.3CD11b在腸炎模型中的負(fù)向調(diào)控作用3.3.1CD11b缺陷小鼠腸炎模型的建立與分析為深入探究CD11b在腸炎中的負(fù)向調(diào)控作用，本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的腸炎模型，以CD11b缺陷小鼠（Itgam?/?）和同窩對(duì)照小鼠為研究對(duì)象。DSS誘導(dǎo)的腸炎模型是研究炎癥性腸病的常用模型，其發(fā)病機(jī)制與人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎相似。DSS是一種聚陰離子衍生物，通過(guò)自由飲用DSS水溶液，可破壞結(jié)腸黏膜，使促炎癥腸內(nèi)容物如細(xì)菌及其產(chǎn)物傳播到隱窩，引發(fā)炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取6-8周齡的CD11b缺陷小鼠和同窩對(duì)照小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組小鼠飲用含有3%-5%DSS的水溶液，對(duì)照組小鼠飲用正常飲用水。在實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄小鼠的體重變化、糞便性狀（包括糞便稠度、是否帶血等）以及一般狀態(tài)。結(jié)果顯示，隨著飲用DSS水溶液時(shí)間的增加，CD11b缺陷小鼠體重下降更為明顯。在飲用DSS第5天，CD11b缺陷小鼠體重較初始體重下降了[X]%，而同窩對(duì)照小鼠體重下降了[X]%。從糞便性狀來(lái)看，CD11b缺陷小鼠更早出現(xiàn)血性腹瀉，且腹瀉程度更為嚴(yán)重。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸的大體形態(tài)。發(fā)現(xiàn)CD11b缺陷小鼠的結(jié)腸明顯縮短、充血、水腫，且出現(xiàn)不同程度的潰瘍；而對(duì)照組小鼠的結(jié)腸損傷程度相對(duì)較輕。對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CD11b缺陷小鼠的結(jié)腸黏膜層破壞嚴(yán)重，隱窩結(jié)構(gòu)消失，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；同窩對(duì)照小鼠的結(jié)腸黏膜雖有炎癥反應(yīng)，但損傷程度明顯低于CD11b缺陷小鼠。通過(guò)對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、隱窩損傷程度等指標(biāo)進(jìn)行量化評(píng)分，CD11b缺陷小鼠的評(píng)分顯著高于同窩對(duì)照小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，CD11b缺陷小鼠在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重，提示CD11b在腸炎中可能發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用。3.3.2CD11b通過(guò)IL-10和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向調(diào)控腸炎的機(jī)制巨噬細(xì)胞IL-10產(chǎn)生減少與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及腸炎發(fā)展密切相關(guān)，CD11b在其中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，CD11b缺陷小鼠血清中IL-10的含量明顯低于同窩對(duì)照小鼠。這是因?yàn)镃D11b能夠通過(guò)磷酸化巨噬細(xì)胞中的酪氨酸激酶Src，活化PI3K/Akt通路，從而促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)CD11b缺陷時(shí)，這一信號(hào)通路無(wú)法正常激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞在受到Toll樣受體（TLR）配體刺激后，IL-10的產(chǎn)生顯著減少。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量的變化與腸炎的發(fā)展密切相關(guān)。CD11b缺陷小鼠腸系膜淋巴結(jié)與脾臟中CD4+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于同窩對(duì)照小鼠。研究表明，IL-10是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和功能維持的重要細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞IL-10產(chǎn)生減少，使得調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化和增殖受到抑制，導(dǎo)致其數(shù)量減少。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的不足，無(wú)法有效抑制腸道內(nèi)過(guò)度的免疫反應(yīng)，使得腸炎癥狀進(jìn)一步加重。CD11b通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能，從而負(fù)向調(diào)控腸炎的發(fā)展。在CD11b缺陷的情況下，這一調(diào)控機(jī)制失衡，導(dǎo)致腸炎炎癥反應(yīng)加劇。這一發(fā)現(xiàn)為理解腸炎的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要的理論依據(jù)。四、LRRFIP2和CD11b負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的比較與聯(lián)系4.1調(diào)控機(jī)制的異同點(diǎn)LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答的負(fù)向調(diào)控中，其調(diào)控機(jī)制既有相同點(diǎn)，也存在明顯差異。在相同點(diǎn)方面，兩者都參與免疫信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，對(duì)免疫細(xì)胞的活性和細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，從而維持免疫平衡，防止過(guò)度免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體造成損傷。在炎癥反應(yīng)中，LRRFIP2通過(guò)抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化，減少I(mǎi)L-1β等炎性細(xì)胞因子的分泌，避免炎癥反應(yīng)過(guò)度；CD11b則通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)機(jī)體的損害。然而，它們的調(diào)控機(jī)制也存在諸多不同。LRRFIP2主要作用于NLRP3炎性復(fù)合體，通過(guò)與NLRP3炎性復(fù)合體的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控。在分子層面，LRRFIP2在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，通過(guò)其N(xiāo)端氨基酸序列和NLRP3結(jié)合，進(jìn)而與整個(gè)NLRP3炎性復(fù)合體相互作用。其N(xiāo)端序列和中部的Coilmotif對(duì)負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化至關(guān)重要，缺失這些結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致其負(fù)向調(diào)控功能受損。LRRFIP2還能通過(guò)Coilmotif與Flightless1分子結(jié)合，在NLRP3炎性復(fù)合體活化之后，促進(jìn)Flightless1與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合并發(fā)揮抑制炎性復(fù)合體活性的功能，且LRRFIP2發(fā)揮抑制功能依賴于Flightless1。CD11b的調(diào)控機(jī)制則主要圍繞Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路展開(kāi)。CD11b能夠通過(guò)活化Syk引起TRIF和MyD88的降解，從而負(fù)向調(diào)控TLR信號(hào)通路活化引起的炎癥反應(yīng)。在調(diào)節(jié)IL-10表達(dá)方面，CD11b主要通過(guò)磷酸化巨噬細(xì)胞中的酪氨酸激酶Src，活化PI3K/Akt通路，來(lái)增強(qiáng)TLR活化引起的IL-10上調(diào)表達(dá)。Src活化后，與P13K的p85亞基結(jié)合并使其磷酸化，推動(dòng)E3泛素連接酶c-Cb1介導(dǎo)的p85的降解，從而引起PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。PI3K/Akt通路的活化引起下游分子GSK3α/β的磷酸化與活性的抑制，解除其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CREB轉(zhuǎn)錄活性的抑制功能，進(jìn)而促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在腸炎模型中，CD11b通過(guò)促進(jìn)IL-10的釋放與增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量來(lái)負(fù)向調(diào)控腸炎，而LRRFIP2在腸炎模型中的作用目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。4.2在免疫應(yīng)答中的協(xié)同或互補(bǔ)作用探討基于上述對(duì)LRRFIP2和CD11b負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答機(jī)制的研究，兩者在免疫應(yīng)答中可能存在協(xié)同或互補(bǔ)關(guān)系。從作用靶點(diǎn)來(lái)看，LRRFIP2主要作用于NLRP3炎性復(fù)合體，抑制其活化，減少I(mǎi)L-1β等炎性細(xì)胞因子的分泌；而CD11b主要通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫抑制作用。在病原體感染引發(fā)的免疫應(yīng)答過(guò)程中，病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）可同時(shí)激活NLRP3炎性復(fù)合體和TLR信號(hào)通路。LRRFIP2通過(guò)抑制NLRP3炎性復(fù)合體，降低IL-1β等促炎細(xì)胞因子的水平，減少炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度；CD11b則通過(guò)促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，兩者從不同角度協(xié)同維持免疫平衡。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌感染時(shí)，細(xì)菌的成分如LPS既可以激活NLRP3炎性復(fù)合體，也可以激活TLR信號(hào)通路。LRRFIP2能夠抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化，減少I(mǎi)L-1β的分泌，減輕炎癥反應(yīng)；CD11b則通過(guò)激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，抑制過(guò)度的免疫激活，兩者共同作用，防止免疫反應(yīng)過(guò)度導(dǎo)致的組織損傷。在細(xì)胞類(lèi)型特異性方面，雖然LRRFIP2和CD11b在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，但它們可能在不同免疫細(xì)胞中發(fā)揮著不同側(cè)重的調(diào)控作用，從而實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。LRRFIP2在巨噬細(xì)胞中對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體的調(diào)控作用已較為明確；而CD11b除了在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用外，在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞中也參與免疫調(diào)節(jié)。在炎癥部位，中性粒細(xì)胞在炎癥早期迅速募集，CD11b在中性粒細(xì)胞的黏附、遷移和殺菌功能中發(fā)揮重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活性，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。巨噬細(xì)胞則在炎癥過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮作用，LRRFIP2和CD11b在巨噬細(xì)胞中共同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，兩者在不同免疫細(xì)胞中的協(xié)同作用，有助于全面調(diào)控免疫應(yīng)答。LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答的不同階段也可能存在協(xié)同或互補(bǔ)作用。在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)階段，CD11b通過(guò)對(duì)TLR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，抑制過(guò)度的免疫激活，為免疫應(yīng)答的平穩(wěn)啟動(dòng)提供保障；而在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段，LRRFIP2對(duì)NLRP3炎性復(fù)合體的抑制作用，有助于控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，防止免疫損傷。在病毒感染初期，CD11b通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的識(shí)別和反應(yīng)，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，避免對(duì)機(jī)體造成過(guò)大損傷；隨著感染的發(fā)展，LRRFIP2抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，維持免疫平衡，確保免疫應(yīng)答既能有效清除病毒，又不會(huì)對(duì)機(jī)體造成過(guò)度傷害。五、研究結(jié)論與展望5.1研究主要成果總結(jié)本研究深入探究了LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答中的負(fù)向調(diào)控作用及分子機(jī)制，取得了一系列重要成果。在LRRFIP2的研究中，明確了其與NLRP3炎性復(fù)合體之間存在緊密關(guān)聯(lián)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾LRRFIP2表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎性復(fù)合體相關(guān)刺激引起的細(xì)胞分泌IL-1β顯著增加，且這一增加源于NLRP3炎性復(fù)合體活化水平升高導(dǎo)致的IL-1β剪切加快，對(duì)IL-1β前體合成過(guò)程并無(wú)影響。進(jìn)一步研究揭示，LRRFIP2在活化NLRP3炎性復(fù)合體的刺激后，能夠通過(guò)其N(xiāo)端氨基酸序列和NLRP3結(jié)合，進(jìn)而與整個(gè)NLRP3炎性復(fù)合體相互作用。在THP-1中過(guò)表達(dá)LRRFIP2的實(shí)驗(yàn)表明，其N(xiāo)端序列和中部的Coilmotif對(duì)負(fù)向調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體活化至關(guān)重要，缺失這些結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致LRRFIP2無(wú)法有效抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活性。此外，本研究還證實(shí)LRRFIP2能夠通過(guò)Coilmotif與Flightless1分子結(jié)合，干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的Flightless1后，活化炎性復(fù)合體的刺激引起的IL-1β的分泌水平與Capase-1的活化水平都升高。LRRFIP2在NLRP3炎性復(fù)合體活化之后，能夠促進(jìn)Flightless1與NLRP3炎性復(fù)合體的結(jié)合并發(fā)揮抑制炎性復(fù)合體活性的功能，且LRRFIP2發(fā)揮抑制功能依賴于Flightless1。對(duì)于CD11b，本研究闡明了其在Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路及IL-10調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用。CD11b缺陷小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞在TLR3、4、9的配體刺激下，IL-10的表達(dá)上升顯著受到抑制，表明CD11b對(duì)TLR活化誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)具有促進(jìn)作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，CD11b主要通過(guò)磷酸化巨噬細(xì)胞中的酪氨酸激酶Src，活化PI3K/Akt通路，來(lái)增強(qiáng)TLR活化引起的IL-10上調(diào)表達(dá)。Src活化后，與P13K的p85亞基結(jié)合并使其磷酸化，推動(dòng)E3泛素連接酶c-Cb1介導(dǎo)的p85的降解，從而引起PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。PI3K/Akt通路的活化引起下游分子GSK3α/β的磷酸化與活性的抑制，解除其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CREB轉(zhuǎn)錄活性的抑制功能，進(jìn)而促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，CD11b缺陷小鼠有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，血清中IL-10的含量以及腸系膜淋巴結(jié)與脾臟中CD4+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例低于同窩對(duì)照，說(shuō)明CD11b通過(guò)促進(jìn)IL-10的釋放與增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量來(lái)負(fù)向調(diào)控腸炎。綜合來(lái)看，LRRFIP2和CD11b在免疫應(yīng)答