菌群分析技術(shù)線路圖解演講人：日期:CATALOGUE目錄02DNA提取與質(zhì)檢01樣本采集與預(yù)處理03擴(kuò)增與文庫構(gòu)建04高通量測序05生物信息學(xué)分析06結(jié)果解析與應(yīng)用樣本采集與預(yù)處理01樣本類型選擇標(biāo)準(zhǔn)代表性樣本篩選優(yōu)先選擇能反映目標(biāo)菌群真實組成的樣本類型，如腸道菌群研究需采集糞便樣本，口腔菌群則選擇唾液或牙菌斑樣本，確保樣本與目標(biāo)生態(tài)位高度關(guān)聯(lián)。樣本均一性控制需排除明顯異質(zhì)性樣本（如含未消化食物殘渣的糞便），通過標(biāo)準(zhǔn)化篩網(wǎng)過濾或離心處理提升樣本內(nèi)部成分一致性，降低后續(xù)分析誤差。宿主干擾因素規(guī)避采集時需記錄宿主近期用藥史、飲食結(jié)構(gòu)等干擾因素，避免抗生素使用后樣本或極端飲食導(dǎo)致的菌群失真現(xiàn)象。無菌采集操作規(guī)范操作者需穿戴無菌手套、口罩及防護(hù)服，使用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的采樣容器，在生物安全柜內(nèi)完成分裝以避免環(huán)境微生物污染。生物安全防護(hù)流程交叉污染防控厭氧菌特殊處理每個樣本使用獨(dú)立滅菌器械采集，接觸不同樣本前需用75%乙醇擦拭或火焰灼燒器械，采樣后立即密封容器并標(biāo)注唯一識別碼。針對嚴(yán)格厭氧菌群樣本，需在惰性氣體環(huán)境下快速轉(zhuǎn)移至預(yù)還原培養(yǎng)基中，確保菌群活性與原始狀態(tài)保持一致。樣本低溫保存與運(yùn)梯度溫度保存方案短期保存采用-20℃冷凍，長期存儲需-80℃超低溫或液氮環(huán)境，冷凍過程需添加甘油或RNA穩(wěn)定劑防止冰晶損傷菌體結(jié)構(gòu)。冷鏈運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)化凍融循環(huán)規(guī)避策略使用干冰或相變材料維持全程低溫，運(yùn)輸箱內(nèi)放置溫度記錄儀，確保樣本抵達(dá)實驗室時核心溫度不超過-70℃閾值。明確標(biāo)注樣本凍融次數(shù)，優(yōu)先選擇凍存管分裝存儲，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致菌群DNA斷裂或代謝物降解。123DNA提取與質(zhì)檢02細(xì)胞裂解技術(shù)選擇機(jī)械裂解法通過珠磨、超聲或高壓均質(zhì)等物理手段破壞細(xì)胞壁/膜結(jié)構(gòu)，適用于革蘭氏陽性菌等難裂解樣本，需優(yōu)化參數(shù)避免DNA過度片段化?；瘜W(xué)裂解法使用SDS、CTAB等去垢劑溶解膜脂質(zhì)，配合溶菌酶或蛋白酶K消化細(xì)胞壁蛋白，對復(fù)雜樣本（如土壤、糞便）需調(diào)整試劑配比以提高裂解效率。酶解法針對特定微生物（如真菌）采用幾丁質(zhì)酶或纖維素酶定向降解細(xì)胞壁，需嚴(yán)格控制溫度與pH以保持酶活性，常與其他方法聯(lián)用?；蚪MDNA純化流程磁珠純化技術(shù)羧基化磁珠在PEG/NaCl體系中捕獲DNA，通過磁場分離快速清洗雜質(zhì)，適用于高通量測序前處理，需優(yōu)化磁珠粒徑與表面修飾以提高得率。硅膠膜吸附法利用高鹽條件下DNA與硅膠膜特異性結(jié)合特性，經(jīng)洗滌后低鹽洗脫，可實現(xiàn)自動化操作且回收率穩(wěn)定，但對多糖/多酚含量高的樣本需預(yù)處理。酚-氯仿抽提通過有機(jī)相與水相分離去除蛋白質(zhì)及多糖，需重復(fù)離心并謹(jǐn)慎吸取水相以避免交叉污染，適合高純度DNA需求但操作繁瑣。核酸濃度與完整性檢測通過260/280nm吸光度比值評估DNA純度（1.8-2.0為佳），230nm峰檢測有機(jī)溶劑殘留，需注意RNA污染對結(jié)果的干擾。紫外分光光度法熒光定量法凝膠電泳分析采用PicoGreen等熒光染料特異性結(jié)合雙鏈DNA，靈敏度達(dá)pg/μl級，適合低濃度樣本但需標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)曲線。0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA條帶完整性（23kb以上為主帶），可同時檢測降解情況與RNA污染，需結(jié)合圖像分析軟件定量。擴(kuò)增與文庫構(gòu)建03引物設(shè)計（16S/ITS等）靶向區(qū)域選擇條形碼序列整合引物特異性驗證針對16SrRNA基因的V3-V4高變區(qū)或ITS1/ITS2區(qū)設(shè)計引物，確保覆蓋微生物多樣性熱點(diǎn)區(qū)域，同時兼顧擴(kuò)增特異性和通用性。通過體外實驗和生物信息學(xué)模擬，排除引物二聚體形成風(fēng)險，并驗證其對目標(biāo)菌群的覆蓋度，避免引物偏好性導(dǎo)致的群落結(jié)構(gòu)偏差。在引物5'端嵌入8-12bp的獨(dú)特分子標(biāo)識符（UMI），實現(xiàn)多重樣本混合測序時的樣本溯源，同時控制GC含量在40-60%以保障擴(kuò)增效率。通過12-35循環(huán)的梯度實驗確定最低有效循環(huán)數(shù)，避免過度擴(kuò)增引起的嵌合體形成，同時采用熱啟動Taq酶抑制非特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化循環(huán)數(shù)梯度測試使用溫度梯度PCR儀（±5℃范圍）精確測定最佳退火溫度，確保高GC含量模板的有效變性，減少引物脫靶現(xiàn)象。退火溫度校準(zhǔn)針對環(huán)境樣本中腐殖酸等PCR抑制劑，優(yōu)化磁珠純化流程或添加BSA/甲酰胺等增強(qiáng)劑，提高復(fù)雜樣本的擴(kuò)增成功率。抑制劑去除方案采用QubitdsDNAHS檢測試劑盒進(jìn)行絕對定量，結(jié)合Agilent2100生物分析儀檢測片段分布，剔除長度異常（<200bp或>700bp）的文庫。文庫定量與均一化熒光定量標(biāo)準(zhǔn)化根據(jù)平均片段長度和DNA質(zhì)量濃度，精確計算各文庫的摩爾濃度，使用Tris-HCl緩沖液調(diào)整至10nM工作濃度。摩爾濃度計算基于各文庫的qPCRCt值差異，按指數(shù)函數(shù)調(diào)整混合比例，確保Illumina測序芯片上各樣本數(shù)據(jù)量偏差不超過±5%?；旌现笖?shù)校正高通量測序04測序平臺選擇（Illumina等）Illumina平臺作為目前最主流的高通量測序平臺，具有通量高、成本低、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，適用于16SrRNA基因測序、宏基因組測序等多種微生物群落研究。PacBio平臺基于單分子實時測序技術(shù)（SMRT），讀長可達(dá)10-50kb，適合全長16SrRNA測序或復(fù)雜微生物基因組組裝，但成本較高且錯誤率需后期校正。OxfordNanopore采用納米孔技術(shù)實現(xiàn)超長讀長（>100kb）和實時測序，適用于快速病原檢測或宏基因組組裝，但原始數(shù)據(jù)錯誤率較高需生物信息學(xué)優(yōu)化。IonTorrent通過半導(dǎo)體芯片檢測pH變化進(jìn)行測序，設(shè)備小型化適合臨床快速檢測，但通量和讀長較Illumina略遜一籌。測序深度與讀長確定建議微生物群落樣本達(dá)到10-20Gb數(shù)據(jù)量，復(fù)雜環(huán)境樣本需50Gb以上，深度不足會導(dǎo)致稀有物種基因丟失。宏基因組測序深度

0104

03

02

需繪制樣本的物種累積曲線，當(dāng)曲線進(jìn)入平臺期時說明測序深度足夠，否則需追加測序數(shù)據(jù)量。深度-物種曲線驗證通常要求每個樣本達(dá)到50,000-100,000條有效序列，以確保低豐度菌群的檢出率，同時需結(jié)合樣本復(fù)雜度調(diào)整深度。16SrRNA測序深度V3-V4區(qū)測序推薦2×300bp雙端讀長，全長16S測序需≥1,400bp；宏基因組測序中短讀長（150bp）適合功能注釋，長讀長助力基因組組裝。讀長選擇策略原始數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)序列質(zhì)量過濾接頭污染處理宿主DNA去除重復(fù)序列處理采用Q30作為閾值（錯誤率≤0.1%），剔除低質(zhì)量堿基占比超過50%的reads，同時去除含N比例超過5%的序列。使用Cutadapt等工具識別并去除測序接頭序列，允許最大10%的堿基錯配率，確保數(shù)據(jù)純凈度。針對宿主污染率高的樣本（如糞便），需通過Bowtie2比對參考基因組，過濾匹配率>90%的非微生物序列。PCR擴(kuò)增引入的重復(fù)序列需通過dereplication處理，但需保留至少2條重復(fù)序列以避免真實低頻序列誤刪。生物信息學(xué)分析05序列去噪與拼接原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制重疊區(qū)域拼接優(yōu)化序列去噪算法應(yīng)用嵌合體序列過濾通過FastQC等工具評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，剔除低質(zhì)量序列和接頭污染，確保后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。采用DADA2或Deblur等算法消除擴(kuò)增子測序中的PCR錯誤和測序噪聲，提高序列分辨率。使用FLASH或PEAR等工具對雙端測序讀長進(jìn)行高效拼接，保留高置信度的重疊序列區(qū)域。通過UCHIME或VSEARCH識別并移除嵌合體序列，避免人為引入的分類學(xué)偏差。傳統(tǒng)OTU聚類流程高分辨率ASV分析基于97%相似度閾值通過UPARSE或CD-HIT進(jìn)行序列聚類，生成可操作分類單元（OTU）表。采用AmpliconSequenceVariants（ASV）方法，無需設(shè)定相似度閾值即可區(qū)分單核苷酸差異的序列變體。OTU/ASV聚類方法參考數(shù)據(jù)庫比對策略結(jié)合SILVA或Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，優(yōu)化聚類過程中的分類學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)。去冗余序列處理通過UNOISE3等算法消除測序深度引起的冗余序列，提升低豐度微生物的檢測靈敏度。物種注釋數(shù)據(jù)庫匹配多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合注釋整合RDP、NCBI和GTDB等權(quán)威數(shù)據(jù)庫資源，通過BLAST或QIIME2實現(xiàn)跨平臺分類學(xué)注釋。01置信度閾值設(shè)定根據(jù)序列相似度（通?！?0%）分配分類層級，對屬級以上分類單元采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。未分類序列處理通過LCA（最低共同祖先）算法處理低匹配度序列，避免過度注釋導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。功能基因注釋擴(kuò)展針對宏基因組數(shù)據(jù)，采用KEGG或COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能通路預(yù)測，補(bǔ)充物種分類信息。020304結(jié)果解析與應(yīng)用06Alpha多樣性分析采用Bray-Curtis距離或UniFrac距離矩陣，結(jié)合主坐標(biāo)分析（PCoA）或非度量多維標(biāo)度（NMDS），量化樣本間群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異性，識別環(huán)境或處理因素對微生物群落的影響。Beta多樣性分析系統(tǒng)發(fā)育多樣性評估基于16SrRNA或ITS基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算PD_whole_tree指數(shù)，反映微生物群落的進(jìn)化關(guān)系及功能潛力差異。通過計算Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)，評估樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和均勻度，揭示不同樣本間微生物組成的差異及穩(wěn)定性。群落多樣性指數(shù)計算差異菌群篩選策略基于豐度的差異分析網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)性分析機(jī)器學(xué)習(xí)輔助篩選利用DESeq2、edgeR或LEfSe等工具，通過統(tǒng)計學(xué)方法（如Wilcoxon檢驗、Kruskal-Wallis檢驗）篩選不同分組間顯著差異的菌群，重點(diǎn)關(guān)注門、綱、屬等分類層級的差異物種。采用隨機(jī)森林（RandomForest）或支持向量機(jī)（SVM）等算法，結(jié)合交叉驗證，識別對分組貢獻(xiàn)度高的關(guān)鍵菌群，提升差異菌群篩選的準(zhǔn)確性和可解釋性。通過Spearman相關(guān)性或SparCC算法構(gòu)建微生物互作網(wǎng)絡(luò)，篩選核心菌群及與特定表型顯著關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)菌群，揭示微生物群落的協(xié)同或競爭關(guān)系?；诤昊蚪M的功能預(yù)測通過PICRUSt2或Tax4Fun工具，將16SrRNA數(shù)據(jù)映射至KEGG、COG或MetaCyc數(shù)據(jù)庫