1緒論植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，近三十年來(lái)由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，發(fā)表文獻(xiàn)浩如煙海，幾乎以植物為研究對(duì)象的各個(gè)分支學(xué)科都在廣泛進(jìn)行組織培養(yǎng)。1902年，德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt根據(jù)細(xì)胞學(xué)說(shuō)，提出單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論?！醪匠晒Γ?904年，Hanning最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚?！_(kāi)始大量的實(shí)驗(yàn)研究，技術(shù)逐步完善→1960年“蘭花工業(yè)”的巨大利潤(rùn)沖擊→促使新一輪研究熱潮的興起→奠定了新興獨(dú)立的學(xué)科→植物組織培養(yǎng)學(xué)。

目前達(dá)到的水平：從任何植物的器官、組織、細(xì)胞，甚至沒(méi)有細(xì)胞壁的裸露原生質(zhì)體中再生小植株。在這一技術(shù)的發(fā)展上，各國(guó)競(jìng)相投資，在快繁、脫毒、育種、次生代謝物生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保存方面取得了巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益。第一章：植物組培的基本理論第一節(jié)：植物組培的概念一、概念：廣義的定義：離體（invitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無(wú)菌情況下培養(yǎng)、生長(zhǎng)、發(fā)育再生出完整植株的過(guò)程。將離體的植物的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)長(zhǎng)成完整的植株。根據(jù)外植體的來(lái)源的不同，又可以分為：組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對(duì)象可分為植株、器官、組織、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等：、植株培養(yǎng)(plantculture)：是對(duì)完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株培養(yǎng)。(2)、器官培養(yǎng)(organculture)：即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同，包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實(shí)等外植體培養(yǎng)。

(3)、組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissue。rcallusculture)：為狹義的組織培養(yǎng)，是對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，二者均通過(guò)再分化誘導(dǎo)形成植株。

(4)、細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)：是對(duì)由愈傷組織等進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)所得到的，能保持較好分散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞，或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。

(5)、原生質(zhì)體培養(yǎng)(proplastculture)：用酶及物理方法除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。

根據(jù)培養(yǎng)條件的不同，又可分為：液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)半固體培養(yǎng)光培養(yǎng)暗培養(yǎng)二、常用名詞的解釋?zhuān)?、愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。器官發(fā)生→植株胚狀體發(fā)生→人工種在子、轉(zhuǎn)基因材料外植體→愈傷組織→懸浮細(xì)胞培養(yǎng)→次生代謝物的培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)→細(xì)胞融合2、外植體（explant)：由活體（invivo)植物體上提取下來(lái)的，接種在培養(yǎng)基上的無(wú)菌細(xì)胞、組織、器官等。幾十年來(lái)，人們廣泛嘗試使用不同的材料作外植體，如Haberlandt用葉肉細(xì)胞、髓細(xì)胞、腺毛、雄蕊毛、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞。由于對(duì)細(xì)胞性質(zhì)和條件摸索的不夠，均未成功。基本上要用薄壁組織，而成熟組織如機(jī)械組織、輸導(dǎo)組織、分泌組織不易成功（如山西農(nóng)科院用果柄）。復(fù)習(xí)組織的類(lèi)型）第二節(jié)：植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)

一、植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性（totipotent)：植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。差異：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性?？茖W(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過(guò)程，就是植物組織培養(yǎng)。二、植物細(xì)胞全能性的表達(dá)分化：脫分化（dedifferentiation）：將來(lái)自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來(lái)，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。再分化（redifferentiation）：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類(lèi)型的能力。三、外植體離體分化過(guò)程的類(lèi)型：1、無(wú)菌短枝型：也稱(chēng)節(jié)培法或微型扦插法。將待繁殖的材料剪成帶一葉的單芽莖段轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基，一定時(shí)間后可成苗，再剪成帶一葉的單芽莖段，繼代又可成苗。特點(diǎn)：該方法一次成苗，遺傳性穩(wěn)定，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，適用范圍大，移栽容易成活。試管繁殖常用，也是其他方法最后階段常用的方法，但初期繁殖速度慢。2、叢生芽增殖型：莖尖或初代培養(yǎng)的芽，在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，不斷發(fā)生腋芽而成叢生芽，然后再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根成苗，擴(kuò)大繁殖。特點(diǎn)：這種方法從芽到芽，遺傳性穩(wěn)定，繁殖速度快，是莖尖培養(yǎng)和脫毒苗初期的必由之路。但過(guò)程復(fù)雜，品種差異大。3、由愈傷組織再分化，有下面兩種方式：A．不定芽方式（unfixedbud）指愈傷組織培養(yǎng)物，通過(guò)形成不定芽再生成植株，這是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中常見(jiàn)的器官發(fā)生方式。愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：（1）愈傷組織公有根或芽器官的分別形成，即無(wú)根的芽或無(wú)芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸長(zhǎng)后，在其莖的基部長(zhǎng)出極而形成小植株，多數(shù)植物屬這種情況；（3）先產(chǎn)生根，再?gòu)母幕糠只鲅慷纬尚≈仓辍＿@種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對(duì)于單子葉植物；（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合形成一小植株。B．胚狀體方式（somaticembryo）指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。（以后章節(jié)中介紹）4、原球莖型第三節(jié)：植物組培的特點(diǎn)一、培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。二、生長(zhǎng)周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)較快。另外，植株也比較小，往往20—30d為一個(gè)周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來(lái)說(shuō)成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。三、管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營(yíng)養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來(lái)農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲(chóng)害等一系列繁雜勞動(dòng)，可節(jié)省人力、物力及田間種植所需要土地。四、植物組織培養(yǎng)的材料經(jīng)濟(jì)取材少，培養(yǎng)效果好，對(duì)品種推廣及復(fù)壯均有意義。非洲紫羅蘭的一枚葉片，三個(gè)月可以得到5000株苗。

2第二章：植物組培的發(fā)展和應(yīng)用第一節(jié)：發(fā)展簡(jiǎn)史一、植物組織培養(yǎng)的探索階段：1838-1839年，德國(guó)科學(xué)家Schleide和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說(shuō)，奠定組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)。

1902年，德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt根據(jù)細(xì)胞學(xué)說(shuō)，提出單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。

1904年，Hanning最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。

1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。

1934年，White用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。

二、植物組織培養(yǎng)的技術(shù)建立階段：1933年李繼侗培養(yǎng)了銀杏離體胚，3mm大小的胚可培養(yǎng)成功，用胚乳、種子、果實(shí)提取物促使胚發(fā)育。1934年美國(guó)的White由番茄根建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系，并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了真正的成功，并在以后28年間培養(yǎng)了1600代。這之后，White又以小麥根尖為材料，研究了光、溫度、通氣、pH值、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對(duì)生長(zhǎng)的影響，并于1937年建立了第一個(gè)組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成分均為已知化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來(lái)被定名為White培養(yǎng)基。Gautherer(1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了B族維生素和生長(zhǎng)素對(duì)組織培養(yǎng)的重要意義，并于1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜均建立了與上述類(lèi)似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被譽(yù)為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本上都是由這三位科學(xué)家建立的。后來(lái)，White于1943年發(fā)表了《植物組織培養(yǎng)手冊(cè)》專(zhuān)著，使植物組織培養(yǎng)開(kāi)始成為一門(mén)新興的學(xué)科。40年代Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素(1AA)對(duì)芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時(shí)，產(chǎn)生芽；這一比例低時(shí)，則形成根；相等則不分化。在尋找促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)過(guò)程中，Miller等人于1956年發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素。不久即知道激動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽，并且效果可增加3萬(wàn)倍。結(jié)果上述控制器官分化的激素模式變?yōu)榧?dòng)素與生長(zhǎng)素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)，有力地推動(dòng)了植物組織培養(yǎng)的發(fā)展。

1952年；Morel和Martin通過(guò)莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無(wú)病毒植株。1935-1945年Muir把單細(xì)胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂，即實(shí)施看護(hù)接種技術(shù)，使單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。

1958年，英國(guó)科學(xué)家Steward等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。三、植物組培的迅速發(fā)展階段：1960年，Morel提出了一個(gè)離體無(wú)性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有很大的應(yīng)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。

1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無(wú)壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實(shí)踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。80年代中期以來(lái)，對(duì)禾谷類(lèi)作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國(guó)學(xué)者做出了重要貢獻(xiàn)。1962年，Murashinge和Skoog在煙草培養(yǎng)中篩選出仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。

1964-1966年，印度科學(xué)家Guha和Maheswari在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。

1972年，Carlson通過(guò)兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。Cocking等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交，研究得到了迅速發(fā)展，已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細(xì)胞增殖分化生成雜種植株。

在整個(gè)植物組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中，我國(guó)學(xué)者做出多方面的貢獻(xiàn)，除了前述的崔徵的研究成效以外，還有1993年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的研究工作，以及羅士韋關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚的研究培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚的研究培養(yǎng)工作。第二節(jié)：植物組培的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個(gè)廣闊領(lǐng)域，除了在基礎(chǔ)理論的研究上占有重要地位以外，還在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

一、快速繁殖種苗(rapidpropagation)

用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括花卉觀賞植物、蔬菜、果樹(shù)、大田作物及其他經(jīng)濟(jì)作物?？旆奔夹g(shù)不受季節(jié)等條件的限制，生長(zhǎng)周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖。

快速繁殖可用下列手段進(jìn)行：通過(guò)莖尖、莖段、鱗莖盤(pán)等產(chǎn)生大量腋芽；通過(guò)根、葉等器官直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。試管快速繁殖應(yīng)用在下列生產(chǎn)或研究中：(1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無(wú)病毒苗。(3)繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養(yǎng)周期短，增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)，加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。組織培養(yǎng)突出的優(yōu)點(diǎn)是"快"，通過(guò)這一方法在較短時(shí)期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量，以一個(gè)莖尖或一小塊葉片為基數(shù)，經(jīng)組織培養(yǎng)一年內(nèi)可增殖到10000-100000株。

二、無(wú)病毒苗(virusfree)的培養(yǎng)

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中幾乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類(lèi)甚至同時(shí)受到數(shù)種病毒病的危害，尤其是很多園藝植物靠無(wú)性方法來(lái)增殖，若蒙受病毒病，代代相傳，越染越重，甚至?xí)斐蓸O嚴(yán)重的后果。自從Morell952年發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)方法可得到無(wú)病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結(jié)合，則可提高脫毒培養(yǎng)的效果。對(duì)于木本植物，莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長(zhǎng)，則可采用莖尖微體嫁接的方法來(lái)培育無(wú)病毒苗。

組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用，如馬鈴薯，甘薯，草莓，蘋(píng)果，香石竹，菊花等。而且已有不少地區(qū)建立了無(wú)病毒苗的生產(chǎn)中心，這對(duì)于無(wú)病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個(gè)規(guī)范的系統(tǒng)程序，從而達(dá)到了保持園藝植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。

三、在育種上的應(yīng)用(breeding)1、胚培養(yǎng)：種屬間遠(yuǎn)緣雜交：由于生理代謝等方面的原因，雜種胚常常停止發(fā)育，不能得到雜種植物，通過(guò)胚培養(yǎng)就可保證遠(yuǎn)緣雜交的順利進(jìn)行。到50年代在實(shí)踐上的應(yīng)用就更多了，如在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鳶尾等等許多園藝植物遠(yuǎn)緣雜交育種上都得到了應(yīng)用。大白菜X甘藍(lán)的遠(yuǎn)緣雜交種"白蘭"，就是通過(guò)雜種胚的培養(yǎng)而得到的。胚挽救：對(duì)早期發(fā)育幼胚因太小難以培養(yǎng)的種類(lèi)，還可采用胚珠和子房培養(yǎng)來(lái)獲得成功。利用胚珠和子房培養(yǎng)也可進(jìn)行試管受精，以克服柱頭或花柱對(duì)受精的障礙，使花粉管直接進(jìn)入胚珠而受精。2、花粉植株：花藥、花粉的培養(yǎng)在蘋(píng)果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍(lán)、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)過(guò)多代自交，而單倍體育種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。

3、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交（細(xì)胞融合）：已有多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植物，有些植物得到體細(xì)胞雜種，無(wú)論在理論和實(shí)踐上都有重要價(jià)值。隨著這方面工作的深入和水平的提高，原生質(zhì)體培養(yǎng)一定會(huì)在育種上產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。（山大夏光敏的抗鹽小麥。）4、染色體加倍：四倍體巨玫――河北農(nóng)大羅躍武5、突變體篩選：突變的產(chǎn)生因部位而異，莖尖遺傳性比較穩(wěn)定，根、莖、葉乃至愈傷組織和細(xì)胞的培養(yǎng)則變異率就較大。培養(yǎng)基的激素也會(huì)誘導(dǎo)變異，因濃度而不同。此外還可采用紫外線、x射線、Y射線對(duì)材料進(jìn)行照射，來(lái)誘發(fā)突變的產(chǎn)生。在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生多倍體、混倍體現(xiàn)象的比較多，產(chǎn)生的變異為育種提供的材料，可以根據(jù)需要進(jìn)行篩選。利用組織培養(yǎng)，采用與微生物篩選相似的技術(shù)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行突變體的篩選更加富有成效。

6、如用花藥培養(yǎng)單倍體植株；用原生質(zhì)體進(jìn)行個(gè)體細(xì)胞雜交和基因轉(zhuǎn)移；用子房、胚和胚珠完成胚的試管發(fā)育和試管受精，以及種質(zhì)資源的保存等等。

四、工廠化育苗(industrializingpropagation)

組織培養(yǎng)育苗工廠化生產(chǎn)，是以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在含有植物生長(zhǎng)發(fā)育必需物質(zhì)的人工合成培養(yǎng)基上，并附加一定量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，把脫離于完整植株的本來(lái)已經(jīng)分化的植物器官或細(xì)胞，接種在不同的培養(yǎng)基上。在一定的溫度、光照、濕度及pH值條件下，利用細(xì)胞的全能性以及原有的遺傳基礎(chǔ)，促使細(xì)胞重新分裂、分化長(zhǎng)成新的組織、器官或不定芽，最后長(zhǎng)成和母株同樣的小植物體。例如非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)育苗的工廠化生產(chǎn)，就是取樣品株一定部位的葉片為材料，消毒后切成一定大小的塊，接種在適宜的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，兩個(gè)月左右在切口處產(chǎn)生不定芽，這些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此繼續(xù)，即可獲得批量的幼小植株，按需要量生產(chǎn)與樣品株完全相同的苗子。工廠化生產(chǎn)組織培養(yǎng)育苗，是按一定工藝流程和規(guī)范化程序生產(chǎn)的，不但具有繁殖速度快、整齊、一致、無(wú)蟲(chóng)少病、生長(zhǎng)周期短、遺傳性穩(wěn)定的特點(diǎn)，而且還可以加速產(chǎn)品的發(fā)展，獲得繁殖無(wú)性系。特別是對(duì)一些繁殖系數(shù)低、雜合的材料有性繁殖優(yōu)良性狀易分離、或從雜合的遺傳群體中篩選出表現(xiàn)型優(yōu)異的植株，需要保持其優(yōu)良遺傳性，有更重要的作用。另外，組織培養(yǎng)育苗的無(wú)毒化生產(chǎn)，還可減少病害傳播，更符合國(guó)際植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)的要求，擴(kuò)大產(chǎn)品的流通渠道，增加產(chǎn)品市場(chǎng)的銷(xiāo)售能力，同時(shí)可以減少氣候條件對(duì)幼苗繁殖的影響，緩和淡、旺季的供需矛盾。世界上一些先進(jìn)國(guó)家園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展從60年代就已經(jīng)開(kāi)始，并隨著生長(zhǎng)、分化規(guī)律性探索的逐步深化，到了70年代僅花卉業(yè)就已在蘭花、百合、非洲菊、大巖桐、菊花、香石竹、矮牽牛等二十幾種花卉幼苗生產(chǎn)上建立起大規(guī)模試管苗商品化生產(chǎn)，到1984年世界花卉幼苗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)總值已達(dá)20億美元，其中美國(guó)花卉幼苗市場(chǎng)總值為6億多美元，日本三友種苗公司有60％的幼苗靠組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖。1985年僅蘭花一項(xiàng)，在美國(guó)注冊(cè)的公司就有100余家，年銷(xiāo)售額在1億美元以上。由于組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，加快了花卉新品種的推廣。以前靠常規(guī)方推廣一個(gè)新品種要幾年甚至十多年，而現(xiàn)在快的只要1-2年就可在世界范圍內(nèi)達(dá)到普及和應(yīng)用。

我國(guó)采用快速繁殖技術(shù)，也使優(yōu)良品種達(dá)到迅速的推廣和應(yīng)用。如在廣東切花菊"黃秀風(fēng)"應(yīng)用，使菊花變大長(zhǎng)勢(shì)加強(qiáng)，花色鮮艷抗病力增強(qiáng)，打開(kāi)香港市場(chǎng)，使30多種觀葉植物的推廣很快遍及全國(guó)，并將自然界的幾百個(gè)野生金錢(qián)蓮品種繁種馴化，培養(yǎng)了園林垂直綠化的材料，。

組織培養(yǎng)也存在困難，首先是繁殖效率與商品需要量的矛盾，有些作物繁殖方法尚未解決無(wú)法滿足生產(chǎn)的需要，其次在培養(yǎng)過(guò)程中如何減少變異株。應(yīng)降低成本，才能更好的投產(chǎn)應(yīng)用。

總之，隨組培的發(fā)展及各種培養(yǎng)方法的應(yīng)用，在遺傳育種、品種繁育等方面表現(xiàn)巨大的潛力，特別是生物工程和工廠化育苗實(shí)施后，將以新興產(chǎn)業(yè)的面目在技術(shù)革命中發(fā)揮重大作用。

五、基因工程基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過(guò)組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。

六、次生代謝物的生產(chǎn)――生物制品有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物紫杉醇等，可用大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)直接生產(chǎn)。近年國(guó)內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得生長(zhǎng)量高達(dá)0.49gFW/（gFW·d）的細(xì)胞系，每升細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)0.25mg。七、人工種子

3第三章組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。組培實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)沒(méi)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行的。要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。1實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無(wú)菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。2實(shí)驗(yàn)室組成：化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、洗滌菌室、無(wú)菌操作室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)室（準(zhǔn)備室）：各種藥品的貯備、稱(chēng)量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備：藥品柜、防塵櫥、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計(jì)及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設(shè)備：水池、操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。無(wú)菌操作室（接種室）：主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無(wú)菌操作的技術(shù)程序。主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺(tái)、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門(mén)，以減少開(kāi)關(guān)門(mén)時(shí)的空氣擾動(dòng)。接種室要求干爽安靜清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門(mén)窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問(wèn)，面積1m2為宜。進(jìn)入無(wú)菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周?chē)鷫Ρ谝笥薪^熱防火的性能。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高1．7m左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，則長(zhǎng)I．3m，30W的長(zhǎng)lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室溫度保持在20—27℃室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度以保持在70%～80%為好，可安裝加濕器?？刂乒庹諘r(shí)間可安裝定時(shí)開(kāi)關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長(zhǎng)日照植物需要長(zhǎng)日照條件?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室多采用天然太陽(yáng)光照作為主要能源，不但節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。主要設(shè)備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：用于對(duì)培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)等。主要設(shè)備：雙筒實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。其他小型儀器設(shè)備：分注器、血球計(jì)數(shù)器、移液槍、過(guò)濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺(tái)式離心機(jī)等。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件一、營(yíng)養(yǎng)條件——培養(yǎng)基(culturemedium)培養(yǎng)基：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了各自的特殊要求才能很好地生長(zhǎng)。沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類(lèi)型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。培養(yǎng)基的種類(lèi)根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行分析，據(jù)植物從土中主要吸收無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)出由無(wú)機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍作為基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White在40年代用得較多現(xiàn)在還常用。60和70年代多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，以保證培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要，并能生長(zhǎng)快、分化快，且由于濃度高，在配制消毒過(guò)程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基離子平衡。培養(yǎng)基的名稱(chēng)根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名字來(lái)命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)，也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱(chēng)作改良培養(yǎng)基。1、常用培養(yǎng)基類(lèi)型：(1)：MS培養(yǎng)基是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來(lái)的。(2)：B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是含較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。實(shí)踐得知有些植物在B5上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。(3)：White培養(yǎng)基1943年White為培養(yǎng)番茄根尖設(shè)計(jì)。1963年作了改良，稱(chēng)White改良培養(yǎng)基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。（4）：N6培養(yǎng)基1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)。成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。(5)：KM—8P培養(yǎng)基1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。2、培養(yǎng)基的成分A－水：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持成分的精確性，防止貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。B－無(wú)機(jī)元素(inorganicelement)C－大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。制備培養(yǎng)基以NO3－N和NH－N形式供應(yīng)。多數(shù)培養(yǎng)基既含有N03—N又含NH4—N。NH4—N對(duì)植物生長(zhǎng)較有利。供應(yīng)物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。有時(shí)也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。(2)P是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。(3)K對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過(guò)大，一般為1—3mg／L為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCI、KN03等鹽類(lèi)提供。(4)Mg、S和Ca、Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組分。常以MgSO4·7H20提供。用量為1－3mg／l較適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2·2H2O提供。D－微量元素指小于0.5mmol／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。（1）鐵：是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO4·7H20和Na2—EDTA結(jié)合成合物使用。（2）B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等：也是植物組培不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)、發(fā)育異?，F(xiàn)象。E－有機(jī)化合物(organiccompound)培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱(chēng)為基本培養(yǎng)基（basicmedium)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。有機(jī)成分主要有以下幾類(lèi)：（1）碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組培中也有應(yīng)用。蔗糖濃度在2%－3%，常用3%，配制1升培養(yǎng)基稱(chēng)取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5%，但在胚培養(yǎng)時(shí)采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類(lèi)對(duì)生長(zhǎng)的影響不同，對(duì)水稻根培養(yǎng)的影響來(lái)看，葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類(lèi)需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱(chēng)取，不能任意取量。高壓滅菌時(shí)，一部分糖會(huì)發(fā)生分解，制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。（2）維生素(vitamin)：這類(lèi)化合物在植物細(xì)胞里以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)分化等有很好的促進(jìn)。雖然大多數(shù)植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長(zhǎng)。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0．1—1．0mg／L。有時(shí)用量較高。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。（3）肌醇(myo—inosltol)：又叫環(huán)己六醇，在糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽(yáng)離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為lOOmg／L，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。（4）氨基酸(alminoacide)是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。最常用的氨基酸是甘氨酸，其他如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時(shí)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，是牛乳用酶法加工的水解產(chǎn)物，含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之間。由于營(yíng)養(yǎng)豐富極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。（5）天然復(fù)合物：成分復(fù)雜，多含氨基酸、激素、酶等復(fù)雜化合物。對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯促進(jìn)，對(duì)器官分化作用不明顯。成分不清楚，盡量避免使用。1)椰乳椰子的液體胚乳。使用最多、效果最大。使用濃度在10%—20%，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯促進(jìn)作用，莖尖組織大小若超過(guò)1nun時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。2)香蕉用量為150-200ml／L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?duì)pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。3)馬鈴薯(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。用量為150—200g／L。對(duì)pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4)水解酪蛋白為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分為氨基酸和維生素類(lèi)；麥芽提取液(0.01%～0.5%)、蘋(píng)果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。二、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物(hormone)是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂發(fā)育，及植物的形態(tài)建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許多生理生化活動(dòng)，是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。（1）生長(zhǎng)素類(lèi)(auxin)用于誘導(dǎo)愈傷組織形成、根分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。根對(duì)生長(zhǎng)素最敏感。在極低的濃度下(10-5—10-8rng／L)就可促進(jìn)生長(zhǎng)，其次是莖和芽。天然生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組培常用人工合成的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)。IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)：是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，活力較低，是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)：在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。IBA(indolebutyriacid吲哚丁酸)：是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。2，4－D(2，4－二氯苯氧乙酸)：起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜用量范圍較狹窄，過(guò)量常有毒效應(yīng)。（2）細(xì)胞分裂素類(lèi)(cytokinin)腺嘌吟的衍生物，包括6—BA(6—芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動(dòng)素)、Zt(zeatin玉米素)等。Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6－BA。細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。（3）GA(gibberellicacid赤霉素)：有20多種，生理活性及作用的種類(lèi)、部位、效應(yīng)等各有不同。培養(yǎng)基中添加的是GA3，用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；GA和生長(zhǎng)素協(xié)同作用對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長(zhǎng)素／GA值高利于木質(zhì)部分化，低利于韌皮部分化；GA還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。在器官形成后，添加GA可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。三、激素配比模式生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素的比例決定發(fā)育方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)降低生長(zhǎng)素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈傷組織的形成生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素適中有利于根芽的分化低有利于芽的形成生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，用mg／L表示濃度。在組培中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用濃度因植物的種類(lèi)、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.05-5mg／L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg／L。四、培養(yǎng)材料的支持物1、瓊脂(agar)固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。是由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身不提供任何營(yíng)養(yǎng)。能溶解在熱水中成為溶膠，冷卻至40~°C即為固體狀凝膠。通常所說(shuō)“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。用量在6—10g／L之間，濃度太高培養(yǎng)基會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中；若濃度過(guò)低凝固性不好。新買(mǎi)瓊脂先試凝固力。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等。但也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物組織或細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題時(shí)，則應(yīng)避免使用瓊脂?？稍谝后w培養(yǎng)基表面安放一個(gè)無(wú)菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。2、其他有玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料沒(méi)有影響或影響較小。五、抗生物質(zhì)(antibiotic)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5—20mg/L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類(lèi)污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？旆背Ｒ蛭廴径鴣G棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時(shí)間。尤其對(duì)大量通氣長(zhǎng)期培養(yǎng)，效果更好。對(duì)于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但抗生素對(duì)植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用，可能某些植物適宜用青霉素，而另一些卻不大適應(yīng)。值得提醒的是，在工作中不能以為有了抗菌素，而放松滅菌措施。在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，可能是受抑制的菌類(lèi)又滋生起來(lái)。六、活性炭(activecarbon)為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，顆粒大小決定吸附能力，粒度越小吸附能力越大；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱。使用濃度為0.5—l0g／L。可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5—羥甲基糖醛及激素等?；钚蕴康膽?yīng)用：1、莖尖初代培養(yǎng)：加入適量活性炭，可吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)，一般為0.1%—0.2%，不能超過(guò)0.2%。2、對(duì)生根有明顯促進(jìn)：與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長(zhǎng)的IAA，但I(xiàn)AA易受可見(jiàn)光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用在于通過(guò)減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)根的生長(zhǎng)，根的生長(zhǎng)加快，吸收能力增強(qiáng)，反之又促進(jìn)莖葉的生長(zhǎng)。3、降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率：加入0.3%活性炭，對(duì)防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。4、胚胎培養(yǎng)：如在葡萄胚珠培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。5、活性炭的副作用：每毫克活性炭能吸附l00ng左右的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，說(shuō)明極少量活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量活性炭會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。隨意抓一撮活性炭放人培養(yǎng)基，會(huì)帶來(lái)不良后果。因此，在使用時(shí)要有其量的意識(shí)，使活性炭發(fā)揮其積極作用。

4第三節(jié)培養(yǎng)基的制備

一、母液(stocks01ution)的配制和保存

通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，不但可保證各成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取，還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類(lèi)等。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解會(huì)產(chǎn)生沉淀，要充分溶解再放入母液中。配制時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。先充分溶解依次混合。配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，維生素、氨基酸類(lèi)可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。以MS培養(yǎng)基制備為例，概述其制備方法見(jiàn)表3-2。

表3-2：MS培養(yǎng)基母液的配制

名稱(chēng)規(guī)定量／mgxN稱(chēng)取量／mg母液體積／mL配制1L應(yīng)取量／mL母液名稱(chēng)

NH4N0316501016500

KN0319001019000大量

CaCl2·2H2O4401044001000100元素

MgS04·7H20370103700母液

KH2P04170101700

MnS04·H2022．31002230

ZnS04·7H208．6100860

CoCI·6H2O0．0251002．5微量

CuS04·5H200．0251002．5100010元素

H3B036．2100620母液

Na2M04·2H200．2510025

K10．8310083

FeS04·7H2028．71002870100010鐵鹽

Na-EDTA37．31003730母液

煙酸(Vpp)0．55025

鹽酸吡哆醇(VB6)0．55025有機(jī)

鹽酸硫胺素(VB2)0．15050010物

肌醇10050500母液

甘氨酸2501、大量元素母液可配成濃度10倍母液。用分析天平按表3-2稱(chēng)取藥品，分別加100ml左右蒸餾水溶解后，再用磁力攪拌器攪拌，促進(jìn)溶解。注意Ca2+和陽(yáng)Po43-易發(fā)生沉淀。然后倒人1000ml定容瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。

2、微量元素母液可配成濃度配成比100倍的母液。用分析天平按表準(zhǔn)確稱(chēng)取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000ml。

3、鐵鹽母液可配成100倍的母液，按表稱(chēng)取加熱溶解，混合后加水定容至1000ml。

4、有機(jī)物母液可配成500倍的母液。按表稱(chēng)取藥溶解，混合后加水定容至500ml。

5、激素母液的配制每種激素必須單獨(dú)配成母液，濃度一般配成1mg／ml。用時(shí)根據(jù)需要取用。因激素用量較少，一次可配成50ml或100ml。多數(shù)激素難溶于水，要先溶于可溶物質(zhì)，才能加水定容。配法如下：

將IAA、IBA、GA等先溶于少量的95％的酒精中。再加水定容-定濃度。

NAA可先溶于熱水或少量95％的酒精中，再加水定容到一定濃度。

2，4-D可用少量1molNaOH溶解后，再加水定容到一定濃度。

將Kt和BA先溶于少量1mol的HCI中再加水定容。

將玉米素先溶于少量95％的酒精中，再加熱水到一定濃度。

母液分別貼上標(biāo)簽，注明母液名稱(chēng)、配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。

二、培養(yǎng)基的配制

按表用量筒移取大量元素母液100ml，用對(duì)應(yīng)液管吸取微量元素10ml、鐵鹽母液10ml、有機(jī)物母液10ml，均置人1000ml定容瓶中，不加任何激素則為MSo培養(yǎng)基。

裝母液的定容瓶用蒸餾水定容到1000ml，取1／3左右倒人小鋁鍋中加熱。稱(chēng)好30g蔗糖，稱(chēng)瓊脂7g，也傾人小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。旺火煮開(kāi)再用文火加熱，至瓊脂全部融化即清澈見(jiàn)底為度。再傾人定容瓶余下的液體培養(yǎng)基，搖晃均勻即可。調(diào)整pH值。用0．1M的NaOH或HCl液調(diào)成5．8pH值左右。培養(yǎng)基配方不大變動(dòng)時(shí)可用經(jīng)驗(yàn)法。連續(xù)三次測(cè)定加入的酸、堿液的平均值作以后調(diào)整的用量值。調(diào)后注意搖動(dòng)均勻，酸或堿液不要放置時(shí)間太久。

三、培養(yǎng)基的分裝與滅菌

要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30-40ml培養(yǎng)基，即1L培養(yǎng)基約裝35瓶左右。太多則浪費(fèi)，太少不易接種和影響生長(zhǎng)。要根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象來(lái)決定。如培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基，生根等短期培養(yǎng)時(shí)，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時(shí)不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后污染。用封口材料包上瓶口，扎口后寫(xiě)上培養(yǎng)基種類(lèi)，準(zhǔn)備滅菌。不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免產(chǎn)生污染。

培養(yǎng)基用高壓滅菌。打開(kāi)鍋蓋加水至水位線。裝好培養(yǎng)基的三角瓶及接種用具等放人鍋筒內(nèi)，不要過(guò)分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流出。蓋上鍋蓋，對(duì)角旋緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至0．05MPa時(shí)，打開(kāi)放氣閥放氣回"0'，關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到0．10MPa時(shí)，保壓滅菌20min，到時(shí)停止加熱。當(dāng)氣壓回"0"后打開(kāi)鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺(tái)上冷凝。滅好的培養(yǎng)基不要放置時(shí)間太長(zhǎng)，最多不能超過(guò)1周。第四節(jié)培養(yǎng)基的選擇在建立新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，先由廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如MS或B5)開(kāi)始。通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到能滿足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。

一、單因子試驗(yàn)

在單因子試驗(yàn)中，由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這寧因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如MS基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。

生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對(duì)照組也可能有一組以上。試驗(yàn)中要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料的不一致導(dǎo)致的。

試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有4-10瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。

二、多因子試驗(yàn)

對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱(chēng)多因子實(shí)驗(yàn)，可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案。完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6-BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0．5，2．5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度所有組合，就構(gòu)成了具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn)見(jiàn)表3-3。

表3-3兩種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合

6-BA（μmol/l）00.52.5510

NAA（μmol/l）0123450.56789102.51112131415

51617181920

102122232425

完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為減少試驗(yàn)處理，又能準(zhǔn)確全面獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。如采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排4個(gè)因子，3種水平的試驗(yàn)，一共做9種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無(wú)誤地表現(xiàn)出來(lái)。因此，一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問(wèn)題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、糖和其他成分的用量。

三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法

在組織分化與再生的研究中，在沒(méi)有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，在取得了穩(wěn)定的再生后，就可逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡(jiǎn)化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。

四、廣譜實(shí)驗(yàn)法

在廣譜實(shí)驗(yàn)法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類(lèi)：無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素。對(duì)每一類(lèi)物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃度。4類(lèi)物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示。如一含中濃度無(wú)機(jī)鹽、低濃度生長(zhǎng)素、中濃度細(xì)胞分裂素和高濃度有機(jī)物的處理即可表示為MLMH。達(dá)到這個(gè)階段，再試用不同類(lèi)型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素即可找到培養(yǎng)基的最佳配方。這是因?yàn)椴煌?lèi)型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)不同植物的活性有所不同。本章小結(jié)

1、常用培養(yǎng)基有：①M(fèi)S培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高；②B5培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是含有較低的銨；③White培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽低，適于生根；④N6培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是KN03和(NH4)：SO：含量較高，適于花藥培養(yǎng)；⑤KM-8P培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較多，適于原生質(zhì)體培養(yǎng)。

2、水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、天然復(fù)合物、凝固劑是構(gòu)成培養(yǎng)基的五種主要成分。

3、配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素10倍液；微量元素100倍液；鐵鹽100倍液；有機(jī)物500倍液；激素1mg／l倍液。

4、培養(yǎng)基常分裝到160ml的三角瓶，含量一般為每瓶30-40ml；高壓滅菌時(shí)，壓力通常為0．1MPa以上，持續(xù)20min。

5、篩選合適的培養(yǎng)基一般有四種方法，即單因子試驗(yàn)法、多因子試驗(yàn)法、逐步添加和排除法以及廣譜實(shí)驗(yàn)法。第一種方法比較簡(jiǎn)單，第二種方法比較準(zhǔn)確，而后兩種方法則比較復(fù)雜

5第四章操作技術(shù)

第一節(jié)滅菌和接種

一、滅菌(sterilization)有菌的范疇是：凡暴露在空氣中的、接觸自然水源的物體，至少表面都是有菌的。無(wú)菌室等未處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、使用的刀、剪在未處理之前、身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。菌包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類(lèi)及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。

無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體(當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。從以上可以看出：在地球表面無(wú)菌世界要比有菌世界小得多。

滅菌指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。而消毒指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。經(jīng)過(guò)消毒許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，由于在消毒后的環(huán)境和物品上還有活的微生物。通過(guò)嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無(wú)菌操作。

無(wú)菌條件的要求甚至超過(guò)微生物的培養(yǎng)要求，因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(zhǎng)。

常用的滅菌方法分物理和化學(xué)的兩類(lèi)：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。方法和藥劑要根據(jù)工作中的不伺材料不同目的適當(dāng)選用。

1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌

培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后待壓力上升到0．05MPa時(shí)，打開(kāi)放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0．1MPa時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，維持壓力0，1~0．15MPa，20min。按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同見(jiàn)表4-1。該表所列數(shù)字是徹底滅菌很保險(xiǎn)的數(shù)字，如果容器體積較大，但是放置的數(shù)量很少，也可以減少時(shí)間。

表4-1培養(yǎng)基高壓蒸氣滅菌所必需的最少時(shí)間容器的體積／mL在121℃滅菌所需最少時(shí)間／min

20-5015

75-15020

250-50025

到達(dá)保壓時(shí)間后切斷電源，在壓力降到0．5MPa，緩慢放出蒸氣，注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。壓力降到零后才能開(kāi)蓋，取出培養(yǎng)基，擺在平臺(tái)上以待冷凝。不可久不放氣，引起培養(yǎng)基成分變化。由于鍋爐內(nèi)有負(fù)壓，蓋子打不開(kāi)，只要將放氣閥打開(kāi)，內(nèi)外壓力平衡，蓋子便易開(kāi)了。

對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無(wú)菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長(zhǎng)時(shí)間。布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好滅菌20-30min。

高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0．2-0．3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0．5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8％-20％蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0．43倍。

培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15％-25％的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5．5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0．1％活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1％活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5％。

為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上述一些變化可用下列方法：

(1)、經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，以便及時(shí)采取有效措施。

(2)、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類(lèi)似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0．1％以下)。注意pH值對(duì)高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。

(3)、配制培養(yǎng)基應(yīng)注意成分適當(dāng)分組與加入的順序。如磷、鈣和鐵放在最后加入。

(4)、注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5．80升高至6．48。而96h后又回降至5．8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。

2．用于無(wú)菌操作的器械采用灼燒滅菌

在無(wú)菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95％的酒精中，使用前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后立即使用?？刹捎?50或500ml的廣口瓶，放人95％的酒精，以便插入工具。

3．玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌

干熱滅菌是利用烘箱加熱到160~180°C來(lái)殺死微生物。在干熱條件下細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽孢，通常采用170°C持續(xù)90min來(lái)滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過(guò)多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開(kāi)烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。

4．不耐熱的物質(zhì)采用過(guò)濾滅菌

一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，通常采用過(guò)濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0．45um以下，當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后，細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子因大于濾膜直徑而被阻，需要滅菌的液體量大時(shí)常使用抽濾裝置；液量小時(shí)可用注射器。使用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過(guò)濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無(wú)菌溶液。

5．空間采用紫外線和熏蒸滅菌

(1)、紫外線滅菌在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長(zhǎng)為200-300nm，其中以260nm．的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌；而且要求距照射物以不超過(guò)1．2m為宜。

(2)、熏蒸滅菌用加熱焚燒氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。

化學(xué)消毒劑種類(lèi)很多，使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。溫度越高作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。

常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按5-8m1／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g／m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。

6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌

物體表面可用藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70％的酒精涂擦滅菌，1％-2％的來(lái)蘇兒溶液以及0．25％-1％的新潔爾滅也可以。

7．植物材料表面用消毒劑滅菌

從外界或室內(nèi)選取的植物材料都帶有各種微生物。便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理再接到培養(yǎng)基上，叫接種。接種材料叫外植體(explant)。

首先，將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，視材料清潔程度。易漂浮或細(xì)小的材料裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。

洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，用自來(lái)水沖凈洗衣粉水?？沙ポp度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)便于滅菌液的直接接觸。最理想的清洗物質(zhì)是-吐溫。

第二步，對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、無(wú)菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70％酒精穿透力強(qiáng)，很易殺傷植物細(xì)胞，浸潤(rùn)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。一些特殊材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70％酒精處理稍長(zhǎng)時(shí)間。處理的材料在無(wú)菌條件下待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。

第三步，用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類(lèi)可根據(jù)情況選取1-2種使用見(jiàn)表4-2。

表4-2常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑使用濃度持續(xù)時(shí)間／min去除的難易效果

次氯酸鈣9％，10％5-30易很好

次氯酸鈉2％5-30易很好

氯化汞0．1％，1％5-8較難最好

抗菌素4"50me／L30-60中較好滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來(lái)殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來(lái)達(dá)到滅菌的；過(guò)氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來(lái)殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無(wú)菌水涮洗3-4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對(duì)升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無(wú)菌水涮洗8-10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。

滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1-2min，開(kāi)始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無(wú)菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開(kāi)始，至倒人無(wú)菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒(méi)材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。

在滅菌溶液中加吐溫-80或TritonX效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的0．5％，即在100ml加入15滴。

最后一步是用無(wú)菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類(lèi)，涮洗3-10次左右。無(wú)菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。

二、無(wú)菌操作

接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過(guò)程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1％-3％的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70％的酒精或3％的來(lái)蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來(lái)。無(wú)菌操作可按以下步驟進(jìn)行：

(1)、在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開(kāi)其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；

(2)、在接種前20rain，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；

(3)、接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服，并換穿托鞋等；

(4)、上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺(tái)面；·

(5)、用酒精棉球擦拭接種工具，將鑷子和剪子過(guò)火一遍，然后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；

(6)、接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；

(7)、清理工作臺(tái)，紫外燈滅菌30rain。連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。

三、接種

將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放人培養(yǎng)基的過(guò)程。以上已敘述接種前的材料表面的消毒滅菌，現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。

(1)、將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無(wú)菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過(guò)菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。

(2)、材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0．5cm見(jiàn)方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片幼葉的莖尖大小等。在接種過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。

(3)、用灼燒消毒過(guò)的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過(guò)程是：先解開(kāi)包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送人試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1-3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無(wú)統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過(guò)統(tǒng)計(jì)認(rèn)為：對(duì)外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和大力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄。接完種后，將管口在火焰上再灼