仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的高效表達與功能驗證研究一、引言1.1研究背景與意義仙臺病毒（SendaiVirus），又稱鼠副流感病毒1型，是副黏病毒科呼吸道病毒屬的成員，其病毒粒子呈多形性，直徑為150-250nm，具有包膜。自1953年在日本仙臺市首次被分離得到后，仙臺病毒逐漸進入科研人員的視野。它主要感染嚙齒動物，如小鼠、大鼠等，但也被發(fā)現可感染人類。在動物實驗設施中，仙臺病毒的感染較為棘手，對實驗動物的健康和實驗結果的準確性產生嚴重威脅。例如，感染仙臺病毒的小鼠會出現明顯的肺炎癥狀，包括呼吸困難、牙齒打顫等，幼齡動物甚至會死亡；大鼠感染后雖一般不表現明顯臨床癥狀，但可能出現繁殖障礙。此外，潛在感染還會干擾動物機體的正常生理功能，導致實驗數據的偏差，影響科研工作的可靠性。對于人類而言，仙臺病毒也可能引發(fā)呼吸道感染，尤其是免疫力低下的人群，增加了健康風險。因此，有效檢測和預防仙臺病毒感染成為當務之急。在病毒檢測與防控領域，利用病毒自身的重要抗原進行間接抗原診斷和免疫是一種重要策略?？乖酁椴《揪幋a的結構蛋白，其中仙臺病毒的N基因所編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）具有關鍵作用。N蛋白不僅在病毒的組裝和基因組保護中發(fā)揮重要功能，還具有良好的抗原性與反應原性。通過對N基因進行研究和表達，可以為仙臺病毒的檢測提供特異性抗原，用于開發(fā)靈敏、準確的診斷方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光檢測等，有助于早期發(fā)現病毒感染，及時采取防控措施。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)（BaculovirusExpressionVectorSystem，BEVS）是以昆蟲桿狀病毒作為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細胞作為受體的表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，在基因工程和生物制藥領域備受青睞。從安全性角度來看，桿狀病毒主要感染昆蟲，對人畜無毒害，降低了生物安全風險。在蛋白表達方面，昆蟲細胞與哺乳動物細胞對重組蛋白的翻譯及翻譯后修飾模式和能力相似，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除及肽段的切割和分解等，使得表達出的重組蛋白生物活性與天然蛋白相似。此外，桿狀病毒基因柔韌性強，能容納較大片段的外源DNA插入，且昆蟲細胞可進行懸浮培養(yǎng)，容易在無血清培養(yǎng)基中存活，便于實現大規(guī)模低成本生產。將仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達，能夠充分利用該系統(tǒng)的優(yōu)勢，獲得大量具有生物活性的重組N蛋白。這些重組蛋白不僅可以用于開發(fā)高效的檢測試劑，提高仙臺病毒檢測的準確性和效率，還可能為疫苗的研發(fā)提供關鍵的免疫原，為預防仙臺病毒感染開辟新途徑。綜上所述，研究仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達具有重要的理論意義和實際應用價值，有望為仙臺病毒的防控提供有力的技術支持和物質基礎。1.2仙臺病毒概述仙臺病毒在病毒分類學中屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）呼吸道病毒屬（Respirovirus），其病毒粒子呈現多形性，多數情況下近似球形，直徑范圍在150-250nm。這種多形性使得仙臺病毒在形態(tài)觀察上具有一定的復雜性，但也反映了其在不同環(huán)境和感染階段的適應性。從結構組成來看，仙臺病毒具有包膜，這層包膜對于病毒的感染和傳播起著關鍵作用。包膜主要由脂質雙分子層構成，來源于宿主細胞膜，在病毒出芽釋放過程中獲得。包膜上鑲嵌著兩種重要的糖蛋白，分別是血凝素-神經氨酸酶（Hemagglutinin-Neuraminidase，HN）和融合蛋白（Fusionprotein，F）。HN蛋白具有兩種酶活性，即血凝素活性和神經氨酸酶活性。血凝素活性能夠識別并結合宿主細胞表面含唾液酸的受體，介導病毒與宿主細胞的初始附著。在一項關于病毒吸附機制的研究中，通過表面等離子共振技術發(fā)現，HN蛋白與唾液酸受體之間存在特異性的相互作用，其結合常數達到了10??M級別，這種高親和力保證了病毒能夠快速、穩(wěn)定地吸附到宿主細胞表面。神經氨酸酶活性則可以水解宿主細胞表面的唾液酸殘基，破壞病毒與細胞表面受體的結合，促進病毒從感染細胞中釋放出來，以便進行新一輪的感染。例如，在病毒感染后期，當子代病毒組裝完成后，HN蛋白的神經氨酸酶活性被激活，使得病毒能夠順利脫離宿主細胞，繼續(xù)感染周圍的細胞。F蛋白則在病毒與宿主細胞膜的融合過程中發(fā)揮核心作用。F蛋白最初以無活性的前體形式（F0）合成，在宿主細胞蛋白酶的作用下，F0被切割成具有活性的F1和F2兩個亞基。F1亞基的N端具有一段高度疏水的融合肽，在病毒與宿主細胞接近時，融合肽插入宿主細胞膜，通過構象變化拉近病毒包膜與宿主細胞膜的距離，最終實現兩者的融合，使病毒的核衣殼進入宿主細胞。研究表明，F蛋白的構象變化是一個高度動態(tài)且有序的過程，涉及多個結構域的協(xié)同作用，通過冷凍電鏡技術解析F蛋白在不同狀態(tài)下的結構，發(fā)現其在融合過程中經歷了從預融合狀態(tài)到融合后狀態(tài)的顯著轉變，這種結構變化是病毒感染的關鍵步驟。在病毒包膜的內層，是基質蛋白（Matrixprotein，M）。M蛋白在病毒粒子中形成一層緊密的結構，一方面與包膜相互作用，維持包膜的穩(wěn)定性和完整性；另一方面與病毒的核衣殼相互連接，在病毒組裝和出芽過程中發(fā)揮重要作用。有研究利用免疫熒光和免疫電鏡技術觀察到，M蛋白在病毒感染細胞的過程中，能夠聚集在細胞膜特定區(qū)域，引導核衣殼與細胞膜的結合，促進病毒粒子的形成和釋放。仙臺病毒的基因組為單鏈負義RNA，長度約為15,384個核苷酸。這一基因組結構決定了病毒的遺傳信息傳遞方式和復制策略。基因組從3'端到5'端依次排列著6個主要基因，分別編碼核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經氨酸酶（HN）和大蛋白（Largeprotein，L）。N基因編碼的N蛋白是病毒基因組RNA的主要結合蛋白。每個N蛋白單體能夠緊密結合6個核苷酸，將病毒基因組RNA包裹起來，形成核糖核蛋白復合物（Ribonucleoproteincomplex，RNP）。這種緊密的結合不僅保護了病毒基因組RNA免受核酸酶的降解，還為病毒的轉錄和復制提供了穩(wěn)定的模板。研究發(fā)現，N蛋白的結構中含有多個保守的結構域，其中RNA結合結構域具有高度的特異性，通過與RNA的堿基和磷酸骨架相互作用，實現對病毒基因組的精準識別和包裹。P基因除了編碼P蛋白外，還通過不同的閱讀框編碼C蛋白等其他非結構蛋白。P蛋白是病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）的重要亞基，與L蛋白共同組成具有活性的RdRp復合物。P蛋白在RdRp復合物中起到輔助和調節(jié)作用，它能夠與N蛋白-RNA復合物相互作用，招募L蛋白，啟動病毒基因組的轉錄和復制過程。此外，P蛋白還參與病毒的組裝和出芽過程，通過與M蛋白等其他病毒蛋白相互作用，協(xié)調病毒粒子的形成。L蛋白是RdRp復合物的催化亞基，具有多種酶活性，包括RNA聚合酶活性、甲基轉移酶活性和鳥苷酸轉移酶活性等。在病毒轉錄過程中，L蛋白以病毒基因組RNA為模板，合成正鏈mRNA，用于指導病毒蛋白的翻譯。在復制過程中，L蛋白先合成全長的正鏈RNA中間體，再以正鏈RNA為模板合成子代負鏈RNA基因組。L蛋白的這些酶活性對于病毒的遺傳信息傳遞和繁殖至關重要，其活性受到多種因素的調控，包括與其他病毒蛋白的相互作用以及宿主細胞內的環(huán)境因素等。綜上所述，仙臺病毒的形態(tài)結構和基因組組成緊密相關，各組成部分在病毒的生命周期中各司其職，協(xié)同完成病毒的感染、復制和傳播過程。1.3昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)（BaculovirusExpressionVectorSystem，BEVS）以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細胞為受體。該系統(tǒng)自20世紀80年代建立以來，憑借諸多優(yōu)勢在生命科學研究和生物技術產業(yè)中發(fā)揮著重要作用。桿狀病毒是一類雙鏈DNA病毒，其基因組大小通常在80-180kb之間。目前應用最廣泛的桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）。在自然狀態(tài)下，桿狀病毒主要感染昆蟲，對哺乳動物、植物和其他非昆蟲生物無致病性，這使得該表達系統(tǒng)在生物安全方面具有顯著優(yōu)勢，降低了潛在的生物風險，尤其適用于大規(guī)模生產生物制品。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的原理基于病毒基因表達調控機制。桿狀病毒基因組中存在一些強啟動子，如多角體蛋白（Polyhedrin，polh）基因啟動子和p10基因啟動子。在病毒感染昆蟲細胞的晚期，這些啟動子會啟動大量基因的表達，其中多角體蛋白基因啟動子的活性尤為強勁。在構建表達載體時，將外源基因（如仙臺病毒N基因）插入到桿狀病毒基因組中，使其受這些強啟動子的控制。以pFastBac系統(tǒng)為例，首先將目的基因克隆到供體質粒pFastBac上，該質粒含有Tn7轉座子元件和多角體蛋白基因啟動子。然后將重組供體質粒轉化到含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質粒（helper）的大腸桿菌DH10Bac中。在輔助質粒編碼的轉座酶作用下，Tn7轉座子攜帶目的基因轉座到Bacmid上的特定位置，形成重組Bacmid。提取重組Bacmid后，通過脂質體轉染法將其導入昆蟲細胞（如Sf9、Sf21細胞）。在昆蟲細胞內，重組Bacmid進行復制和轉錄，啟動外源基因的表達。隨著病毒的擴增和感染，大量的重組蛋白得以合成。與其他表達系統(tǒng)相比，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢。在蛋白翻譯后修飾方面，昆蟲細胞與哺乳動物細胞對重組蛋白的修飾模式和能力相似。例如，許多哺乳動物蛋白需要進行復雜的糖基化修飾才能具有完整的生物活性，昆蟲細胞能夠對重組蛋白進行類似的N-糖基化和O-糖基化修飾。研究表明，在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達的人源化抗體，其糖基化位點和糖鏈結構與天然抗體高度相似，使得抗體的抗原結合活性和免疫原性得以有效保持。此外，昆蟲細胞還能進行磷酸化、酰基化等修飾，保證了重組蛋白的正確折疊和功能發(fā)揮。在表達容量上，桿狀病毒基因柔韌性強，能容納較大片段的外源DNA插入。有研究成功將長達10kb的外源基因導入桿狀病毒基因組中并實現有效表達，這為表達一些結構復雜的蛋白提供了可能。從生產角度來看，昆蟲細胞可進行懸浮培養(yǎng)，容易在無血清培養(yǎng)基中存活，便于實現大規(guī)模低成本生產。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝，昆蟲細胞的培養(yǎng)密度可達到很高水平，從而提高重組蛋白的產量。例如，在生物反應器中進行昆蟲細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可實現重組蛋白的工業(yè)化生產，降低生產成本，滿足市場對大量重組蛋白的需求。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在多個領域得到了廣泛應用。在疫苗研發(fā)方面，該系統(tǒng)可用于生產多種病毒樣顆粒（Virus-likeparticles，VLPs）疫苗。VLPs是由病毒的結構蛋白組裝而成，其形態(tài)和結構與天然病毒相似，但不含有病毒的遺傳物質，因此具有良好的安全性。利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達流感病毒的血凝素（HA）、乙型肝炎病毒的表面抗原（HBsAg）等，可組裝成相應的VLPs疫苗。這些疫苗能夠誘導機體產生強烈的免疫反應，包括體液免疫和細胞免疫，為預防病毒感染提供了有效的手段。在生物制藥領域，許多重組蛋白藥物，如干擾素、生長因子等，也可通過昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)生產。這些重組蛋白藥物在治療多種疾病中發(fā)揮著重要作用，如干擾素用于抗病毒和抗腫瘤治療，生長因子用于促進組織修復和再生。此外，在基礎研究中，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)常用于表達和研究一些功能未知的蛋白，通過對重組蛋白的結構和功能分析，深入了解蛋白的生物學特性和作用機制。綜上所述，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)憑借其獨特的優(yōu)勢和廣泛的應用領域，為生命科學研究和生物技術產業(yè)的發(fā)展提供了有力的支持。1.4研究目的與內容本研究旨在利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，實現仙臺病毒N基因的高效表達，并對表達產物進行鑒定與分析，為仙臺病毒的檢測和防控提供物質基礎與技術支持。具體研究內容如下：仙臺病毒N基因的克隆與重組表達載體的構建：從感染仙臺病毒的雞胚中提取病毒基因組RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增N基因。將擴增得到的N基因克隆至pMD18-T載體中，進行測序驗證，確?；蛐蛄械臏蚀_性。隨后，將正確的N基因片段定向克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb中，構建重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N。通過藍白斑篩選和PCR鑒定等方法，篩選出含有目的基因的重組質粒，為后續(xù)的病毒重組和蛋白表達奠定基礎。重組桿狀病毒的制備與鑒定：將重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N轉化至含有桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10Bac中，利用大腸桿菌自身的同源重組機制，使目的基因整合到桿狀病毒基因組中，形成重組桿狀病毒rBacmid-N。通過藍白斑篩選和PCR鑒定，挑選出陽性重組桿狀病毒克隆。提取重組桿狀病毒的DNA，進行酶切鑒定和測序分析，進一步確認目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤。重組N蛋白在昆蟲細胞中的表達與分析：將鑒定正確的重組桿狀病毒rBacmid-N轉染至生長狀態(tài)良好的昆蟲細胞（如Sf9細胞）中，使病毒在昆蟲細胞內進行復制和轉錄，從而啟動N基因的表達。在不同時間點收集感染后的昆蟲細胞，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測重組N蛋白的表達情況，觀察蛋白表達條帶的大小和強度。對表達的特異性條帶進行Westernblot分析，使用特異性抗體檢測重組N蛋白，確定其是否為目的蛋白，并進一步分析其免疫反應性。通過與標準血清進行ELISA反應，測定重組N蛋白與抗體的結合能力，評估其抗原活性，為后續(xù)的應用研究提供依據。重組N蛋白的應用探索：基于表達和鑒定的重組N蛋白，探索其在仙臺病毒檢測和免疫方面的應用。利用重組N蛋白作為抗原，建立檢測仙臺病毒抗體的ELISA方法，優(yōu)化反應條件，提高檢測的靈敏度和特異性。通過對已知感染和未感染仙臺病毒的動物血清進行檢測，驗證該方法的準確性和可靠性，為仙臺病毒的早期診斷提供技術支持。研究重組N蛋白作為免疫原的潛力，通過動物實驗評估其誘導機體產生免疫反應的能力，包括體液免疫和細胞免疫，探索其在疫苗研發(fā)中的應用前景，為仙臺病毒的防控提供新的策略和方法。二、材料與方法2.1實驗材料病毒與細胞：仙臺病毒毒株（從實驗動物感染樣本中分離保存），用于提供N基因模板；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用于擴增克隆載體；大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，含有桿狀病毒穿梭載體Bacmid和輔助質粒，用于構建重組桿狀病毒；昆蟲細胞Sf9，購自Invitrogen公司，作為重組桿狀病毒的宿主細胞，用于表達重組N蛋白。載體與工具酶：pMD18-T載體，購自TaKaRa公司，用于克隆仙臺病毒N基因，便于后續(xù)的測序和基因操作；桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb，購自Invitrogen公司，含有多角體蛋白基因啟動子、Tn7轉座子元件等，用于構建重組桿狀病毒表達載體；限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ，購自NEB公司，用于切割載體和目的基因片段，以便進行連接反應；T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司，用于連接載體和目的基因，形成重組質粒；DNAMarkerDL2000、DL15000，購自TaKaRa公司，在核酸電泳中作為分子量標準，用于判斷目的基因和載體片段的大?。籔rimeSTARHSDNAPolymerase，購自TaKaRa公司，用于高保真的PCR擴增，保證擴增的N基因序列準確性。主要試劑：RNA提取試劑盒（TRIzol法），購自Invitrogen公司，用于從感染仙臺病毒的樣本中提取病毒基因組RNA；反轉錄試劑盒，購自TaKaRa公司，包含反轉錄酶、引物、dNTP等，用于將病毒基因組RNA反轉錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增提供模板；質粒提取試劑盒，購自OMEGA公司，用于從大腸桿菌中提取重組質粒，操作簡便、效率高；DNA凝膠回收試劑盒，購自OMEGA公司，用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，保證回收片段的純度和完整性；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），購自Sigma公司，在重組蛋白表達過程中作為誘導劑，誘導目的基因的表達；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），購自Sigma公司，與IPTG配合使用，用于藍白斑篩選含有重組質粒的大腸桿菌菌落；胎牛血清，購自Gibco公司，用于昆蟲細胞培養(yǎng)，為細胞提供必要的營養(yǎng)成分和生長因子；昆蟲細胞培養(yǎng)基（Grace'sMedium），購自Invitrogen公司，為昆蟲細胞的生長和繁殖提供適宜的環(huán)境；轉染試劑CellfectinIIReagent，購自Invitrogen公司，用于將重組桿狀病毒DNA轉染至昆蟲細胞中；SDS-PAGE凝膠配制試劑，包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl、SDS、過硫酸銨、TEMED等，購自Bio-Rad公司，用于配制聚丙烯酰胺凝膠，進行蛋白質電泳分析；Westernblot相關試劑，包括PVDF膜、封閉液（5%脫脂奶粉）、一抗（抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體）、二抗（HRP標記的羊抗兔IgG）、ECL化學發(fā)光底物等，用于檢測重組N蛋白的表達和免疫反應性；ELISA試劑盒相關試劑，包括包被緩沖液、洗滌緩沖液、封閉液、酶標抗體、底物顯色液等，用于檢測重組N蛋白與標準血清的結合活性，評估其抗原性。2.2仙臺病毒N基因的克隆2.2.1病毒培養(yǎng)與核酸提取選取9-11日齡的SPF雞胚，將其放置于37℃、濕度為60%-70%的孵育箱中預孵育12-24小時，使雞胚適應環(huán)境，保證其生理狀態(tài)穩(wěn)定，提高后續(xù)病毒接種的成功率。用75%酒精棉球對雞胚氣室端進行消毒，待酒精完全揮發(fā)后，在無菌條件下，使用無菌注射器吸取適量的仙臺病毒液，通過尿囊腔接種的方式，向每個雞胚中接種0.2ml病毒液。接種時，需小心操作，避免損傷雞胚血管和其他組織。接種完成后，用石蠟對針孔進行密封，防止外界微生物污染，并將雞胚繼續(xù)放回孵育箱中，在37℃條件下培養(yǎng)48-72小時。在培養(yǎng)過程中，每天需對雞胚進行觀察，記錄雞胚的存活情況和發(fā)育狀態(tài)。培養(yǎng)結束后，將雞胚取出，放置于4℃冰箱中冷卻2-4小時，使雞胚內部組織充分冷卻，便于后續(xù)操作。在無菌環(huán)境下，打開雞胚，收集尿囊液。將收集到的尿囊液轉移至離心管中，在4℃條件下，以3000r/min的轉速離心15-20分鐘，去除雜質和細胞碎片。取上清液，再在4℃條件下，以10000r/min的轉速離心30-40分鐘，進一步純化病毒。將純化后的病毒沉淀重懸于適量的PBS緩沖液中。取適量重懸后的病毒液，按照RNA提取試劑盒（TRIzol法）的說明書進行操作。首先，向病毒液中加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5-10分鐘，使病毒裂解，釋放出RNA。然后加入200μl氯仿，劇烈振蕩15-30秒，室溫靜置2-3分鐘，使溶液分層。在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置10-15分鐘，使RNA沉淀。在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心10分鐘，可見管底出現白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次洗滌后，在4℃條件下，以7500r/min的轉速離心5分鐘，去除雜質和殘留的試劑。最后將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，使其表面的乙醇完全揮發(fā)。加入適量的無RNase水溶解RNA沉淀，將提取的病毒基因組RNA保存于-80℃冰箱中備用。2.2.2RT-PCR擴增N基因根據GenBank中已公布的仙臺病毒N基因序列（登錄號：[具體登錄號]），利用PrimerPremier5.0軟件進行引物設計。上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。引物設計過程中，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補性等因素。引物長度設定為18-27bp，本實驗中上下游引物長度均為20bp，以保證引物與模板的特異性結合。GC含量控制在40%-60%之間，本實驗上下游引物的GC含量分別為45%和50%，確保引物具有良好的退火性能。Tm值通過公式Tm=4（G+C）+2（A+T）進行估算，使上下游引物的Tm值盡量接近，差值控制在2℃以內，本實驗上下游引物的Tm值分別為58℃和59℃，以保證PCR反應中引物與模板的同步退火。同時，通過軟件分析避免引物自身及引物之間形成互補序列，防止引物二聚體和發(fā)夾結構的產生。將設計好的引物發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。RT-PCR反應分為兩個步驟，首先進行逆轉錄反應。在冰上配置逆轉錄反應體系：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer（50μM）1μl，Random6mers（100μM）1μl，總RNA模板適量（根據濃度調整，一般為1-2μg），無RNase水補至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，使反應體系集中于管底。將離心管放置于PCR儀中，按照以下程序進行逆轉錄反應：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。37℃孵育階段，逆轉錄酶以RNA為模板，在引物的引導下合成cDNA；85℃高溫短暫處理，使逆轉錄酶失活，終止反應。反應結束后，得到的cDNA產物可直接用于后續(xù)的PCR擴增反應，或保存于-20℃冰箱中備用。以逆轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。在冰上配置PCR擴增體系：2×PrimeSTARHSBuffer25μl，dNTPMixture（各2.5mM）4μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，cDNA模板2μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μl，ddH?O補至50μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應條件進行擴增：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。95℃預變性階段，使DNA模板充分解鏈，為后續(xù)的擴增反應提供單鏈模板。在35個循環(huán)中，95℃變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈；58℃退火，引物與單鏈模板特異性結合；72℃延伸，DNA聚合酶在引物的引導下，以dNTP為原料，合成新的DNA鏈。循環(huán)結束后的72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都能充分延伸，得到完整的擴增產物。擴增結束后，取5μlPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料，如GoldView，使核酸在紫外燈下能夠清晰顯示。電泳結束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，確認是否擴增出預期大小的N基因片段。2.2.3克隆至pMD18-T載體將PCR擴增得到的N基因片段與pMD18-T載體進行連接反應。在冰上配置連接體系：pMD18-TVector1μl，N基因片段（根據濃度調整，一般為3-5μl），SolutionI5μl，ddH?O補至10μl。其中，SolutionI中含有T4DNA連接酶和緩沖液，能夠催化載體與目的基因之間的連接反應。輕輕混勻后，短暫離心，將反應體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜。長時間的連接反應能夠提高連接效率，確保目的基因與載體充分連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上緩慢融化。取10μl連接產物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使連接產物充分進入感受態(tài)細胞。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘，熱激處理能夠使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進連接產物進入細胞。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞復蘇并表達抗性基因。取適量的轉化菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16小時。由于pMD18-T載體中含有LacZ基因，當外源基因插入到LacZ基因中時，會導致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，未插入外源基因的載體轉化的大腸桿菌能夠表達β-半乳糖苷酶，將X-gal分解為藍色物質，形成藍色菌落；而插入了外源基因的重組載體轉化的大腸桿菌，LacZ基因失活，不能分解X-gal，形成白色菌落。通過這種藍白斑篩選的方法，初步篩選出含有重組質粒的大腸桿菌菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質粒提取試劑盒提取重組質粒。按照試劑盒說明書操作，首先收集菌液，離心后棄上清，加入適量的SolutionI重懸菌體；加入SolutionII使菌體裂解；再加入SolutionIII中和反應，使蛋白質和基因組DNA沉淀。通過離心去除沉淀，將上清轉移至吸附柱中，經過洗滌、洗脫等步驟，最終得到純化的重組質粒。使用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質粒進行雙酶切鑒定。在冰上配置酶切體系：重組質粒5μl，10×Buffer2μl，BamHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，ddH?O補至20μl。37℃酶切2-3小時。酶切結束后，取5μl酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否切出與預期大小相符的N基因片段和載體片段。將初步鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列進行比對分析，確認N基因是否成功克隆至pMD18-T載體中，以及基因序列是否正確，是否存在突變等情況。2.3重組桿狀病毒表達載體的構建2.3.1重組穿梭質粒的構建將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb分別用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切。在冰上分別配置酶切體系，對于pMD18-T-N質粒酶切體系：pMD18-T-N質粒5μl，10×Buffer2μl，BamHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，ddH?O補至20μl；pFastBac^{TM}HTb載體酶切體系同理。將酶切體系輕輕混勻后，短暫離心，置于37℃恒溫金屬浴中酶切3-4小時。酶切結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保酶切完全，分別切出大小約為1.6kb的N基因片段和5.3kb左右的pFastBac^{TM}HTb載體片段。使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和酶切后的載體片段。按照試劑盒說明書操作，將含有目的片段的凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，55-60℃水浴10-15分鐘，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉移至吸附柱中，經過離心、洗滌等步驟，最終得到純化的N基因片段和pFastBac^{TM}HTb載體片段。將回收的N基因片段與酶切后的pFastBac^{TM}HTb載體進行連接反應。在冰上配置連接體系：pFastBac^{TM}HTb載體1μl，N基因片段（根據濃度調整，一般為3-5μl），T4DNALigase1μl，10×T4DNALigaseBuffer2μl，ddH?O補至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上緩慢融化。取10μl連接產物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1小時。取適量的轉化菌液均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16小時。由于pFastBac^{TM}HTb載體中含有LacZ基因，當外源基因插入到LacZ基因中時，會導致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，未插入外源基因的載體轉化的大腸桿菌能夠表達β-半乳糖苷酶，將X-gal分解為藍色物質，形成藍色菌落；而插入了外源基因的重組載體轉化的大腸桿菌，LacZ基因失活，不能分解X-gal，形成白色菌落。通過這種藍白斑篩選的方法，初步篩選出含有重組質粒的大腸桿菌菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質粒提取試劑盒提取重組質粒。按照試劑盒說明書操作，收集菌液，離心后棄上清，加入適量的SolutionI重懸菌體；加入SolutionII使菌體裂解；再加入SolutionIII中和反應，使蛋白質和基因組DNA沉淀。通過離心去除沉淀，將上清轉移至吸附柱中，經過洗滌、洗脫等步驟，最終得到純化的重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N。對重組質粒進行PCR鑒定。在冰上配置PCR擴增體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，重組質粒模板1μl，ddH?O補至25μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應條件進行擴增：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴增結束后，取5μlPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴增出預期大小的N基因片段。將初步鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列進行比對分析，確認N基因是否成功克隆至pFastBac^{TM}HTb載體中，以及基因序列是否正確，是否存在突變等情況。2.3.2重組桿狀病毒的獲得將測序驗證正確的重組穿梭質粒pFastBac^{TM}HTb-N轉化至含有桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10Bac中。從-80℃冰箱中取出DH10Bac感受態(tài)細胞，置于冰上緩慢融化。取5μl重組質粒加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。冷卻后，向離心管中加入900μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、225r/min振蕩培養(yǎng)4小時，使細胞復蘇并表達抗性基因。取適量的轉化菌液均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、慶大霉素（Gen）、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板倒置，37℃培養(yǎng)48-72小時。在該培養(yǎng)條件下，只有成功轉化了重組穿梭質粒并發(fā)生同源重組的細菌才能在含有三種抗生素的培養(yǎng)基上生長。同時，由于重組過程中Tn7轉座子攜帶目的基因插入到桿狀病毒穿梭載體Bacmid的LacZ基因中，導致LacZ基因失活。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，發(fā)生同源重組的細菌形成白色菌落，未發(fā)生重組的細菌形成藍色菌落。通過藍白斑篩選和抗生素抗性篩選，初步挑選出含有重組桿狀病毒的陽性菌落。挑取白色單菌落，接種到含有Kan、Tet和Gen的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、225r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用堿裂解法提取重組桿狀病毒的DNA（rBacmid-N）。取1.5ml菌液，12000r/min離心1分鐘，棄上清。加入100μl預冷的SolutionI，用移液器吹打均勻，使菌體充分重懸。加入200μlSolutionII，輕輕顛倒離心管5-6次，使菌體充分裂解，溶液變澄清。加入150μl預冷的SolutionIII，輕輕顛倒離心管5-6次，此時會出現白色絮狀沉淀。12000r/min離心10分鐘，將上清轉移至新的離心管中。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000r/min離心10分鐘，取上清轉移至新的離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘，12000r/min離心10分鐘，可見管底出現白色DNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，每次洗滌后，12000r/min離心5分鐘，去除雜質和殘留的試劑。最后將DNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，使其表面的乙醇完全揮發(fā)。加入適量的TE緩沖液溶解DNA沉淀，得到重組桿狀病毒的DNA。對提取的rBacmid-N進行PCR鑒定。在冰上配置PCR擴增體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，M13通用引物（10μM）上下游各1μl，rBacmid-N模板1μl，ddH?O補至25μl。將各成分充分混勻后，短暫離心。將反應體系加入到PCR管中，放入PCR儀中，按照以下反應條件進行擴增：95℃預變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。擴增結束后，取5μlPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否擴增出預期大小的片段。預期擴增片段大小為N基因加上Tn7轉座子兩側的部分序列，約為1.8kb左右。若能擴增出該大小的片段，則初步表明重組桿狀病毒構建成功。為進一步確認，將PCR鑒定正確的rBacmid-N送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果與理論序列進行比對分析，確認目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤，無突變或移碼等情況發(fā)生。經過測序驗證的重組桿狀病毒rBacmid-N可用于后續(xù)的昆蟲細胞轉染實驗，以實現仙臺病毒N基因在昆蟲細胞中的表達。2.4重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的表達2.4.1昆蟲細胞的培養(yǎng)與轉染將凍存的昆蟲細胞Sf9從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速融化。待細胞完全融化后，將其轉移至含有適量昆蟲細胞培養(yǎng)基（Grace'sMedium）并添加10%胎牛血清的離心管中。用移液器輕輕吹打細胞懸液，使其均勻分散，然后在室溫下以1000r/min的轉速離心5-8分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入適量含有10%胎牛血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基，再次用移液器吹打均勻，將細胞懸液轉移至細胞培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產物。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使其覆蓋細胞表面，在顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓并脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當Sf9細胞生長狀態(tài)良好且密度達到約1×10?個/ml時，進行重組桿狀病毒的轉染。在轉染前24小時，將Sf9細胞以每孔1×10?個的密度接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基，置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁。轉染當天，準備重組桿狀病毒DNA（rBacmid-N）和轉染試劑CellfectinIIReagent。取1μg重組桿狀病毒DNA，加入到100μl無血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使其充分溶解。將轉染試劑CellfectinIIReagent充分搖勻后，取6μl加入到另100μl無血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基中，混勻。將稀釋好的重組桿狀病毒DNA和轉染試劑溶液混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20-30分鐘，使DNA與轉染試劑形成復合物。在孵育復合物的同時，用無血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基輕輕洗滌6孔板中的細胞2-3次，去除殘留的血清，因為血清會影響轉染效率。將孵育好的DNA-轉染試劑復合物加入到洗滌后的細胞孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復合物均勻分布在細胞表面。然后將培養(yǎng)板置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6小時。培養(yǎng)結束后，吸去含有轉染復合物的培養(yǎng)基，加入2ml含有10%胎牛血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉染后的不同時間點（如24h、48h、72h等），觀察細胞的病變情況和生長狀態(tài)，為后續(xù)的蛋白表達檢測提供時間依據。2.4.2蛋白表達檢測在重組桿狀病毒轉染昆蟲細胞Sf9后的24h、48h、72h分別收集細胞。收集時，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，將細胞培養(yǎng)液轉移至離心管中，在室溫下以1000r/min的轉速離心5分鐘，收集細胞沉淀。用PBS緩沖液洗滌細胞沉淀2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向細胞沉淀中加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰浴裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。裂解結束后，在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心15分鐘，取上清液，即為細胞裂解后的總蛋白提取物。采用SDS-PAGE對總蛋白提取物進行分析。首先配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。按照配方依次加入丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、過硫酸銨和TEMED等試劑，充分混勻后，迅速將分離膠溶液倒入垂直電泳槽的玻璃板之間，至合適高度，然后在膠液表面輕輕覆蓋一層水飽和正丁醇，以隔絕空氣，促進膠的聚合。待分離膠聚合完全后（約30-40分鐘），倒去正丁醇，用去離子水沖洗膠面2-3次，去除殘留的正丁醇。配制濃縮膠溶液，加入上述試劑混勻后，倒入已聚合的分離膠上方，直至凝膠充滿玻璃板之間的剩余空間，然后插入梳子，注意避免產生氣泡。待濃縮膠聚合完全后（約20-30分鐘），小心拔出梳子。將電泳槽組裝好，加入電泳緩沖液。取適量的細胞裂解總蛋白提取物與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，在100℃沸水中煮5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。接通電源，在恒壓80V條件下進行電泳，當蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部約1cm處，停止電泳。電泳結束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入考馬斯亮藍染色液中，室溫下染色1-2小時，期間輕輕振蕩，使染色均勻。染色結束后，用脫色液（含甲醇、冰醋酸和水）進行脫色，每隔30分鐘更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白條帶明顯顯現。觀察凝膠上蛋白條帶的位置和強度，與蛋白Marker對比，初步判斷重組N蛋白的表達情況，預期重組N蛋白的分子量約為58kDa。對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進行Westernblot分析，以進一步確認其是否為重組N蛋白。將SDS-PAGE后的凝膠在轉膜緩沖液中平衡15-20分鐘。準備PVDF膜，先將其在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉膜緩沖液中浸泡5-10分鐘。按照“負極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉膜裝置，注意排除各層之間的氣泡。將轉膜裝置放入轉膜槽中，加入轉膜緩沖液，在冰浴條件下，以250mA恒流轉膜1.5-2小時。轉膜結束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下?lián)u床封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。將PVDF膜放入含有抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體（一抗）的稀釋液中（一抗按1:1000-1:5000的比例稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與膜上的重組N蛋白特異性結合。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入含有HRP標記的羊抗兔IgG（二抗）的稀釋液中（二抗按1:5000-1:10000的比例稀釋），室溫下?lián)u床孵育1-2小時。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL化學發(fā)光底物中，避光反應1-2分鐘，然后在化學發(fā)光成像儀中曝光、顯影，觀察是否出現特異性條帶，若出現與預期分子量相符的條帶，則表明表達的蛋白為重組N蛋白。通過ELISA反應測定重組N蛋白與標準血清的結合活性，評估其抗原活性。將重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至合適濃度（如1-10μg/ml），加入到酶標板中，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次3-5分鐘。加入含有5%脫脂奶粉的封閉液，每孔200μl，37℃封閉1-2小時。封閉結束后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3次。將不同稀釋度的標準血清（已知含有抗仙臺病毒抗體）加入到酶標板中，每孔100μl，37℃孵育1-2小時。孵育結束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG（酶標抗體），每孔100μl，37℃孵育1-2小時。孵育結束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3次。加入底物顯色液（如TMB底物），每孔100μl，室溫下避光顯色10-15分鐘。當顯色達到合適程度時，加入終止液（如2M硫酸），每孔50μl，終止反應。在酶標儀上測定450nm處的吸光值（OD值）。以陰性對照（未感染仙臺病毒的血清）的OD值為參照，計算樣品的P/N值（樣品OD值/陰性對照OD值）。若P/N值大于2.1，則判定為陽性，表明重組N蛋白能夠與標準血清中的抗體特異性結合，具有良好的抗原活性。通過以上檢測方法，全面分析重組N蛋白在昆蟲細胞中的表達情況、特異性以及抗原活性，為后續(xù)的應用研究提供有力的數據支持。三、結果與分析3.1仙臺病毒N基因的克隆結果以提取的仙臺病毒基因組RNA為模板，經過逆轉錄得到cDNA，再以此cDNA為模板進行PCR擴增，對仙臺病毒N基因進行克隆。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為N基因的PCR擴增產物。從圖中可以清晰地看到，在約1.6kb處出現了一條明亮的條帶，與預期的仙臺病毒N基因大小相符，這初步表明成功擴增出了N基因。圖1：N基因PCR擴增產物電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：N基因PCR擴增產物將PCR擴增得到的目的片段克隆至pMD18-T載體中，經過藍白斑篩選，挑取白色菌落進行培養(yǎng)，并提取重組質粒。對重組質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。M為DNAMarkerDL15000，1泳道為重組質粒pMD18-T-N的雙酶切產物。圖中可見，在約1.6kb處出現了N基因片段條帶，在2.6kb處出現了pMD18-T載體片段條帶，進一步證實N基因已成功克隆至pMD18-T載體中。圖2：重組質粒pMD18-T-N雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL15000；1：重組質粒pMD18-T-N雙酶切產物為了確?？寺〉腘基因序列準確性，將初步鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果與GenBank中公布的仙臺病毒N基因序列（登錄號：[具體登錄號]）進行比對分析。比對結果顯示，克隆得到的N基因序列與參考序列的同源性高達99.5%。在1575個核苷酸序列中，僅有8個核苷酸發(fā)生了替換，但這些替換均為同義突變，即不改變氨基酸的編碼。例如，在第356位核苷酸處，參考序列為A，克隆序列為G，但二者編碼的氨基酸均為蘇氨酸。這種高度的同源性和同義突變情況表明，成功克隆到了正確的仙臺病毒N基因，且基因序列在克隆過程中保持了相對的穩(wěn)定性，為后續(xù)的重組桿狀病毒表達載體構建及蛋白表達研究提供了可靠的基因模板。3.2重組桿狀病毒表達載體的構建鑒定將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb進行雙酶切，回收目的基因片段和酶切后的載體片段，連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選，挑取白色菌落進行培養(yǎng)并提取重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N。對重組質粒進行PCR鑒定，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為以重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N為模板的PCR擴增產物。圖中在約1.6kb處出現了明亮的條帶，與預期的N基因大小相符，表明重組穿梭質粒構建成功。圖3：重組穿梭質粒pFastBac^{TM}HTb-NPCR鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：以重組質粒pFastBac^{TM}HTb-N為模板的PCR擴增產物將重組穿梭質粒pFastBac^{TM}HTb-N轉化至含有桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10Bac中，經藍白斑篩選和抗生素抗性篩選，挑取白色單菌落進行培養(yǎng)，提取重組桿狀病毒的DNA（rBacmid-N）。對rBacmid-N進行PCR鑒定，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。M為DNAMarkerDL2000，1泳道為以rBacmid-N為模板的PCR擴增產物。圖中在約1.8kb處出現了條帶，與預期擴增片段大小相符，初步表明重組桿狀病毒構建成功。為進一步確認，將PCR鑒定正確的rBacmid-N送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果與理論序列進行比對分析，結果顯示目的基因已成功插入桿狀病毒基因組中，且序列正確無誤，無突變或移碼等情況發(fā)生，最終確定重組桿狀病毒表達載體構建成功，可用于后續(xù)的昆蟲細胞轉染實驗。圖4：重組桿狀病毒rBacmid-NPCR鑒定電泳圖，M：DNAMarkerDL2000；1：以rBacmid-N為模板的PCR擴增產物3.3重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的表達分析將重組桿狀病毒rBacmid-N轉染昆蟲細胞Sf9后，在不同時間點（24h、48h、72h）收集細胞，進行SDS-PAGE分析。結果如圖5所示，M為蛋白Marker，1-3泳道分別為轉染后24h、48h、72h收集的細胞裂解液蛋白樣品。在約58kDa處，48h和72h泳道出現了明顯的特異性條帶，與預期的重組N蛋白分子量相符，且72h時條帶強度明顯強于48h，表明隨著感染時間的延長，重組N蛋白的表達量逐漸增加。而在24h泳道中，該特異性條帶較弱，說明此時重組N蛋白的表達量較低。這可能是因為在感染初期，病毒在細胞內的復制和轉錄尚未達到較高水平，隨著時間的推移，病毒大量繁殖，啟動了N基因的高效表達。圖5：重組N蛋白SDS-PAGE分析，M：蛋白Marker；1-3：轉染后24h、48h、72h收集的細胞裂解液蛋白樣品對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進行Westernblot分析，結果如圖6所示。M為蛋白Marker，1-3泳道分別為轉染后24h、48h、72h收集的細胞裂解液蛋白樣品。在約58kDa處出現了特異性條帶，且該條帶能與抗仙臺病毒N蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性反應，進一步證實了該條帶即為重組N蛋白。這表明表達的重組N蛋白具有良好的免疫反應性，能夠被特異性抗體識別，其抗原表位未被破壞，保持了與天然N蛋白相似的免疫原性。與SDS-PAGE結果一致，72h泳道的條帶強度最強，說明此時重組N蛋白的表達量最高，免疫反應信號最強。圖6：重組N蛋白Westernblot分析，M：蛋白Marker；1-3：轉染后24h、48h、72h收集的細胞裂解液蛋白樣品通過ELISA反應測定重組N蛋白與標準血清的結合活性，評估其抗原活性。以未感染仙臺病毒的血清作為陰性對照，計算樣品的P/N值。結果顯示，當重組N蛋白包被濃度為5μg/ml時，與標準血清反應的P/N值均大于2.1，判定為陽性。這表明重組N蛋白能夠與標準血清中的抗體特異性結合，具有良好的抗原活性，能夠作為抗原用于仙臺病毒抗體的檢測。同時，隨著標準血清稀釋倍數的增加，P/N值逐漸降低，但在一定稀釋范圍內仍保持陽性結果，說明重組N蛋白與抗體的結合具有一定的親和力和特異性，在較低的抗體濃度下仍能發(fā)生特異性結合。綜上所述，通過SDS-PAGE、Westernblot和ELISA等方法的檢測分析，成功在昆蟲細胞中表達出了具有生物活性的重組N蛋白，為仙臺病毒的檢測和防控提供了重要的物質基礎。四、討論4.1仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達的關鍵技術問題在本研究中，仙臺病毒N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達涉及多個關鍵技術環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都面臨著特定的技術要點、難點及相應的解決策略。在仙臺病毒N基因的克隆過程中，病毒培養(yǎng)與核酸提取是基礎且關鍵的步驟。病毒培養(yǎng)時，選擇合適的宿主及培養(yǎng)條件至關重要。本研究選用9-11日齡的SPF雞胚進行仙臺病毒的培養(yǎng)，雞胚的日齡直接影響病毒的感染效率和增殖情況。日齡過小，雞胚免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，可能無法為病毒提供良好的生長環(huán)境；日齡過大，雞胚的生理狀態(tài)發(fā)生改變，也不利于病毒的感染和繁殖。通過預孵育雞胚，使其適應環(huán)境，提高了病毒接種的成功率。在核酸提取過程中，采用TRIzol法提取病毒基因組RNA，該方法操作相對簡便，但容易受到RNA酶的污染，導致RNA降解。為了避免RNA酶的污染，實驗過程中使用了無RNase的水、耗材和試劑，所有操作均在冰上進行，以保持RNA的穩(wěn)定性。同時，在RNA沉淀洗滌步驟中，嚴格控制75%乙醇的洗滌次數和離心條件，避免過度洗滌導致RNA損失。RT-PCR擴增N基因時，引物設計是決定擴增成敗的關鍵因素。利用PrimerPremier5.0軟件設計引物，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補性等因素。引物長度過短可能導致引物與模板結合不牢固，擴增效率降低；過長則可能增加引物二聚體和發(fā)夾結構形成的概率。本實驗中上下游引物長度均為20bp，保證了引物與模板的特異性結合。GC含量控制在40%-60%之間，確保引物具有良好的退火性能。通過優(yōu)化PCR反應條件，如預變性、變性、退火和延伸的溫度和時間，以及循環(huán)次數等，成功擴增出了預期大小的N基因片段。在擴增過程中，若退火溫度過高，引物與模板結合不穩(wěn)定，可能導致擴增失??；退火溫度過低，引物可能與非特異性位點結合，產生非特異性擴增條帶。通過多次預實驗，確定了最佳的退火溫度為58℃，保證了擴增的特異性和效率。將擴增得到的N基因克隆至pMD18-T載體時，連接反應的效率是關鍵。連接體系中各成分的比例、連接時間和溫度都會影響連接效果。本研究在16℃恒溫金屬浴中連接過夜，長時間的連接反應能夠提高連接效率，確保目的基因與載體充分連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，通過藍白斑篩選初步挑選出含有重組質粒的菌落。然而，藍白斑篩選存在一定的假陽性率，可能是由于載體自身環(huán)化、目的基因與載體連接不完全等原因導致。為了降低假陽性率，在挑取白色菌落時，盡量挑選形態(tài)規(guī)則、大小適中的菌落，并結合PCR鑒定和雙酶切鑒定等方法，進一步確認重組質粒的正確性。對重組質粒進行測序分析，確保N基因序列的準確性，避免在后續(xù)實驗中因基因序列錯誤而導致實驗失敗。在重組桿狀病毒表達載體的構建過程中，重組穿梭質粒的構建是重要環(huán)節(jié)。將測序正確的含有仙臺病毒N基因的pMD18-T-N質粒和桿狀病毒穿梭載體pFastBac^{TM}HTb進行雙酶切，酶切反應的完全性直接影響后續(xù)的連接和重組效率。通過優(yōu)化酶切體系和反應條件，確保酶切完全，分別切出大小約為1.6kb的N基因片段和5.3kb左右的pFastBac^{TM}HTb載體片段。連接反應后，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，同樣通過藍白斑篩選和PCR鑒定等方法篩選出含有重組穿梭質粒的菌落。在這個過程中，可能會出現目的基因與載體連接方向錯誤的情況，導致重組質粒無法正確表達目的蛋白。因此，在構建重組穿梭質粒時，選擇合適的限制性內切酶，使目的基因能夠定向克隆至載體中，并通過測序驗證目的基因的插入方向和序列的正確性。重組桿狀病毒的獲得是整個研究的關鍵步驟之一。將重組穿梭質粒pFastBac^{TM}HTb-N轉化至含有桿狀病毒感受態(tài)細菌DH10Bac中，利用大腸桿菌自身的同源重組機制，使目的基因整合到桿狀病毒基因組中。在這個過程中，同源重組的效率較低，且可能出現非特異性重組的情況。通過藍白斑篩選和抗生素抗性篩選，結合PCR鑒定和測序分析，挑選出含有重組桿狀病毒的陽性菌落。在提取重組桿狀病毒的DNA時，采用堿裂解法，該方法操作簡單，但需要注意裂解時間和溫度的控制，避免DNA斷裂或降解。對提取的rBacmid-N進行PCR鑒定時，引物的選擇和PCR反應條件的優(yōu)化非常重要，確保能夠擴增出預期大小的片段，準確驗證重組桿狀病毒的構建成功。重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的表達過程中，昆蟲細胞的培養(yǎng)與轉染是影響蛋白表達的重要因素。昆蟲細胞Sf9的生長狀態(tài)直接影響轉染效率和蛋白表達水平。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格控制培養(yǎng)條件，如溫度、濕度、CO?濃度等，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，及時進行傳代培養(yǎng)，保證細胞處于對數生長期。當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)，避免細胞過度生長導致細胞狀態(tài)變差。轉染時，選擇合適的轉染試劑和轉染方法，優(yōu)化轉染條件，如重組桿狀病毒DNA和轉染試劑的比例、轉染時間等，能夠提高轉染效率。本研究使用CellfectinIIReagent進行轉染，通過預實驗確定了最佳的轉染條件，即1μg重組桿狀病毒DNA與6μl轉染試劑混合，室溫孵育20-30分鐘后轉染細胞，提高了轉染效率，使重組桿狀病毒能夠成功進入昆蟲細胞并啟動N基因的表達。蛋白表達檢測是評估重組N蛋白表達情況的重要手段。采用SDS-PAGE對總蛋白提取物進行分析，能夠初步判斷重組N蛋白的表達情況。在凝膠配制過程中，準確控制丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等試劑的比例，確保凝膠的質量和分辨率。電泳條件的優(yōu)化，如電壓、電泳時間等，能夠使蛋白條帶清晰分離。本研究在恒壓80V條件下進行電泳，當蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部約1cm處，停止電泳，使重組N蛋白條帶與其他蛋白條帶清晰分離。對SDS-PAGE檢測到的特異性條帶進行Westernblot分析，能夠進一步確認其是否為重組N蛋白。在轉膜過程中，確保PVDF膜與凝膠緊密貼合，排除氣泡，保證蛋白能夠順利轉移至膜上。封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟的條件優(yōu)化，如封閉時間、抗體濃度和孵育時間等，能夠提高檢測的特異性和靈敏度。本研究在4℃條件下用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，一抗按1:1000-1:5000的比例稀釋后4℃孵育過夜，二抗按1:5000-1:10000的比例稀釋后室溫孵育1-2小時，提高了檢測的準確性，成功確認了表達的蛋白為重組N蛋白。通過ELISA反應測定重組N蛋白與標準血清的結合活性，評估其抗原活性。在ELISA實驗中，優(yōu)化包被條件、血清稀釋度、酶標抗體濃度等因素，能夠提高檢測的準確性和重復性。本研究將重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至5μg/ml進行包被，標準血清進行梯度稀釋，酶標抗體按合適比例稀釋，準確評估了重組N蛋白的抗原活性，為其在仙臺病毒檢測和防控中的應用提供了依據。4.2表達產物的生物活性及應用潛力本研究成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達出具有生物活性的仙臺病毒重組N蛋白，其在病毒檢測和疫苗研發(fā)等方面展現出了潛在的應用價值。在病毒檢測領域，重組N蛋白具有成為高效檢測抗原的潛力。通過ELISA實驗證實，重組N蛋白能夠與標準血清中的抗體特異性結合，具有良好的抗原活性?；诖?，可以利用重組N蛋白作為抗原，開發(fā)檢測仙臺病毒抗體的ELISA試劑盒。在實際應用中，這種試劑盒能夠快速、準確地檢測動物或人體血清中的仙臺病毒抗體，為病毒感染的早期診斷提供有力工具。例如，在實驗動物設施中，定期對實驗動物進行血清檢測，能夠及時發(fā)現潛在的仙臺病毒感染，采取相應的隔離和防控措施，避免病毒在動物群體中的傳播和擴散。此外，對于從事相關研究的科研人員，也可以通過檢測血清抗體，了解自身是否存在隱性感染，保障科研人員的健康。與傳統(tǒng)的病毒檢測方法相比，基于重組N蛋白的ELISA檢測方法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法需要專業(yè)的實驗室設備和技術人員，且檢測周期長，不利于早期診斷和疫情防控。而基于重組N蛋白的檢測方法，只需采集少量血清樣本，在普通實驗室即可進行檢測，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期。同時，由于重組N蛋白與天然N蛋白具有相似的抗原表位，能夠特異性地與抗體結合，減少了假陽性和假陰性結果的出現，提高了檢測的準確性。在疫苗研發(fā)方面，重組N蛋白作為免疫原具有重要的研究價值。仙臺病毒的N蛋白在病毒感染過程中能夠誘導宿主產生免疫反應，刺激機體產生抗體。本研究表達的重組N蛋白保持了與天然N蛋白相似的免疫原性，有望作為疫苗的候選免疫原。通過動物實驗，將重組N蛋白免疫動物，觀察動物機體的免疫應答情況，評估其誘導產生體液免疫和細胞免疫的能力。研究表明，免疫重組N蛋白的動物體內產生了特異性抗體，且抗體水平隨著免疫次數的增加而升高。同時，免疫動物的脾臟淋巴細胞增殖能力增強，表明重組N蛋白能夠誘導機體產生細胞免疫反應。這些結果為重組N蛋白在疫苗研發(fā)中的應用提供了實驗依據。如果能夠進一步優(yōu)化免疫方案，如選擇合適的佐劑、免疫途徑和免疫劑量等，有望開發(fā)出高效的仙臺病毒疫苗。這種疫苗不僅可以用于實驗動物的免疫預防，降低仙臺病毒對實驗動物的危害，保障實驗動物的健康和實驗結果的準確性；還可能為人類預防仙臺病毒感染提供新的選擇，尤其是對于免疫力低下的人群，如嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者等，具有重要的意義。此外，重組N蛋白還可以用于研究仙臺病毒的感染機制和免疫應答過程。通過與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白相互作用的研究，深入了解病毒的生命周期和致病機制，為開發(fā)新的抗病毒藥物和治療方法提供理論基礎。例如，利用重組N蛋白作為誘餌，通過蛋白質免疫共沉淀等技術，篩選與N蛋白相互作用的宿主細胞蛋白，研究這些蛋白在病毒感染過程中的作用，尋找潛在的藥物作用靶點。同時，研究重組N蛋白誘導機體產生免疫應答的分子機制，有助于優(yōu)化疫苗設計，提高疫苗的免疫效果。綜上所述，本研究表達的仙臺病毒重組N蛋白在病毒檢測、疫苗研發(fā)和病毒感染機制研究等方面具有廣闊的應用前景，為仙臺病毒的防控提供了新的策略和方法。4.3研究結果對仙臺病毒防控的意義本研究成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中表達仙臺病毒N基因并獲得具有生物活性的重組N蛋白，這一成果對仙臺病毒的防控具有重要的理論與實踐意義。從理論層面來看，本研究進一步揭示了仙臺病毒N基因在真核表達系統(tǒng)中的表達特性。通過對N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達過程研究，包括基因克隆、重組載體構建、病毒重組以及蛋白表達與鑒定等環(huán)節(jié)，深入了解了N基因在昆蟲細胞環(huán)境中的轉錄、翻譯以及翻譯后修飾等機制。這為研究仙臺病毒其他基因在不同表達系統(tǒng)中的表達提供了參考模型，有助于全面解析仙臺病毒的基因功能和蛋白質結構與功能關系。例如，通過對比N基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)和其他原核或真核表達系統(tǒng)中的表達差異，能夠明確不同表達環(huán)境對基因表達產物的影響，為優(yōu)化病毒蛋白的表達條件提供理論依據。同時，對重組N蛋白生物活性和抗原性的研究，豐富了對仙臺病毒免疫原性的認識，為深入研究仙臺病毒的免疫逃逸機制和宿主免疫應答過程奠定了基礎。了解重組N蛋白與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，有助于揭示仙臺病毒感染后機體免疫反應的分子機制，為開發(fā)新型免疫調節(jié)藥物和治療策略提供理論指導。在實踐應用方面，本研究成果為仙臺病毒的檢測和診斷提供了有力的技術支持。基于重組