ICS11.220B41備案號：DB42甲型H1N1流感病毒雙抗體ELISA檢測方法MethodoftheELISAtestforthedetectionofsubtypeA/H1N1influenzavirus湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB42/T790—2012前言 12縮略詞 13實(shí)驗(yàn)原理 14實(shí)驗(yàn)條件 15實(shí)驗(yàn)材料 16樣品處理 27實(shí)驗(yàn)方法 28結(jié)果判定 39注意事項(xiàng) 3 4DB42/T790—2012本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院、武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司、湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：金梅林、鐘廣漢、趙剛、孫小美、李淑云、郭學(xué)波、康超、周艷君、董曉輝、DB42/T790—2012甲型H1N1流感病毒已對人類公共衛(wèi)生安全造成重大威脅，并在豬群等哺乳動(dòng)物之中廣泛傳播，給人類和畜牧業(yè)帶來重大災(zāi)難。為鑒別診斷甲型H1N1流感病毒(北美流感)和經(jīng)典H1N1流感病毒，特制定《甲型H1N1流感病毒雙抗體ELISA檢測方法》，本方法可以區(qū)分甲型H1N1流感病毒(北美流感)和經(jīng)典H1N1流感病毒。DB42/T790—20121甲型H1N1流感病毒雙抗體ELISA檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甲型H1N1流感病毒的雙抗體ELISA檢測方法的縮略詞、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料、樣品處理、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測豬的鼻拭子、內(nèi)臟組織、雞胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物中的甲型H1N1流感病毒。2縮略詞下列縮略詞適用于本文件。ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)OD630nm值：630納米波長處的吸光值HRP：辣根過氧化物酶S：樣品測定孔OD630nm值3實(shí)驗(yàn)原理本方法用抗甲型H1N1流感病毒的單克隆抗體包被固相載體酶標(biāo)板。加入待檢樣品后，如果待檢物中含有甲型H1N1流感病毒即可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，洗板后，加入HRP標(biāo)記的抗甲型H1N1流感病毒的單克隆抗體，能繼續(xù)反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，復(fù)合物中的酶能催化底物反應(yīng)發(fā)生顯色。其顯色的深淺與相應(yīng)的抗體量成正比，可借助OD630nm值的大小進(jìn)行定性判斷。4實(shí)驗(yàn)條件4.1實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作宜在常溫（18℃~25℃)進(jìn)行。4.2儀器臺式低溫高速離心機(jī)、微量移液器、冰箱、恒溫箱、酶標(biāo)檢測儀。4.3人員注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。5實(shí)驗(yàn)材料5.1抗甲型H1N1流感病毒的單克隆抗體。5.2酶標(biāo)板：96孔板，可拆。5.3酶結(jié)合物：HRP標(biāo)記的抗甲型H1N1流感病毒的單克隆抗體。2DB42/T790—20125.4陽性對照：含甲型H1N1流感病毒的雞胚尿囊液滅活處理。5.5陰性對照：未接種甲型H1N1流感病毒的雞胚尿囊液。5.6其他試劑：包被液、封閉液、洗滌液、樣品處理液A、樣品處理液B、底物液A、底物液B、終止液（見附錄A）6樣品處理6.1鼻拭子用無菌棉拭子于豬鼻腔中沾取滲出液，然后浸泡于1mL樣品處理液B中，渦旋儀震蕩1min后擠出棉拭子中的液體，凍融3次后于37℃孵育15min，12,000r/min離心5min，取上清。6.2內(nèi)臟組織剪取組織塊約1g，置于勻漿器中，加入1mL樣品處理液A后勻漿，凍融3次后，置于37℃下15min，10,000r/min離心5min，取上清。6.3雞胚尿囊液用樣品處理液B等體積稀釋后，置于37℃下15min，每隔3min～5min混勻1次，10,000r/min離心30sec～60sec，取上清。6.4細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可直接用于檢測或者凍融一次后檢測。7實(shí)驗(yàn)方法7.1抗甲型H1N1流感病毒的單克隆抗體用包被液稀釋到工作濃度（2μg/mL加入酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃孵育2h。加入封閉液，200μL/孔，于37℃封閉2h，取出酶標(biāo)板在吸水紙上拍干，于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?.2先用洗滌液200μL/孔洗板1次，加入處理好的樣品，100μL/孔；同時(shí)設(shè)陽性對照和陰性對照各1孔，100μL/孔，37℃孵育30min。7.3棄去孔中液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗板3次，200μL/孔。每次靜置3min后倒掉液體，在吸水紙上拍干。7.4加入酶結(jié)合物，100μL/孔，37℃孵育30min。7.5重復(fù)7.3步驟。7.6每孔加底物液A和底物液B各一滴（約50μL），混勻，置室溫下（18℃~25℃)避光顯色10min。7.7每孔加終止液一滴（約50μL），混勻。7.8用酶標(biāo)儀測定各孔的OD630nm值，應(yīng)在加入終止液后10min內(nèi)完成。8結(jié)果判定8.1ELISA試驗(yàn)成立的條件為：陽性對照孔OD630nm值≥0.8；陰性對照孔OD630nm值＜0.2。8.2如果S≥0.25，判為陽性；如果S＜0.25，判為陰性。DB42/T790—201239注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)過程中注意做好個(gè)人的生物安全防護(hù)措施，廢棄物應(yīng)做無害化處理。DB42/T790—20124（規(guī)范性附錄）試劑的配置A.1包被液碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.2封閉液5g脫脂乳溶于100mL洗滌液。置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.3洗滌液氯化鈉（NaCl）8g氯化鉀（KCl）0.2g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.4樣品處理液A四硼酸鈉（Na2B4O7?10H2O）13.3g硼酸（H3BO3）16.08g氯化鈉（NaCl）8.5g加蒸餾水或去離子水800mL，調(diào)pH值至8.4后定容至1000mL，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.5樣品處理液BN-乙酰-L-半胱氨酸5gNP-405mL加1000mL經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min的樣品處理液A，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.6底物液A磷酸氫二鈉（Na2HPO4）14.6g檸檬酸9.33g過氧化氫脲0.52gDB42/T790—20125加蒸餾水或去離子水定容至1000mL，調(diào)至pH值至5.0～5.4，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.7底物液B磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）14.2g檸檬酸