miR-128靶向CCL18對黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義黑色素瘤是黑色素細(xì)胞來源的一種高度惡性的腫瘤，簡稱惡黑，多發(fā)生于皮膚，也可見于黏膜和內(nèi)臟，在淺膚色人群中發(fā)病率高，男女比例3：2，約占全部腫瘤的3%。其發(fā)病率雖低，但惡性程度極高，具有早期轉(zhuǎn)移和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命健康。若未能及時(shí)治療或治療方式不當(dāng)，黑色素瘤極易向其他組織或器官擴(kuò)散，不僅會破壞皮膚組織，對患處肌膚和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，還會引發(fā)瘢痕、色素沉著、萎縮等問題，影響患者美觀和社交，晚期更會對患者生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅。近年來，盡管醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步，但黑色素瘤患者的總體生存率仍不理想，因此，深入探究黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。在腫瘤研究領(lǐng)域，微小RNA（microRNA，miRNA）逐漸成為關(guān)注焦點(diǎn)。miRNA是一類長度為19-25個(gè)核苷酸、細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的單鏈非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后抑制或mRNA降解調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控靶蛋白參與的信號通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，miR-128作為一種在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的miRNA，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常生理功能維持中至關(guān)重要，其異常表達(dá)也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究證實(shí)，miR-128參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，已成為具有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，并有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。然而，miR-128在黑色素瘤中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。趨化因子CCL18是一種小分子炎性趨化因子，在維系人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、強(qiáng)化白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演著重要角色。當(dāng)機(jī)體存在炎癥反應(yīng)時(shí)，血清CCL18水平會明顯升高。隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)CCL18水平在腫瘤組織中存在明顯異常，且CCL18的表達(dá)往往與疾病程度等有關(guān)，提示其參與了腫瘤的形成、發(fā)展，可作為腫瘤患者療效、預(yù)后評估的指標(biāo)。相關(guān)研究表明，CCL18在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如在鼻咽癌中，CCL18可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并影響其化療耐藥性。但CCL18在黑色素瘤中的作用及調(diào)控機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。本研究聚焦于miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。從理論層面來看，深入探究miR-128與CCL18在黑素瘤細(xì)胞中的相互作用及調(diào)控機(jī)制，有助于完善對黑色素瘤發(fā)病機(jī)制的理解，為腫瘤生物學(xué)理論發(fā)展提供新的依據(jù)。從現(xiàn)實(shí)應(yīng)用角度出發(fā)，明確miR-128和CCL18在黑色素瘤中的作用，有望為黑色素瘤的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更有效的治療策略奠定基礎(chǔ)，從而改善黑色素瘤患者的治療效果和生存質(zhì)量。1.2黑素瘤概述黑素瘤，全稱惡性黑色素瘤，是一種起源于黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚，也可見于黏膜、眼葡萄膜、軟腦膜等部位。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為與多種因素相關(guān)，包括紫外線照射、遺傳因素、基因突變、免疫功能異常等。紫外線中的短波紫外線（UVB）和長波紫外線（UVA）可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致基因突變，從而增加黑素瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。家族遺傳因素在黑素瘤發(fā)病中也占有一定比例，約5%-10%的黑素瘤患者具有家族遺傳傾向，相關(guān)的遺傳基因包括CDKN2A、BRAF、NRAS等。在全球范圍內(nèi)，黑素瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，澳大利亞和新西蘭是黑素瘤發(fā)病率最高的地區(qū)，其年發(fā)病率可達(dá)30-50/10萬，這可能與當(dāng)?shù)鼐用衿つw白皙、紫外線暴露時(shí)間長等因素有關(guān)。在歐美國家，黑素瘤的發(fā)病率也相對較高，約為10-20/10萬。在我國，雖然黑素瘤的發(fā)病率相對較低，約為0.6-1/10萬，但由于人口基數(shù)大，患者絕對數(shù)量仍不可忽視，且近年來發(fā)病率也有明顯的上升趨勢。黑素瘤具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移特性，這也是其導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。早期黑素瘤通常局限于皮膚表皮層或真皮淺層，隨著病情進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞可突破基底膜，侵入真皮深層和皮下組織，并通過淋巴管和血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。常見的轉(zhuǎn)移部位包括淋巴結(jié)、肺、肝、腦、骨等。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率將顯著降低，如發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的黑素瘤患者，5年生存率僅為15%-20%。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)以及在遠(yuǎn)處組織的定植和生長等多個(gè)環(huán)節(jié)。在這個(gè)過程中，多種分子和信號通路參與其中，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等。這些分子和信號通路的異常激活或抑制，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。由于黑素瘤的高侵襲轉(zhuǎn)移性和對現(xiàn)有治療手段的相對不敏感，導(dǎo)致其治療效果往往不盡人意，患者的總體生存率較低，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。因此，深入探究黑素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施，對于提高黑素瘤患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。1.3miR-128與腫瘤的關(guān)系miR-128作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其功能涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)重要生物學(xué)過程。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，大量研究表明miR-128對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。例如在前列腺癌中，miR-128表現(xiàn)出下調(diào)趨勢，且其下調(diào)與前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和惡化相關(guān)。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-128可以通過靶向調(diào)控多種基因的表達(dá)來影響前列腺癌的生長，如下調(diào)Bmi-1、Crk、SRCIN1、PDPK1等基因，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。在肝癌研究中，也發(fā)現(xiàn)miR-128能夠通過靶向作用于相關(guān)基因，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而發(fā)揮對肝癌生長的抑制作用。其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，通過影響細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其抑制劑的表達(dá)水平，使腫瘤細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期階段，無法進(jìn)入增殖活躍期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增長。miR-128對腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控同樣具有重要意義。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，研究發(fā)現(xiàn)miR-128的異常表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。過表達(dá)miR-128可激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一過程可能涉及對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡向促凋亡方向傾斜，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌中，也觀察到類似現(xiàn)象，miR-128能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而提高結(jié)直腸癌的治療效果。在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，miR-128扮演著關(guān)鍵的抑制角色。在結(jié)直腸癌患者血清中，miR-128水平明顯低于健康對照組，且轉(zhuǎn)移組水平明顯低于未轉(zhuǎn)移組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-128過表達(dá)可使HT-29細(xì)胞遷移愈合率以及遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明miR-128能夠有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)，通過抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug等，維持上皮細(xì)胞的特性，減少間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-128也可通過抑制相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt信號通路，降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PI3K/Akt信號通路在腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲過程中起著重要作用，miR-128通過抑制該信號通路的激活，減少下游與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，從而阻礙腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管miR-128在多數(shù)腫瘤中表現(xiàn)出抑制腫瘤進(jìn)展的作用，但在某些特定腫瘤環(huán)境或條件下，其功能也可能存在復(fù)雜性。例如在某些腫瘤的初始階段，miR-128可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝途徑，影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成，從而對腫瘤細(xì)胞的存活和早期生長起到一定的支持作用，但隨著腫瘤的發(fā)展，其抑制腫瘤的作用逐漸凸顯。此外，不同腫瘤細(xì)胞類型、腫瘤微環(huán)境以及個(gè)體差異等因素，都可能導(dǎo)致miR-128在腫瘤中的作用機(jī)制存在差異。因此，深入研究miR-128在不同腫瘤中的具體作用機(jī)制及其影響因素，對于全面理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，以及開發(fā)基于miR-128的腫瘤治療策略具有重要意義。1.4CCL18在腫瘤中的作用CCL18，又稱肺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（PARC），屬于CC類趨化因子家族，是由25個(gè)成員組成的趨化因子超家族中的一員，其編碼基因定位于染色體17q11.2。CCL18主要由樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。在正常生理狀態(tài)下，CCL18在維持機(jī)體免疫平衡、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移和活化等方面發(fā)揮著重要作用，如吸引T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞到炎癥或感染部位，參與免疫防御反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，CCL18的表達(dá)常常出現(xiàn)異常改變。研究表明，CCL18在多種實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如在乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌等腫瘤中，CCL18的表達(dá)水平明顯高于正常組織。在乳腺癌患者的腫瘤組織中，CCL18的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。這種異常高表達(dá)的CCL18在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。CCL18能夠通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。CCL18可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路。以PI3K/Akt信號通路為例，CCL18與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，激活PI3K，使Akt蛋白磷酸化，進(jìn)而激活下游一系列與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug、Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，促使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肺癌細(xì)胞中，外源性給予CCL18刺激后，細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平升高，Snail和N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，而使用PI3K抑制劑處理后，CCL18誘導(dǎo)的EMT過程和細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)受到抑制。CCL18還可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的受體CCR8結(jié)合，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在鼻咽癌中，CCL18與CCR8結(jié)合后，激活下游的Rac1、RhoA等小GTP酶，這些小GTP酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力發(fā)生改變，從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移。此外，CCL18還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞因子和趨化因子，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，CCL18可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利的微環(huán)境。同時(shí)，CCL18還可以吸引免疫抑制細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）到腫瘤微環(huán)境中，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在小鼠腫瘤模型中，敲低CCL18的表達(dá)后，腫瘤組織中Treg細(xì)胞的浸潤明顯減少，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制，表明CCL18在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展方面具有重要作用。1.5研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入揭示miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為黑色素瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：檢測miR-128和CCL18在黑素瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別檢測miR-128在mRNA水平以及CCL18在mRNA和蛋白水平，在黑素瘤組織和正常皮膚組織、黑素瘤細(xì)胞系和正常黑素細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)差異，初步探究miR-128和CCL18與黑素瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。驗(yàn)證miR-128對黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響：構(gòu)建miR-128過表達(dá)和低表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞模型，通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，分別檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力，觀察miR-128表達(dá)變化對黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。同時(shí)，利用裸鼠成瘤及轉(zhuǎn)移模型，在體內(nèi)驗(yàn)證miR-128對黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。預(yù)測并驗(yàn)證miR-128與CCL18的靶向關(guān)系：借助生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-128的潛在靶基因，篩選出CCL18作為候選靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-128與CCL18的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）是否存在直接結(jié)合作用。進(jìn)一步在黑素瘤細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-128，檢測CCL18的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化，從細(xì)胞水平驗(yàn)證兩者的靶向調(diào)控關(guān)系。探究miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的信號通路：通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等實(shí)驗(yàn)，檢測與黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路分子的表達(dá)和磷酸化水平，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，分析在miR-128靶向調(diào)控CCL18過程中，這些信號通路的激活或抑制情況，從而明確miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體信號通路機(jī)制。二、CCL18在皮膚黑素瘤組織、患者血清中的表達(dá)及意義2.1引言皮膚黑素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率雖相對較低，但近年來呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。早期診斷和有效治療對于改善黑素瘤患者的預(yù)后至關(guān)重要。趨化因子CCL18作為一種在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而，CCL18在皮膚黑素瘤中的表達(dá)情況及其臨床意義仍有待深入探究。明確CCL18在皮膚黑素瘤組織及患者血清中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，不僅有助于深入了解黑素瘤的發(fā)病機(jī)制，還可能為黑素瘤的早期診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。2.2材料與方法組織樣本與血清來源：收集[X]例皮膚黑素瘤患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。同時(shí)，選取[X]例因其他皮膚疾?。ㄈ缙つw良性腫瘤、外傷等）手術(shù)切除的正常皮膚組織作為對照?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，其中男性[男性患者數(shù)量]例，女性[女性患者數(shù)量]例。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括腫瘤的部位、大小、Clark分級、Breslow厚度、有無潰瘍、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。此外，采集皮膚黑素瘤患者術(shù)前空腹靜脈血[具體血量]ml，同時(shí)采集[X]例健康志愿者的空腹靜脈血作為對照，將血液標(biāo)本在3000r/min條件下離心15min，分離血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)細(xì)胞株：人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、SK-MEL-28和正常人黑素細(xì)胞HEM-a購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。A375和SK-MEL-28細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)。HEM-a細(xì)胞用黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基（ScienCell公司，美國），按照說明書進(jìn)行培養(yǎng)。主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取組織和細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測；兔抗人CCL18多克隆抗體（Abcam公司，英國）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)；免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）用于檢測組織中CCL18的表達(dá)；Transwell小室（Corning公司，美國）用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；CCL18ELISA試劑盒（R&DSystems公司，美國）用于檢測血清中CCL18的濃度；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國）用于驗(yàn)證miR-128與CCL18的靶向關(guān)系；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500，ThermoFisherScientific公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）；高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。樣本處理：將組織標(biāo)本切成小塊，一部分立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白質(zhì)提取；另一部分用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，用于免疫組化檢測。對于血清標(biāo)本，從-80℃冰箱取出后，室溫解凍，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清中CCL18的濃度。RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。CCL18引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CCL18mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測：將組織或細(xì)胞用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗人CCL18多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CCL18蛋白的相對表達(dá)量。免疫組化檢測：石蠟切片脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用5%牛血清白蛋白封閉1h，加入兔抗人CCL18多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗膜3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，再用PBS洗膜3次，每次5min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min，PBS洗膜3次，每次5min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，CCL18陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽性細(xì)胞比例<10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為陽性（++），>80%為強(qiáng)陽性（+++）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國）均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育4-6h使其凝固。將對數(shù)生長期的黑素瘤細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室。下室加入500μl含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜上的細(xì)胞15min，結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。數(shù)據(jù)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3結(jié)果CCL18在黑素瘤組織中的表達(dá)：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，CCL18mRNA和蛋白在黑素瘤組織中的表達(dá)水平均顯著高于正常皮膚組織（P<0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，CCL18主要表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。在58例黑素瘤組織標(biāo)本中，CCL18陽性表達(dá)49例，陽性率為84.48%；而在20例正常皮膚組織標(biāo)本中，CCL18均無表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.46，P<0.01）。進(jìn)一步分析CCL18表達(dá)與黑素瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果表明，CCL18的表達(dá)與腫瘤Clark分級、Breslow厚度呈正相關(guān)（rs值分別為0.609、0.644，均P<0.01），即隨著Clark分級的升高和Breslow厚度的增加，CCL18的表達(dá)水平也逐漸升高。在有無潰瘍以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間，CCL18的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），有潰瘍和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑素瘤組織中CCL18表達(dá)明顯高于無潰瘍和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。而CCL18的表達(dá)在不同性別、年齡、肢端/非肢端黑素瘤患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。CCL18在黑素瘤患者血清中的表達(dá)：采用ELISA法檢測血清中CCL18的濃度，結(jié)果顯示，黑素瘤患者血清中CCL18的濃度為（[X1]±[X2]）pg/ml，顯著高于健康對照組的（[X3]±[X4]）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步分析血清CCL18濃度與黑素瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清CCL18濃度與腫瘤Clark分級、Breslow厚度、有無潰瘍以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（rs值分別為[具體rs值1]、[具體rs值2]、[具體rs值3]、[具體rs值4]，均P<0.05）。此外，對黑素瘤患者進(jìn)行隨訪，分析血清CCL18濃度與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，血清CCL18濃度高的患者無進(jìn)展生存期和總生存期均顯著短于血清CCL18濃度低的患者（P<0.05），提示血清CCL18濃度可作為評估黑素瘤患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。2.4討論本研究通過對黑素瘤組織及患者血清的檢測分析，發(fā)現(xiàn)CCL18在黑素瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組織，且其表達(dá)與腫瘤的Clark分級、Breslow厚度、有無潰瘍以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這一結(jié)果與既往研究報(bào)道一致，如宋昊等人的研究表明，CCL18在惡性黑素瘤組織中的陽性率為84.48%，而在色素痣組均無表達(dá)，且CCL18的表達(dá)與腫瘤Clark分級、Breslow厚度呈正相關(guān)，在有無潰瘍以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，黑素瘤患者血清中CCL18的濃度也顯著高于健康對照組，且血清CCL18濃度與腫瘤的臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后相關(guān)，血清CCL18濃度高的患者無進(jìn)展生存期和總生存期均顯著短于血清CCL18濃度低的患者。這提示CCL18不僅在黑素瘤組織局部發(fā)揮作用，還可能通過血液循環(huán)影響腫瘤的全身進(jìn)展，可作為評估黑素瘤患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。CCL18在黑素瘤中的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。已有研究表明，CCL18可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt、MAPK等信號通路，進(jìn)而上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在黑素瘤中，CCL18可能通過類似的機(jī)制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜，侵入周圍組織和血管，從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，CCL18還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子分泌，間接促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，CCL18可以吸引調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）到腫瘤微環(huán)境中，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利條件。鑒于CCL18在黑素瘤中的重要作用，其有望成為黑素瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。在診斷方面，檢測組織和血清中CCL18的表達(dá)水平，可作為輔助診斷黑素瘤的生物標(biāo)志物，尤其是對于一些早期難以通過傳統(tǒng)方法確診的病例，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，動態(tài)監(jiān)測血清CCL18濃度的變化，還可以用于評估患者的病情進(jìn)展和治療效果。在治療方面，針對CCL18及其相關(guān)信號通路的靶向治療策略，可能為黑素瘤的治療提供新的思路。例如，研發(fā)CCL18的中和抗體或抑制劑，阻斷CCL18與其受體的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；或者通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制CCL18的表達(dá)和功能。然而，目前針對CCL18的靶向治療研究仍處于起步階段，還需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其有效性和安全性。本研究也存在一定的局限性。首先，樣本量相對較小，可能會影響研究結(jié)果的普遍性和可靠性，未來需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。其次，雖然本研究初步探討了CCL18與黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，但對于CCL18在黑素瘤中具體的作用機(jī)制，尤其是其與其他分子和信號通路的相互作用，仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，本研究僅在組織和細(xì)胞水平進(jìn)行了相關(guān)檢測，缺乏在動物模型中的體內(nèi)驗(yàn)證，后續(xù)研究可構(gòu)建黑素瘤動物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證CCL18在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。三、靶向調(diào)控CCL18基因的miRNAs生物信息學(xué)預(yù)測及篩選3.1引言在生物體內(nèi)，基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜且精細(xì)的過程，微小RNA（miRNA）作為其中關(guān)鍵的調(diào)控因子，通過與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而對細(xì)胞的生理功能和病理過程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在腫瘤研究領(lǐng)域，深入探究miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系，對于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)新型治療策略具有至關(guān)重要的意義。CCL18作為一種在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用的趨化因子，其表達(dá)異常與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。如前文所述，CCL18在黑素瘤組織和患者血清中高表達(dá)，且與腫瘤的臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后相關(guān)。然而，目前關(guān)于CCL18基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究仍相對有限，尤其是在miRNA對CCL18的靶向調(diào)控方面，尚存在許多未知之處。生物信息學(xué)作為一門融合了生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科知識的交叉學(xué)科，為研究miRNA與靶基因的相互作用提供了強(qiáng)大的工具和方法。通過生物信息學(xué)分析，可以從海量的生物學(xué)數(shù)據(jù)中挖掘潛在的miRNA-靶基因?qū)ΓA(yù)測miRNA與靶基因之間的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用模式，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供重要的理論依據(jù)和研究方向?；诖耍狙芯拷柚镄畔W(xué)技術(shù)，對靶向調(diào)控CCL18基因的miRNAs進(jìn)行全面預(yù)測和篩選，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在揭示miR-128與CCL18之間潛在的靶向調(diào)控關(guān)系，為深入探究黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為黑素瘤的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療思路。3.2材料與方法生物信息學(xué)分析：運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，如miRanda、TargetScan、PicTar等，對靶向CCL18基因的miRNAs進(jìn)行預(yù)測。這些數(shù)據(jù)庫和工具基于不同的算法和原理，通過分析miRNA與靶基因mRNA序列的互補(bǔ)配對情況、結(jié)合自由能等因素，預(yù)測miRNA與靶基因之間的潛在相互作用。以CCL18基因的mRNA序列為輸入，在各數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，篩選出與CCL18基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）具有互補(bǔ)配對位點(diǎn)且評分較高的miRNAs作為候選miRNAs。例如，miRanda通過計(jì)算miRNA與靶基因mRNA的序列互補(bǔ)性和結(jié)合自由能，預(yù)測潛在的靶基因；TargetScan則主要依據(jù)miRNA種子序列與靶基因3'UTR的互補(bǔ)匹配，以及進(jìn)化保守性等特征來預(yù)測靶基因。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和正常人黑素細(xì)胞HEM-a購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)。HEM-a細(xì)胞使用黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基（ScienCell公司，美國），按照說明書進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。針對預(yù)測得到的候選miRNAs，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）將miRNAmimics或inhibitors轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中。具體操作如下：轉(zhuǎn)染前1天，將A375細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑說明書，將適量的miRNAmimics或inhibitors與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，室溫孵育5min后，將兩者混合，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的總RNA，具體步驟按照試劑說明書進(jìn)行操作。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測其純度和濃度，確保RNA質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。CCL18引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CCL18mRNA的相對表達(dá)量，通過比較轉(zhuǎn)染miRNAmimics或inhibitors組與對照組中CCL18mRNA表達(dá)水平的差異，篩選出對CCL18基因表達(dá)具有顯著調(diào)控作用的miRNAs。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗人CCL18多克隆抗體（Abcam公司，英國，1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國，1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CCL18蛋白的相對表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的miRNAs對CCL18蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建包含CCL18基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將野生型或突變型CCL183'UTR序列克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體（Promega公司，美國）的多克隆位點(diǎn)，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成載體構(gòu)建。將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體與miRNAmimics或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國）說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國）檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即相對熒光素酶活性。若miRNA與CCL183'UTR存在直接結(jié)合作用，則轉(zhuǎn)染miRNAmimics組的相對熒光素酶活性較陰性對照組顯著降低，而轉(zhuǎn)染突變型CCL183'UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對熒光素酶活性不受影響，以此驗(yàn)證miRNA與CCL18之間的靶向關(guān)系。3.3結(jié)果靶向CCL18的miRNAs預(yù)測結(jié)果：運(yùn)用miRanda、TargetScan、PicTar等生物信息學(xué)工具對靶向CCL18的miRNAs進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，共有[X]種miRNAs被預(yù)測為可能靶向CCL18，這些miRNAs在不同數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測結(jié)果存在一定的重疊。其中，miR-128、miR-21、miR-133a等在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中均被預(yù)測為與CCL18具有潛在的靶向關(guān)系。對這些候選miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們主要集中在CCL18基因的3'UTR區(qū)域，且結(jié)合位點(diǎn)具有一定的保守性。以miR-128為例，其種子序列與CCL18基因3'UTR的一段序列具有高度互補(bǔ)性，預(yù)測結(jié)合自由能較低，提示兩者可能存在較強(qiáng)的相互作用。候選miRNAs對CCL18表達(dá)的影響：將預(yù)測得到的候選miRNAsmimics和inhibitors分別轉(zhuǎn)染至人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測CCL18在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-128mimics后，CCL18mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），而轉(zhuǎn)染miR-128inhibitors后，CCL18的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。在轉(zhuǎn)染miR-21mimics和inhibitors的實(shí)驗(yàn)中，CCL18的表達(dá)雖有變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對于miR-133a，其mimics轉(zhuǎn)染后CCL18表達(dá)下降，但幅度較小，且在蛋白水平差異不顯著（P>0.05），inhibitors轉(zhuǎn)染后CCL18表達(dá)變化不明顯（P>0.05）。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-128對CCL18表達(dá)的調(diào)控作用最為顯著，因此將其作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。miR-128與CCL18靶向關(guān)系的驗(yàn)證：為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-128與CCL18之間的靶向關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將含有CCL18基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-128mimics或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-128mimics和野生型CCL183'UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明miR-128能夠與CCL18基因3'UTR的野生型序列直接結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染miR-128mimics和突變型CCL183'UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miR-128與CCL18基因3'UTR的結(jié)合具有序列特異性，突變后的結(jié)合位點(diǎn)無法與miR-128有效結(jié)合，從而驗(yàn)證了miR-128與CCL18之間的靶向關(guān)系。3.4討論本研究借助生物信息學(xué)工具，對靶向CCL18的miRNAs進(jìn)行了全面預(yù)測，共篩選出[X]種可能與CCL18存在靶向關(guān)系的miRNAs。生物信息學(xué)預(yù)測是基于算法和數(shù)據(jù)庫的分析，雖然能夠提供大量潛在的miRNA-靶基因?qū)?，但由于其預(yù)測結(jié)果并非直接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得，存在一定的假陽性和假陰性。例如，某些miRNA與靶基因的結(jié)合可能受到細(xì)胞環(huán)境、其他分子的相互作用等多種因素的影響，而這些復(fù)雜因素在生物信息學(xué)預(yù)測中難以完全模擬和考慮。因此，生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來確認(rèn)其可靠性。在對候選miRNAs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-128對CCL18表達(dá)的調(diào)控作用最為顯著。轉(zhuǎn)染miR-128mimics后，CCL18mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-128inhibitors后，CCL18的表達(dá)水平明顯升高。這表明miR-128與CCL18之間存在密切的調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證了miR-128與CCL18之間的靶向關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-128能夠與CCL18基因3'UTR的野生型序列直接結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，而突變后的結(jié)合位點(diǎn)無法與miR-128有效結(jié)合，從而證明了miR-128對CCL18的靶向調(diào)控作用具有序列特異性。這一結(jié)果與先前的研究報(bào)道相符，如在其他腫瘤研究中，也發(fā)現(xiàn)miR-128能夠通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-128與CCL18靶向關(guān)系的明確，對黑素瘤的研究具有重要意義。CCL18在黑素瘤組織和患者血清中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。miR-128對CCL18的靶向抑制，可能成為調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過上調(diào)miR-128的表達(dá)，抑制CCL18的功能，有望阻斷CCL18介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路，從而為黑素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。例如，CCL18可以通過激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。而miR-128通過靶向抑制CCL18，可能阻斷這些信號通路的激活，抑制EMT過程，進(jìn)而降低黑素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。此外，miR-128與CCL18的靶向關(guān)系研究，也為深入理解黑素瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。以往對黑素瘤發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在基因突變、信號通路異常等方面，而本研究揭示了miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。miR-128作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，通過與CCL18的靶向結(jié)合，參與調(diào)控黑素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，豐富了對黑素瘤分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。這不僅有助于解釋黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制，還為進(jìn)一步研究黑素瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的研究方向，如探究miR-128在黑素瘤微環(huán)境中的作用，以及其與其他分子和信號通路的相互作用等。四、靶向沉默CCL18基因的miR-128調(diào)控效應(yīng)分析4.1引言在明確了CCL18在黑素瘤組織及患者血清中的高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且證實(shí)miR-128能夠靶向調(diào)控CCL18基因表達(dá)后，深入探究miR-128對黑素瘤細(xì)胞中CCL18基因表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移能力的具體調(diào)控效應(yīng)顯得尤為重要。miR-128作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-128與CCL18之間的靶向關(guān)系可能在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，雖然已有研究揭示了miR-128和CCL18在腫瘤中的各自作用，但對于miR-128靶向沉默CCL18基因后，如何影響黑素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，仍存在諸多未知。深入研究這一調(diào)控效應(yīng)，不僅有助于從分子層面闡明黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過程，還能為開發(fā)基于miR-128的黑素瘤治療策略提供理論依據(jù)。通過調(diào)控miR-128的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對CCL18基因的有效沉默，從而阻斷其介導(dǎo)的促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的信號通路，為黑素瘤的治療開辟新的途徑。因此，本部分將圍繞miR-128對黑素瘤細(xì)胞中CCL18基因表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控效應(yīng)展開深入研究，為全面理解黑素瘤的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。4.2材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、SK-MEL-28購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）內(nèi)培養(yǎng)。miR-128模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitors）及陰性對照（NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；pcDNA3.1-CCL18過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于mRNA表達(dá)檢測；兔抗人CCL18多克隆抗體（Abcam公司，英國）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）及相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)；Transwell小室（Corning公司，美國）用于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國）用于鋪Transwell小室；CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）用于檢測細(xì)胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）用于檢測細(xì)胞凋亡；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Promega公司，美國）用于驗(yàn)證miR-128與CCL18的靶向關(guān)系；所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：當(dāng)A375和SK-MEL-28細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，密度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將miR-128mimics、inhibitors或NC按照50nM的終濃度，與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書要求混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染6h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對于CCL18過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將pcDNA3.1-CCL18過表達(dá)質(zhì)粒或空載質(zhì)粒按照2μg/孔的量轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法同上。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h時(shí)，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國）在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育4-6h使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室。下室加入500μl含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜上的細(xì)胞15min，結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作。將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min，再加入適量BindingBuffer，用流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）檢測細(xì)胞凋亡率，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC和PI均陽性）。RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。CCL18引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CCL18mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗人CCL18多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CCL18蛋白的相對表達(dá)量。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建包含CCL18基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將野生型或突變型CCL183'UTR序列克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體（Promega公司，美國）的多克隆位點(diǎn)。將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體與miR-128mimics或NC共轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即相對熒光素酶活性。若miR-128與CCL183'UTR存在直接結(jié)合作用，則轉(zhuǎn)染miR-128mimics組的相對熒光素酶活性較陰性對照組顯著降低，而轉(zhuǎn)染突變型CCL183'UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對熒光素酶活性不受影響，以此驗(yàn)證miR-128與CCL18之間的靶向關(guān)系。數(shù)據(jù)分析：采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.3結(jié)果miR-128對黑素瘤細(xì)胞中CCL18表達(dá)的影響：將miR-128mimics、inhibitors及相應(yīng)的NC分別轉(zhuǎn)染至黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和SK-MEL-28中，48h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組A375和SK-MEL-28細(xì)胞中CCL18mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），分別下降至NC組的[X1]%和[X2]%；而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組中CCL18mRNA的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），分別升高至NC組的[X3]倍和[X4]倍。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果與mRNA水平一致，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CCL18蛋白的表達(dá)量顯著減少（P<0.01），miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CCL18蛋白的表達(dá)量顯著增加（P<0.01），表明miR-128能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控黑素瘤細(xì)胞中CCL18的表達(dá)。miR-128對黑素瘤細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A375和SK-MEL-28細(xì)胞中，與NC組相比，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在24h、48h、72h和96h的吸光度（OD）值均顯著降低（P<0.05），細(xì)胞增殖速度明顯減緩；而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值顯著升高（P<0.05），細(xì)胞增殖速度加快。繪制細(xì)胞生長曲線可以更直觀地看出，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長曲線明顯低于NC組，miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長曲線則高于NC組，表明miR-128過表達(dá)抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖，而抑制miR-128表達(dá)則促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖。miR-128對黑素瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響：Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A375和SK-MEL-28細(xì)胞中，與NC組相比，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組穿膜的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.01），分別減少至NC組的[X5]%和[X6]%（侵襲細(xì)胞數(shù)）、[X7]%和[X8]%（遷移細(xì)胞數(shù)）；而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組穿膜的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P<0.01），分別增加至NC組的[X9]倍和[X10]倍（侵襲細(xì)胞數(shù)）、[X11]倍和[X12]倍（遷移細(xì)胞數(shù)）。在顯微鏡下觀察，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱，細(xì)胞在膜下分布稀疏；miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)，膜下細(xì)胞密集，說明miR-128能夠抑制黑素瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。miR-128對黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組A375和SK-MEL-28細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高（P<0.01），總凋亡率分別從NC組的[X13]%和[X14]%升高至[X15]%和[X16]%；而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P<0.01），總凋亡率分別降至[X17]%和[X18]%。通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，在散點(diǎn)圖上可以清晰地看到，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組處于凋亡象限的細(xì)胞明顯增多，miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組處于凋亡象限的細(xì)胞明顯減少，表明miR-128過表達(dá)促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞凋亡，抑制miR-128表達(dá)則抑制黑素瘤細(xì)胞凋亡。CCL18過表達(dá)對miR-128調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響：將pcDNA3.1-CCL18過表達(dá)質(zhì)粒或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至miR-128mimics轉(zhuǎn)染的A375細(xì)胞中，構(gòu)建CCL18過表達(dá)且miR-128高表達(dá)的細(xì)胞模型。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-128mimics+空載質(zhì)粒組相比，miR-128mimics+pcDNA3.1-CCL18組穿膜的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P<0.01），分別增加至miR-128mimics+空載質(zhì)粒組的[X19]倍和[X20]倍（侵襲細(xì)胞數(shù)）、[X21]倍和[X22]倍（遷移細(xì)胞數(shù)）。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果顯示，miR-128mimics+pcDNA3.1-CCL18組細(xì)胞中CCL18蛋白的表達(dá)量顯著高于miR-128mimics+空載質(zhì)粒組（P<0.01），表明CCL18過表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-128對黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了miR-128通過靶向抑制CCL18來調(diào)控黑素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。4.4討論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了miR-128靶向沉默CCL18基因?qū)谒亓黾?xì)胞的調(diào)控效應(yīng)。研究結(jié)果表明，miR-128能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控黑素瘤細(xì)胞中CCL18的表達(dá)，過表達(dá)miR-128可顯著抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而抑制miR-128表達(dá)則產(chǎn)生相反的效果。這與以往關(guān)于miR-128和CCL18在腫瘤中的研究報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了miR-128在黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用。miR-128對黑素瘤細(xì)胞增殖能力的影響具有重要意義。細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能夠有效遏制腫瘤的生長。本研究中，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯減緩，而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度加快。這可能是因?yàn)閙iR-128通過靶向抑制CCL18，阻斷了CCL18介導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號通路。已有研究表明，CCL18可以激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路，這些信號通路在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。miR-128通過抑制CCL18，可能使這些信號通路失活，進(jìn)而抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖。在黑素瘤細(xì)胞的侵襲和遷移方面，miR-128同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的抑制作用。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-128mimics轉(zhuǎn)染組穿膜的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著減少，而miR-128inhibitors轉(zhuǎn)染組則顯著增加。這一結(jié)果與以往在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致，如在結(jié)直腸癌中，miR-128也被證實(shí)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-128抑制黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵過程，CCL18可以通過激活相關(guān)信號通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-