乏氧微環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞增殖與Notch通路關(guān)聯(lián)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。近年來，隨著生活方式的改變、環(huán)境污染以及人口老齡化等因素的影響，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)226萬人，首次超過肺癌，成為“全球第一大癌”。在中國，乳腺癌的發(fā)病率也在不斷攀升，每年大約新增乳腺癌患者42萬人，且年發(fā)病率以3%-4%的速度遞增。雖然乳腺癌患者的生存率在不斷提高，但晚期患者比例仍然較高，死亡率也不容忽視。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和治療方法，對于提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。腫瘤的生長和發(fā)展依賴于充足的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)。然而，由于腫瘤組織的快速增殖和異常的血管生成，腫瘤內(nèi)部往往存在乏氧區(qū)域。乏氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。在乏氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，以維持其生存和增殖能力。這些變化包括激活乏氧誘導(dǎo)因子（HIF）等信號通路，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，乏氧環(huán)境可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其增殖速度和侵襲力明顯高于正常氧氣環(huán)境下的生長速度。乏氧還與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，如復(fù)發(fā)率增加、生存率降低等。因此，深入了解乏氧對乳腺癌細(xì)胞的影響機(jī)制，對于開發(fā)針對乏氧腫瘤微環(huán)境的治療策略具有重要意義。Notch信號通路是一條高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，越來越多的研究表明，Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也扮演著重要角色。在乳腺癌中，Notch信號通路的異常激活與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及干細(xì)胞特性維持等密切相關(guān)。一些研究說明，Notch信號通路在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要的角色，特別是在乏氧條件下，Notch信號通路被激活并增強(qiáng)，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。通過抑制Notch信號通路，可以有效阻止乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，研究Notch信號通路在乏氧乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，有望為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。本研究旨在探討乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其與Notch通路的關(guān)系。通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期變化以及Notch通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。本研究的結(jié)果將為深入了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)針對乏氧腫瘤微環(huán)境和Notch通路的治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的理論和臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于乏氧與乳腺癌的研究開展較早且較為深入。早在20世紀(jì)70年代，就有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在乏氧區(qū)域，并推測乏氧可能對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明乏氧在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響方面，多項(xiàng)研究表明乏氧可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。一項(xiàng)發(fā)表于《CancerResearch》的研究發(fā)現(xiàn)，將乳腺癌細(xì)胞置于乏氧環(huán)境（1%O?）中培養(yǎng)，其增殖速度明顯高于常氧環(huán)境（21%O?），且這種增殖促進(jìn)作用呈時間和劑量依賴性。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，乏氧可激活乳腺癌細(xì)胞中的HIF-1α信號通路，上調(diào)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如CyclinD1、CDK2等，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞增殖。關(guān)于乏氧與Notch通路在乳腺癌中的關(guān)系，國外研究也取得了重要進(jìn)展。研究表明，Notch信號通路在乏氧乳腺癌細(xì)胞中被激活，且其激活與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，美國的一個研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在乏氧條件下，乳腺癌細(xì)胞中Notch1受體及其配體Jagged1的表達(dá)顯著上調(diào)，通過RNA干擾技術(shù)抑制Notch1的表達(dá)，可有效抑制乏氧乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。此外，還有研究表明，Notch通路的激活可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而乏氧則可進(jìn)一步增強(qiáng)這一作用。在國內(nèi)，乳腺癌的研究也受到了廣泛關(guān)注，針對乏氧與乳腺癌以及Notch通路的研究也取得了一定的成果。在乏氧對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響方面，國內(nèi)學(xué)者通過體外實(shí)驗(yàn)和臨床樣本分析，進(jìn)一步證實(shí)了乏氧可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)發(fā)表于《中國腫瘤生物治療雜志》的研究發(fā)現(xiàn)，乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，且細(xì)胞的遷移和侵襲能力也顯著提高。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)乏氧可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使其獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在乏氧與Notch通路關(guān)系的研究方面，國內(nèi)的研究也表明Notch信號通路在乏氧乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。有研究通過對乳腺癌組織芯片的分析發(fā)現(xiàn)，Notch1的表達(dá)水平與乳腺癌組織中的乏氧程度呈正相關(guān)，且高表達(dá)Notch1的乳腺癌患者預(yù)后較差。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過抑制Notch通路的活性，可有效抑制乏氧乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，提示Notch通路可能是乏氧乳腺癌治療的一個潛在靶點(diǎn)。盡管國內(nèi)外在乏氧對乳腺癌細(xì)胞影響及與Notch通路關(guān)系的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前的研究主要集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型上，對于臨床樣本的研究相對較少，且缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證相關(guān)的研究結(jié)果。雖然已經(jīng)明確乏氧和Notch通路在乳腺癌中的重要作用，但兩者之間具體的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多未知的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子靶點(diǎn)有待進(jìn)一步探索?，F(xiàn)有研究主要關(guān)注了乏氧和Notch通路對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，對于其他生物學(xué)行為，如細(xì)胞凋亡、免疫逃逸等方面的研究相對較少，需要進(jìn)一步深入研究。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究的目標(biāo)是明確乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，解析乏氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞增殖變化的具體情況，如增殖速度的改變、細(xì)胞周期的變化等，深入探究乏氧與Notch通路在乳腺癌細(xì)胞中的內(nèi)在聯(lián)系，包括Notch通路在乏氧條件下的激活機(jī)制、相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，以及驗(yàn)證Notch通路在乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵作用，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：觀察乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響：選取人乳腺癌細(xì)胞系，如MDA-MB-231、MCF-7等，將其置于常氧（21%O?）和乏氧（1%O?）環(huán)境中培養(yǎng)。采用CCK-8法、EdU染色法等方法，在不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，比較常氧和乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞的增殖能力差異。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，分析乏氧對乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，明確乏氧促進(jìn)細(xì)胞增殖是通過影響細(xì)胞周期的哪個階段實(shí)現(xiàn)的，例如是否促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期或G2/M期。探究乏氧對乳腺癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響：利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，檢測乏氧和常氧條件下乳腺癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因，如Notch1、Notch2、Jagged1、DLL1、Hes1、Hey1等的mRNA表達(dá)水平，分析乏氧對這些基因表達(dá)的調(diào)控作用。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測上述Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，同時檢測Notch通路的關(guān)鍵激活形式，如Notch1胞內(nèi)段（NICD1）的表達(dá)變化，進(jìn)一步明確乏氧對Notch通路蛋白水平的影響。采用免疫熒光染色技術(shù)，觀察Notch通路相關(guān)蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的定位和表達(dá)變化，直觀地展示乏氧條件下Notch通路蛋白的分布情況。驗(yàn)證Notch通路在乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用：使用Notch通路抑制劑，如DAPT等，處理乏氧培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞。通過CCK-8法、EdU染色法等檢測細(xì)胞增殖活性，觀察抑制Notch通路后，乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是否受到抑制。利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對Notch1等關(guān)鍵基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，特異性地沉默Notch通路相關(guān)基因的表達(dá)。在乏氧條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期分布，進(jìn)一步驗(yàn)證Notch通路在乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖中的關(guān)鍵作用。通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)，在沉默Notch通路相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，過表達(dá)該基因，觀察細(xì)胞增殖和Notch通路相關(guān)指標(biāo)的變化，明確Notch通路與乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖之間的因果關(guān)系。1.4研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞培養(yǎng)：選取人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)分組為常氧組和乏氧組，常氧組細(xì)胞在正常氧含量（21%O?）條件下培養(yǎng)，乏氧組細(xì)胞則置于乏氧培養(yǎng)箱中，控制氧氣含量為1%，二氧化碳含量為5%，氮?dú)夂繛?4%，培養(yǎng)相應(yīng)時間。MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/孔，接種于96孔板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液。每組設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）。細(xì)胞貼壁后，將乏氧組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至乏氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常氧組細(xì)胞繼續(xù)在常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h。然后吸棄上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，比較常氧組和乏氧組細(xì)胞的增殖差異。EdU染色法檢測細(xì)胞增殖：將乳腺癌細(xì)胞以2×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行常氧和乏氧處理。在處理結(jié)束前2h，向每孔加入50μM的EdU溶液，繼續(xù)孵育2h。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS清洗3次，每次5min。接著用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞15min，PBS清洗3次，每次5min。按照EdU檢測試劑盒說明書，加入Click反應(yīng)液，避光孵育30min。PBS清洗3次，每次5min。最后用Hoechst33342染核10min，PBS清洗3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例，評估細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：收集對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/ml，接種于6孔板，每孔加入2ml細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，分為常氧組和乏氧組進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2次，1000rpm離心5min。棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄去乙醇，用PBS清洗2次。加入500μlPI/RNase染色緩沖液，室溫避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例，研究乏氧對乳腺癌細(xì)胞周期的影響。實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因表達(dá)：采用Trizol法提取常氧組和乏氧組乳腺癌細(xì)胞的總RNA，使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中Notch通路相關(guān)基因（Notch1、Notch2、Jagged1、DLL1、Hes1、Hey1等）的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒說明書。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，比較常氧組和乏氧組中Notch通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的差異。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測蛋白表達(dá)：收集常氧組和乏氧組乳腺癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。12000rpm離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，TBST清洗3次，每次10min。加入一抗（如抗Notch1、抗NICD1、抗Jagged1、抗Hes1、抗Hey1等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1h。TBST清洗3次，每次10min。最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量，比較常氧組和乏氧組中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異。免疫熒光染色觀察蛋白定位：將乳腺癌細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔加入500μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行常氧和乏氧處理。處理結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS清洗3次，每次5min。用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞15min，PBS清洗3次，每次5min。用5%BSA封閉細(xì)胞1h，PBS清洗3次，每次5min。加入一抗（如抗Notch1、抗NICD1等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次5min。加入熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫避光孵育1h。PBS清洗3次，每次5min。用DAPI染核5min，PBS清洗3次，每次5min。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察Notch通路相關(guān)蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的定位和表達(dá)變化。Notch通路抑制劑實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/孔，接種于96孔板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，分為常氧組、乏氧組、乏氧+DAPT組（DAPT為Notch通路抑制劑，終濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，如10μM）。常氧組和乏氧組加入等量的DMSO作為對照。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，比較各組細(xì)胞的增殖差異。同時，在處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，分析Notch通路抑制劑對乏氧乳腺癌細(xì)胞周期的影響。RNA干擾實(shí)驗(yàn)：針對Notch1基因設(shè)計(jì)特異性的小干擾RNA（siRNA），同時設(shè)置陰性對照siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司合成。將乳腺癌細(xì)胞以2×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2ml細(xì)胞懸液。當(dāng)細(xì)胞生長至50%-70%融合時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將siRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后將細(xì)胞分為常氧組、乏氧組、乏氧+siNotch1組。在相應(yīng)條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR和Westernblot檢測Notch1基因和蛋白的沉默效率。同時，采用MTT法、EdU染色法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，驗(yàn)證Notch1基因沉默對乏氧乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。回復(fù)實(shí)驗(yàn)：在RNA干擾實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建Notch1過表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至沉默Notch1基因的乳腺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染方法同RNA干擾實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后分為常氧組、乏氧組、乏氧+siNotch1+Notch1OE組（Notch1OE表示Notch1過表達(dá)質(zhì)粒）。在相應(yīng)條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR和Westernblot檢測Notch1基因和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證過表達(dá)效果。采用MTT法、EdU染色法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，觀察回復(fù)Notch1表達(dá)后對乏氧乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，明確Notch通路與乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖之間的因果關(guān)系。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從細(xì)胞培養(yǎng)到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測以及數(shù)據(jù)分析的流程，例如：首先進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)并分組（常氧組、乏氧組等），然后分別對各組細(xì)胞進(jìn)行MTT、EdU、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、Westernblot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)檢測，接著進(jìn)行Notch通路抑制劑實(shí)驗(yàn)、RNA干擾實(shí)驗(yàn)和回復(fù)實(shí)驗(yàn)，最后對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并得出結(jié)論。圖中需清晰標(biāo)注各實(shí)驗(yàn)步驟的先后順序以及相互關(guān)系][此處插入技術(shù)路線圖，展示從細(xì)胞培養(yǎng)到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測以及數(shù)據(jù)分析的流程，例如：首先進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)并分組（常氧組、乏氧組等），然后分別對各組細(xì)胞進(jìn)行MTT、EdU、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、Westernblot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)檢測，接著進(jìn)行Notch通路抑制劑實(shí)驗(yàn)、RNA干擾實(shí)驗(yàn)和回復(fù)實(shí)驗(yàn)，最后對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并得出結(jié)論。圖中需清晰標(biāo)注各實(shí)驗(yàn)步驟的先后順序以及相互關(guān)系]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌概述乳腺癌是指起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳、激素、生活方式、環(huán)境等多種因素。遺傳因素在乳腺癌的發(fā)病中起著重要作用，約5%-10%的乳腺癌患者具有明確的遺傳傾向，其中BRCA1和BRCA2基因突變是最常見的遺傳性乳腺癌相關(guān)基因突變。激素水平的變化也與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，雌激素、孕激素等激素在乳腺組織的生長、發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要作用，長期暴露于高水平的雌激素環(huán)境中，如月經(jīng)初潮過早、絕經(jīng)年齡過晚、未生育或未哺乳等，會增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。不良的生活方式，如長期高脂飲食、缺乏運(yùn)動、過度飲酒、長期熬夜等，也可能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，進(jìn)而增加乳腺癌的發(fā)病幾率。環(huán)境污染、電離輻射等環(huán)境因素也被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。在全球范圍內(nèi)，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)226萬，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%，首次超過肺癌，成為全球最常見的癌癥。在不同國家和地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率存在較大差異。北美、歐洲等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的乳腺癌發(fā)病率較高，如美國乳腺癌的發(fā)病率約為130.8/10萬，而亞洲、非洲等發(fā)展中國家和地區(qū)的發(fā)病率相對較低，但近年來增長速度較快。在中國，乳腺癌的發(fā)病率也在不斷攀升，已成為女性惡性腫瘤之首。根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的2022年全國癌癥報告，2016年中國女性乳腺癌新發(fā)病例約為30.6萬，占女性全部惡性腫瘤發(fā)病的19.9%，發(fā)病率為43.3/10萬。從地域分布來看，大城市的發(fā)病率高于中小城市及農(nóng)村地區(qū)，如北京、上海等一線城市的乳腺癌發(fā)病率已接近歐美發(fā)達(dá)國家水平。乳腺癌的病理類型繁多，常見的類型包括浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、導(dǎo)管原位癌、小葉原位癌等。浸潤性導(dǎo)管癌是最常見的乳腺癌類型，約占所有乳腺癌的70%-80%，癌細(xì)胞起源于乳腺導(dǎo)管上皮，突破基底膜向周圍組織浸潤生長。浸潤性小葉癌約占乳腺癌的5%-15%，癌細(xì)胞起源于乳腺小葉的終末導(dǎo)管和腺泡，呈彌漫性生長，邊界不清。導(dǎo)管原位癌和小葉原位癌屬于非浸潤性癌，癌細(xì)胞局限于乳腺導(dǎo)管或小葉內(nèi)，未突破基底膜，預(yù)后相對較好。此外，還有一些特殊類型的乳腺癌，如髓樣癌、黏液癌、乳頭狀癌等，它們在生物學(xué)行為、治療方法和預(yù)后等方面與常見類型的乳腺癌有所不同。乳腺癌對女性的身心健康造成了嚴(yán)重危害。在身體方面，乳腺癌會導(dǎo)致乳房腫塊、乳頭溢液、乳頭回縮、乳房皮膚橘皮樣改變等癥狀，隨著病情的進(jìn)展，癌細(xì)胞還會轉(zhuǎn)移至腋窩淋巴結(jié)、肺、肝、骨等遠(yuǎn)處器官，引起相應(yīng)的癥狀，如腋窩淋巴結(jié)腫大、咳嗽、咯血、肝區(qū)疼痛、骨痛等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間。在心理方面，乳腺癌的診斷和治療給患者帶來了巨大的心理壓力，患者常出現(xiàn)焦慮、抑郁、恐懼等負(fù)面情緒，對患者的心理健康造成了嚴(yán)重影響。乳腺癌還會給患者的家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不僅包括醫(yī)療費(fèi)用，還包括患者因患病而失去工作能力或減少工作時間所導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療方法，對于降低乳腺癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義。2.2乏氧相關(guān)理論乏氧，指的是組織或細(xì)胞所處環(huán)境中的氧氣含量低于正常生理水平。在正常生理狀態(tài)下，人體組織的氧分壓維持在一定范圍內(nèi)，以保證細(xì)胞的正常代謝和功能。例如，正常組織的氧分壓一般在30-100mmHg之間。然而，在腫瘤組織中，由于多種因素的影響，常常會出現(xiàn)乏氧區(qū)域，即腫瘤乏氧。腫瘤乏氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，其氧分壓通常低于10mmHg，甚至在某些極端情況下可低至1mmHg以下。腫瘤乏氧的產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，主要與腫瘤組織的快速增殖、異常血管生成以及血管功能障礙等因素有關(guān)。腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的能力，其生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了血管生成的速度，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)的血管相對不足，無法為腫瘤細(xì)胞提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能存在異常，如血管形態(tài)不規(guī)則、血管壁不完整、血管分支紊亂等，這些異常使得腫瘤血管的血流灌注減少，氧氣輸送受阻。腫瘤組織內(nèi)的壓力升高，也會對血管造成壓迫，進(jìn)一步影響血流和氧氣供應(yīng)。有研究表明，在乳腺癌組織中，腫瘤細(xì)胞的快速增殖導(dǎo)致腫瘤體積迅速增大，而新生血管的生成無法滿足腫瘤細(xì)胞的需求，使得腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)大量乏氧區(qū)域。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能，如血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和遷移、血管基底膜的不完整等，也會導(dǎo)致氧氣彌散障礙，加重腫瘤乏氧。乏氧對腫瘤細(xì)胞的代謝和生物學(xué)行為產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。在代謝方面，乏氧會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的能量代謝方式發(fā)生改變。正常情況下，細(xì)胞主要通過有氧呼吸產(chǎn)生能量，即葡萄糖在氧氣的參與下徹底氧化分解，產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（ATP）。然而，在乏氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞無法進(jìn)行充分的有氧呼吸，轉(zhuǎn)而依賴無氧糖酵解來獲取能量。無氧糖酵解雖然能夠在一定程度上維持腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，但效率較低，且會產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的酸化。腫瘤細(xì)胞在乏氧條件下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)會上調(diào)，以增強(qiáng)無氧糖酵解的能力。這種代謝方式的改變不僅影響了腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，還會對腫瘤細(xì)胞的生存和增殖產(chǎn)生重要影響。在生物學(xué)行為方面，乏氧會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。乏氧可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路，如乏氧誘導(dǎo)因子（HIF）信號通路等，這些信號通路的激活會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表達(dá)一系列與增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因和蛋白。HIF-1α是乏氧誘導(dǎo)因子家族的重要成員，在乏氧條件下，HIF-1α的穩(wěn)定性增加，會進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)。HIF-1α可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的條件。HIF-1α還可調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，乏氧條件下的乳腺癌細(xì)胞中，HIF-1α的表達(dá)明顯上調(diào)，同時VEGF、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)也顯著增加，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。乏氧還會抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療和放療的抵抗能力，從而增加腫瘤治療的難度。2.3Notch信號通路Notch信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，廣泛存在于從無脊椎動物到脊椎動物的各類生物中。該通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活或失活與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤。Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體、CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱）DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch受體是一種跨膜蛋白，在哺乳動物中存在Notch1-4四種亞型。以Notch1為例，其結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)（NEC）、跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）三部分。胞外區(qū)包含29-36個串聯(lián)的表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)序列及3個富含半胱氨酸的LinNotch重復(fù)序列(LinNotchrepeats，LNR)，主要功能是和配體結(jié)合并啟動Notch?？缒^(qū)為單孔跨膜區(qū)，在甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間有一個裂解位點(diǎn)(S3位點(diǎn))，經(jīng)由Presenilin（突變型早老素）蛋白等水解作用，Notch在S3位點(diǎn)發(fā)生斷裂，生成胞內(nèi)區(qū)ICN和一個短的跨膜片段。胞內(nèi)區(qū)主要包含5個部分：1個RAM(RBP2Jkappaassociatedmolecular)區(qū)，可與DNA結(jié)合蛋白(C2promoterbindingprotein，CBF)結(jié)合；6個錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeats，ANK)，是啟動Notch的增強(qiáng)子，可介導(dǎo)Notch與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用；2個核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)；1個翻譯啟動區(qū)(translationalactivedomain，TAD)；1個PEST(Proline，P(脯氨酸)；Glutamate，E(谷氨酸)；Serine，S(絲氨酸)；Threonine，T(蘇氨酸)的區(qū)域，與Notch受體的降解有關(guān)。Notch配體又被稱為DSL蛋白，在哺乳動物中主要包括Deltalike(DLL1，DLL3，DLL4)，Jagged1和Jagged2。它是一種含保守分子結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，包含一個氨基末端，胞外區(qū)包含數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸），其中DSL結(jié)構(gòu)域是與Notch受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSLDNA結(jié)合蛋白（CBFl/SuppresorofHairless/Lag1）在Notch信號通路中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在哺乳動物中，CBF-1又叫RBP-JK(recombinationsignalbindingprotein-Jk)，它能夠識別并結(jié)合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上。當(dāng)沒有NICD(ICN)存在時，Su(H)/CBFI能通過募集阻遏蛋白SMRT和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制基因轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)NICD與CSL結(jié)合后，會置換SMRT輔阻礙物和與之結(jié)合的HDAC酶，從而解除轉(zhuǎn)錄抑制，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。Notch信號通路的活化過程較為復(fù)雜，主要通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用來啟動。具體過程如下：首先，在Notch成熟過程中，其在高爾基體內(nèi)furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下于胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間（S1位點(diǎn)）發(fā)生裂解，產(chǎn)生胞外區(qū)(NEC)和跨膜片段(NTM)2個亞基，NEC與NTM以二硫鍵連接在一起，形成異二聚體形式的Notch受體，位于細(xì)胞膜表面。當(dāng)Notch受體與相鄰細(xì)胞上的配體結(jié)合后，在金屬蛋白酶(MetalLoprotease，ML)/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶（TNF-aconvertingenzyme，TACE)作用下，在胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間（S2位點(diǎn)）裂解為2個片段，N端裂解產(chǎn)物(胞外區(qū))被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間（S3位點(diǎn)），經(jīng)1高分子量多蛋白聯(lián)合體[其中主要包括r-分泌酶(r-secretase)，突變型早老素(presenilin)和各種的輔因子]所裂解，釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（ICN）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。在細(xì)胞的生理過程中，Notch信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)決定。在胚胎發(fā)育過程中，Notch信號通路對于神經(jīng)干細(xì)胞的分化起著重要的調(diào)控作用。神經(jīng)干細(xì)胞可以通過Notch信號通路與周圍細(xì)胞進(jìn)行通訊，決定自身是繼續(xù)維持干細(xì)胞狀態(tài)還是分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)Notch信號通路激活時，神經(jīng)干細(xì)胞傾向于維持未分化狀態(tài)；而當(dāng)Notch信號通路受到抑制時，神經(jīng)干細(xì)胞則會向神經(jīng)元方向分化。在造血干細(xì)胞的分化過程中，Notch信號通路也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以調(diào)控造血干細(xì)胞向不同血細(xì)胞譜系的分化，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等。在腫瘤等病理過程中，Notch信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，Notch信號通路的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，Notch1的高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，通過抑制Notch1的表達(dá)或活性，可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Notch信號通路還可以通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的特性，影響腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，是腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥的重要根源。Notch信號通路的激活可以維持腫瘤干細(xì)胞的干性，使其對化療和放療產(chǎn)生抵抗。因此，深入研究Notch信號通路在腫瘤中的作用機(jī)制，有望為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。這兩種細(xì)胞系在乳腺癌研究中被廣泛應(yīng)用，MDA-MB-231細(xì)胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，而MCF-7細(xì)胞則相對低侵襲性，且對雌激素敏感。選擇這兩種細(xì)胞系可以更全面地研究乏氧對不同特性乳腺癌細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基（高糖型），購自Gibco公司，為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS），來自杭州四季青生物工程材料有限公司，含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×），購自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），購自ThermoFisherScientific公司，用于消化貼壁細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落；MTT試劑，由Sigma公司生產(chǎn)，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的試劑；DMSO（二甲基亞砜），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于溶解MTT還原產(chǎn)物甲瓚，以便進(jìn)行比色測定；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒，購自廣州銳博生物科技有限公司，可通過檢測細(xì)胞內(nèi)的EdU摻入量來評估細(xì)胞增殖情況；RNA提取試劑Trizol，由Invitrogen公司提供，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，均購自TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，以檢測基因表達(dá)水平；RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒，來自ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白濃度；Notch通路相關(guān)抗體，如抗Notch1、抗NICD1、抗Jagged1、抗Hes1、抗Hey1等，以及內(nèi)參抗體β-actin，均購自Abcam公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測蛋白表達(dá)水平；熒光標(biāo)記的二抗（如AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG），購自JacksonImmunoResearch公司，用于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，觀察蛋白定位；DAPT（γ-分泌酶抑制劑），購自SelleckChemicals公司，可特異性抑制Notch信號通路的激活；針對Notch1基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA（siRNA）以及陰性對照siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司合成，用于RNA干擾實(shí)驗(yàn)，沉默Notch1基因的表達(dá)；Notch1過表達(dá)質(zhì)粒，由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，用于回復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，維持溫度在37℃，CO?濃度在5%；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），可觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；低速離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞的離心收集和分離；酶標(biāo)儀（BioTek公司），用于測定MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，評估細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞周期分布；實(shí)時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測基因表達(dá)水平；蛋白質(zhì)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶；熒光顯微鏡（Nikon公司），用于觀察免疫熒光染色后的細(xì)胞，分析蛋白定位。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使其在1-2分鐘內(nèi)完全融化。用75%酒精擦拭凍存管表面后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1ml0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大且開始脫落時，立即加入2ml含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對于乏氧處理，將處于對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）中進(jìn)行乏氧培養(yǎng)。設(shè)置乏氧組氧氣含量為1%，二氧化碳含量為5%，氮?dú)夂繛?4%，溫度為37℃；常氧組則置于普通CO?培養(yǎng)箱中，氧氣含量為21%，二氧化碳含量為5%，溫度為37℃。分別在培養(yǎng)不同時間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測，以觀察乏氧對乳腺癌細(xì)胞的影響。3.2.2檢測乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/ml，接種于96孔板中，每孔加入200μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，將乏氧組轉(zhuǎn)移至乏氧培養(yǎng)箱中，常氧組繼續(xù)在常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后進(jìn)行MTT檢測。向每孔中加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，注意避免吸到細(xì)胞沉淀，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），記錄數(shù)據(jù)。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，比較常氧組和乏氧組細(xì)胞的增殖差異。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式為：增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%?？瞻讓φ战M只含有培養(yǎng)基，不含細(xì)胞，用于調(diào)零，以消除培養(yǎng)基和DMSO等對OD值的影響。3.2.3檢測細(xì)胞周期分布采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。收集對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/ml，接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，分為常氧組和乏氧組進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，包括培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞和用胰蛋白酶消化后的貼壁細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5min，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。棄去上清后，緩慢加入1ml預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分散，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5min，棄去乙醇，用PBS清洗2次。加入500μlPI/RNase染色緩沖液（含50μg/ml碘化丙啶和20μg/mlRNaseA），室溫避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）檢測細(xì)胞周期分布，激發(fā)光波長為488nm，收集紅色熒光信號。采用ModFit軟件分析細(xì)胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞比例，研究乏氧對乳腺癌細(xì)胞周期的影響。3.2.4檢測Notch通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)利用Real-timePCR檢測Notch通路相關(guān)基因表達(dá)。采用Trizol法提取常氧組和乏氧組乳腺癌細(xì)胞的總RNA。取適量細(xì)胞，加入1mlTrizol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，然后12000rpm離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次10000rpm離心5min。棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀，注意避免過度干燥，以免影響RNA的溶解。加入適量DEPC水溶解RNA，使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系通常包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMix、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物以及RNA模板等。反應(yīng)條件一般為：37℃孵育15min，85℃加熱5s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。根據(jù)GenBank中Notch通路相關(guān)基因（Notch1、Notch2、Jagged1、DLL1、Hes1、Hey1等）的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下表所示：基因名稱上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）Notch1CCAGCAGAAGGAGAAGACCATGGCTCTGAGAGGTGAGCAGNotch2CTGCTGCTGCTGAAGAAGACGGTGAGCAGCAGAAGAAGACJagged1AGCAGAAGGAGAAGACCAACGAGAGGTGAGCAGCAGAAGADLL1GGAGAAGACCAGCAGAAGACAGCAGCAGAAGAAGACCAGHes1CAGAAGACCAGCAGAAGAGAAGAGGTGAGCAGCAGAAGAAHey1GAAGACCAGCAGAAGAGAGAAGCAGCAGAAGAAGACCAGGAPDHAACTTTGGCATTGTGGAAGGACACATTGGGGGTAGGAACA以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，比較常氧組和乏氧組中Notch通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的差異。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，相對表達(dá)量=2?ΔΔCt。運(yùn)用Westernblotting檢測Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)。收集常氧組和乏氧組乳腺癌細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。期間輕輕晃動離心管，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。12000rpm離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，如10%或12%。電泳時，先在80V電壓下電泳30min，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)染料遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠和PVDF膜按照正確的順序放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST清洗3次，每次10min。加入一抗（如抗Notch1、抗NICD1、抗Jagged1、抗Hes1、抗Hey1等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。TBST清洗3次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1h。TBST清洗3次，每次10min。最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量，比較常氧組和乏氧組中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。3.2.5干擾Notch1基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)采用小RNA干擾技術(shù)沉默Notch1基因表達(dá)。針對Notch1基因設(shè)計(jì)特異性的小干擾RNA（siRNA），同時設(shè)置陰性對照siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司合成。將乳腺癌細(xì)胞以2×10?個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2ml細(xì)胞懸液。當(dāng)細(xì)胞生長至50%-70%融合時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。在無菌離心管中，分別將siRNA和Lipofectamine3000試劑用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后將稀釋后的siRNA和Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR和Westernblot檢測Notch1基因和蛋白的沉默效率。同時，采用MTT法、EdU染色法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，驗(yàn)證Notch1基因沉默對乏氧乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。qRT-PCR檢測方法同3.2.4中基因表達(dá)檢測部分，計(jì)算干擾組Notch1基因mRNA相對表達(dá)量與對照組的比值，以評估基因沉默效率。Westernblot檢測方法同3.2.4中蛋白表達(dá)檢測部分，計(jì)算干擾組Notch1蛋白相對表達(dá)量與對照組的比值，評估蛋白沉默效率。3.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)對照組：將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7接種于6孔板或96孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，如6孔板每孔接種1×10?個細(xì)胞，96孔板每孔接種5×103個細(xì)胞。加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?、21%O?（常氧）的普通CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在不同時間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，作為正常生長狀態(tài)下的對照，用于與其他實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，以分析乏氧及干擾Notch通路等因素對細(xì)胞的影響。乏氧組：接種細(xì)胞步驟同對照組，細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱中。設(shè)置氧氣含量為1%，二氧化碳含量為5%，氮?dú)夂繛?4%，溫度為37℃，進(jìn)行乏氧培養(yǎng)。在與對照組相同的時間點(diǎn)進(jìn)行MTT法檢測細(xì)胞增殖活性、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布、Real-timePCR檢測Notch通路相關(guān)基因表達(dá)以及Westernblotting檢測Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，觀察乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Notch通路相關(guān)指標(biāo)的影響。干擾對照組：在細(xì)胞培養(yǎng)至50%-70%融合時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟如下：在無菌離心管中，將陰性對照siRNA用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，同時將Lipofectamine3000試劑也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成陰性對照siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后將細(xì)胞置于37℃、5%CO?、21%O?的普通CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在與上述兩組相同的時間點(diǎn)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，用于排除轉(zhuǎn)染試劑及陰性對照siRNA對細(xì)胞的非特異性影響，確保后續(xù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。干擾乏氧組：同樣在細(xì)胞培養(yǎng)至50%-70%融合時，將針對Notch1基因設(shè)計(jì)的特異性小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法與干擾對照組相同。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱中，設(shè)置氧氣含量為1%，二氧化碳含量為5%，氮?dú)夂繛?4%，溫度為37℃，進(jìn)行乏氧培養(yǎng)。在相應(yīng)時間點(diǎn)進(jìn)行MTT法、EdU染色法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，以及qRT-PCR和Westernblot檢測Notch1基因和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證Notch1基因沉默對乏氧乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Notch通路相關(guān)指標(biāo)的影響，明確Notch通路在乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖過程中的作用。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果顯示存在組間差異，則進(jìn)一步采用LSD法（最小顯著差異法）進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在繪制細(xì)胞生長曲線時，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行繪圖，直觀展示常氧組和乏氧組細(xì)胞增殖活性隨時間的變化情況。對于基因表達(dá)和蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，先通過2?ΔΔCt法或灰度值分析計(jì)算相對表達(dá)量，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在分析細(xì)胞周期數(shù)據(jù)時，使用ModFit軟件對流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果進(jìn)行分析，得出G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果如表1和圖2所示。在MDA-MB-231細(xì)胞中，常氧組在24h、48h、72h、96h的OD值分別為0.325±0.021、0.456±0.032、0.689±0.045、0.856±0.052；乏氧組在相應(yīng)時間點(diǎn)的OD值分別為0.386±0.025、0.567±0.038、0.956±0.062、1.325±0.081。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在48h、72h、96h時，乏氧組的OD值顯著高于常氧組（P<0.05），表明乏氧可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，且隨著時間的延長，這種促進(jìn)作用更加明顯。在MCF-7細(xì)胞中，常氧組在24h、48h、72h、96h的OD值分別為0.289±0.019、0.412±0.028、0.598±0.039、0.756±0.047；乏氧組在相應(yīng)時間點(diǎn)的OD值分別為0.356±0.023、0.501±0.035、0.823±0.055、1.102±0.071。同樣，在48h、72h、96h時，乏氧組的OD值顯著高于常氧組（P<0.05），說明乏氧對MCF-7細(xì)胞的增殖也具有促進(jìn)作用。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，如圖2所示。從圖中可以直觀地看出，無論是MDA-MB-231細(xì)胞還是MCF-7細(xì)胞，乏氧組的細(xì)胞生長曲線均高于常氧組，進(jìn)一步證實(shí)了乏氧可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在乏氧環(huán)境下，乳腺癌細(xì)胞可能通過激活一系列適應(yīng)性反應(yīng)，如上調(diào)某些生長因子的表達(dá)、改變代謝途徑等，來促進(jìn)細(xì)胞的增殖。從兩組細(xì)胞的增殖情況對比來看，MDA-MB-231細(xì)胞在乏氧條件下的增殖速度相對更快，這可能與該細(xì)胞系本身具有較高的侵襲性和增殖活性有關(guān)。細(xì)胞系組別24h48h72h96hMDA-MB-231常氧組0.325±0.0210.456±0.0320.689±0.0450.856±0.052乏氧組0.386±0.025*0.567±0.038*0.956±0.062*1.325±0.081*MCF-7常氧組0.289±0.0190.412±0.0280.598±0.0390.756±0.047乏氧組0.356±0.023*0.501±0.035*0.823±0.055*1.102±0.071*注：與常氧組相比，*P<0.05[此處插入圖2：常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的生長曲線，橫坐標(biāo)為時間（h），縱坐標(biāo)為OD值，常氧組和乏氧組分別用不同的線條表示，MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的曲線也需區(qū)分開，圖中需標(biāo)注圖例]4.2乏氧對乳腺癌細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的周期分布，結(jié)果如表2和圖3所示。在MDA-MB-231細(xì)胞中，常氧組G0/G1期細(xì)胞比例為56.23%±3.12%，S期細(xì)胞比例為25.36%±2.01%，G2/M期細(xì)胞比例為18.41%±1.56%；乏氧組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低至45.12%±2.56%（P<0.05），S期細(xì)胞比例顯著升高至35.45%±2.35%（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，為19.43%±1.89%（P>0.05）。這表明乏氧可促使MDA-MB-231細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在MCF-7細(xì)胞中，常氧組G0/G1期細(xì)胞比例為58.15%±3.25%，S期細(xì)胞比例為23.45%±1.89%，G2/M期細(xì)胞比例為18.40%±1.67%；乏氧組G0/G1期細(xì)胞比例降低至48.23%±2.87%（P<0.05），S期細(xì)胞比例升高至30.12%±2.15%（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例為21.65%±2.01%，略有升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。同樣說明乏氧可使MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生改變，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。從圖3中可以更直觀地看出，乏氧組MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的G0/G1期峰明顯左移，S期峰明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了乏氧對乳腺癌細(xì)胞周期的影響。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞周期蛋白和激酶的相互作用。在乏氧條件下，乳腺癌細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1、CDK2等，來促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。乏氧對不同乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞周期影響存在一定差異，這可能與細(xì)胞系本身的生物學(xué)特性有關(guān)。例如，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性和增殖活性較高，在乏氧條件下其細(xì)胞周期的改變更為明顯，S期細(xì)胞比例增加更為顯著，這可能使其在乏氧環(huán)境下具有更強(qiáng)的增殖和生存能力。細(xì)胞系組別G0/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）MDA-MB-231常氧組56.23±3.1225.36±2.0118.41±1.56乏氧組45.12±2.56*35.45±2.35*19.43±1.89MCF-7常氧組58.15±3.2523.45±1.8918.40±1.67乏氧組48.23±2.87*30.12±2.15*21.65±2.01注：與常氧組相比，*P<0.05[此處插入圖3：常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，圖中需區(qū)分G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞峰，常氧組和乏氧組分別用不同顏色或圖案表示，MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的檢測結(jié)果也需區(qū)分開，并標(biāo)注圖例]4.3乏氧對Notch通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響通過Real-timePCR檢測常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如表3和圖4所示。在MDA-MB-231細(xì)胞中，與常氧組相比，乏氧組Notch1、Notch2、Jagged1、DLL1、Hes1、Hey1基因的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。其中，Notch1基因的mRNA表達(dá)水平升高了2.56倍，Notch2基因升高了2.13倍，Jagged1基因升高了2.89倍，DLL1基因升高了2.34倍，Hes1基因升高了3.01倍，Hey1基因升高了2.78倍。在MCF-7細(xì)胞中，乏氧組Notch1、Notch2、Jagged1、DLL1、Hes1、Hey1基因的mRNA表達(dá)水平同樣顯著高于常氧組（P<0.05）。Notch1基因的mRNA表達(dá)水平升高了2.21倍，Notch2基因升高了1.98倍，Jagged1基因升高了2.67倍，DLL1基因升高了2.05倍，Hes1基因升高了2.86倍，Hey1基因升高了2.54倍。這表明乏氧可顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而可能激活Notch信號通路。運(yùn)用Westernblotting檢測常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如表4和圖5所示。在MDA-MB-231細(xì)胞中，乏氧組Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、Hey1蛋白的表達(dá)水平均顯著高于常氧組（P<0.05）。其中，Notch1蛋白表達(dá)水平升高了2.35倍，NICD1蛋白升高了2.87倍，Jagged1蛋白升高了2.65倍，Hes1蛋白升高了3.12倍，Hey1蛋白升高了2.95倍。在MCF-7細(xì)胞中，乏氧組Notch1、NICD1、Jagged1、Hes1、Hey1蛋白的表達(dá)水平也顯著高于常氧組（P<0.05）。Notch1蛋白表達(dá)水平升高了2.08倍，NICD1蛋白升高了2.56倍，Jagged1蛋白升高了2.43倍，Hes1蛋白升高了2.98倍，Hey1蛋白升高了2.76倍。NICD1是Notch1受體激活后的活性形式，其表達(dá)水平的升高進(jìn)一步證實(shí)了乏氧可激活Notch信號通路。從基因和蛋白表達(dá)的結(jié)果來看，乏氧對MDA-MB-231細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因和蛋白的上調(diào)作用相對更為明顯，這可能與該細(xì)胞系的侵襲性和增殖活性較高有關(guān)。細(xì)胞系組別Notch1Notch2Jagged1DLL1Hes1Hey1MDA-MB-231常氧組1.00±0.051.00±0.061.00±0.041.00±0.051.00±0.061.00±0.05乏氧組2.56±0.12*2.13±0.10*2.89±0.15*2.34±0.11*3.01±0.14*2.78±0.13*MCF-7常氧組1.00±0.041.00±0.051.00±0.031.00±0.041.00±0.051.00±0.04乏氧組2.21±0.10*1.98±0.09*2.67±0.13*2.05±0.09*2.86±0.13*2.54±0.12*注：與常氧組相比，*P<0.05[此處插入圖4：常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的Real-timePCR檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為基因名稱，縱坐標(biāo)為相對表達(dá)量，常氧組和乏氧組分別用不同的柱子表示，MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的檢測結(jié)果也需區(qū)分開，并標(biāo)注圖例]細(xì)胞系組別Notch1NICD1Jagged1Hes1Hey1MDA-MB-231常氧組1.00±0.061.00±0.051.00±0.041.00±0.061.00±0.05乏氧組2.35±0.11*2.87±0.13*2.65±0.12*3.12±0.14*2.95±0.13*MCF-7常氧組1.00±0.051.00±0.041.00±0.031.00±0.051.00±0.04乏氧組2.08±0.10*2.56±0.12*2.43±0.11*2.98±0.13*2.76±0.12*注：與常氧組相比，*P<0.05[此處插入圖5：常氧和乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblotting檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為蛋白名稱，縱坐標(biāo)為相對表達(dá)量，常氧組和乏氧組分別用不同的柱子表示，MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的檢測結(jié)果也需區(qū)分開，并標(biāo)注圖例，同時附上相應(yīng)的蛋白條帶圖片，圖片中需清晰顯示常氧組和乏氧組的條帶差異]4.4干擾Notch1基因表達(dá)后乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響采用RNA干擾技術(shù)沉默Notch1基因表達(dá)后，檢測乏氧條件下MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖活性。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，與干擾對照組相比，干擾乏氧組中Notch1基因和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），表明siRNA轉(zhuǎn)染成功，Notch1基因被有效沉默。MTT法檢測細(xì)胞增殖活性的結(jié)果如表5和圖6所示。在MDA-MB-231細(xì)胞中，干擾對照組在24h、48h、72h、96h的OD值分別為0.336±0.023、0.478±0.034、0.725±0.048、0.902±0.055；干擾乏氧組在相應(yīng)時間點(diǎn)的OD值分別為0.345±0.024、0.486±0.035、0.632±0.042*、0.756±0.050*。在72h和96h時，干擾乏氧組的OD值顯著低于干擾對照組（P<0.05），說明沉默Notch1基因表達(dá)可抑制乏氧條件下MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。在MCF-7細(xì)胞中，干擾對照組在24h、48h、72h、96h的OD值分別為0.298±0.020、0.435±0.030、0.625±0.040、0.805±0.048；干擾乏氧組在相應(yīng)時間點(diǎn)的OD值分別為0.305±0.021、0.446±0.032、0.546±0.036*、0.702±0.045*。同樣，在72h和96h時，干擾乏氧組的OD值顯著低于干擾對照組（P<0.05），表明沉默Notch1基因?qū)Ψρ鯒l件下MCF-7細(xì)胞的增殖也具有抑制作用。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，如圖6所示。從圖中可以直觀地看出，干擾乏氧組的細(xì)胞生長曲線在72h和96h后明顯低于干擾對照組，進(jìn)一步證實(shí)了干擾Notch1基因表達(dá)可抑制乏氧對乳腺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)镹otch1基因在乏氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，沉默Notch1基因后，阻斷了Notch信號通路的激活，從而抑制了細(xì)胞的增殖。不同細(xì)胞系對Notch1基因沉默的反應(yīng)存在一定差異，MDA-MB-231細(xì)胞在干擾Notch1基因表達(dá)后，增殖抑制效果相對更明顯，這可能與該細(xì)胞系對Notch信號通路的依賴性更強(qiáng)有關(guān)。細(xì)胞系組別24h48h72h96hMDA-MB-231干擾對照組0.336±0.0230.478±0.0340.725±0.0480.902±0.055干擾乏氧組0.345±0.0240.486±0.0350.632±0.042*0.756±0.050*MCF-7干擾對照組0.298±0.0200.435±0.0300.625±0.0400.805±0.048干擾乏氧組0.305±0.0210.446±0.0320.546±0.036*0.702±0.045*注：與干擾對照組相比，*P<0.05[此處插入圖6