目錄TOC\o"1-3"\h\u1引言 基于GC-MS和網絡藥理學探究香砂養(yǎng)胃丸芳香藥效物質基礎摘要本研究采用GC-MS技術檢測香砂養(yǎng)胃丸中揮發(fā)油的化學成分，并進行結構鑒定，篩選活性小分子；同時，利用TCMSP平臺篩選香砂養(yǎng)胃丸各單味藥材的生物活性成分，通過SwissTargetPrediction平臺預測香砂養(yǎng)胃丸生物活性成分及活性小分子的生物活性靶點；運用GeneCards和DisGenet數據庫，檢測胃炎相關靶點，并通過Venny2.1.0平臺分別獲取生物活性成分及活性小分子與疾病的共同靶標；基于STRING數據庫構建蛋白質互作調控網絡，篩選關鍵靶點，采用GO和KEGG富集分析方法預測其基因功能和作用機制；采用分子對接技術預測藥物活性。研究結果顯示，香砂養(yǎng)胃丸共鑒別出46個揮發(fā)性組分，檸檬烯、樟腦、龍腦等8個活性小分子由網絡藥理學預測到12個核心靶點，富集到112條GO功能條目、80條KEGG信號通路；木香、砂仁等14種單味藥材經網絡藥理學篩選出204個有效成分、89個關鍵靶標以及關鍵靶標共涉及923條GO功能條目、165條KEGG信號通路。分析香砂養(yǎng)胃丸可能通過百秋李醇、α-香附酮、柚皮素、山奈酚等活性組分，TNF、TLR4等核心靶點作用來調控細胞增殖及凋亡、炎癥因子、病毒感染等多個生物學過程，協同作用實現對胃炎的有效治療。本研究初步揭示了香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的芳香藥效成分及潛在作用機制，為后續(xù)深入研究提供了重要參考。關鍵詞香砂養(yǎng)胃丸；GC-MS；網絡藥理學；胃炎；分子對接1引言胃炎（gastritis）是我國常見的消化系統(tǒng)疾病之一，其病理特征主要包括上皮細胞損傷、黏膜層炎癥反應和上皮組織再生，發(fā)病原因受到諸多因素的影響，與幽門螺桿菌感染、膽汁反流、自身免疫機制等因素密切相關[1]。目前，尚無治療胃炎的特效方法，西醫(yī)治療主要以根除HP、應用抑酸藥、補充葉酸等治療方法為主，雖然可以達到一定的治療效果，但長期使用易產生耐藥性及不良反應[2]。近年來，應用中醫(yī)藥輔助治療胃炎已成為新趨勢，對緩解患者臨床癥狀、降低炎癥反應、改善免疫功能等方面具有良好的治療效果[3]。其中，香砂養(yǎng)胃丸為胃炎治療的常用中成藥。香砂養(yǎng)胃丸（濃縮丸）由醋香附、砂仁、白術、陳皮、姜厚樸、廣藿香、茯苓、木香等十四種藥材組成。其中醋香附能夠理氣調中，砂仁有化濕行氣的功效，白術和陳皮能夠健脾益氣，姜厚樸可以燥濕消痰，廣藿香能夠和胃止嘔，茯苓有助于促進水液運行以祛濕，木香可以行氣止痛。在臨床上針對因胃陽不足和濕阻氣滯引發(fā)的胃痛進行治療，具有溫中和胃的功效[4]，但其作用機制尚未明確。基于系統(tǒng)生物學理論，網絡藥理學通過構建藥物-疾病-靶點-通路多維度網絡，從整體角度探索藥物與疾病之間的關聯，發(fā)現潛在藥物靶標，闡釋藥物作用機制等[5]。本實驗采用超聲輔助水蒸氣蒸餾方法提取香砂養(yǎng)胃丸濃縮丸揮發(fā)性組分，利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）分析香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油的化學組分，根據文獻篩選活性小分子；運用網絡藥理學預測治療胃炎的活性成分和作用靶點及相關信號通路，分子對接進行驗證，為闡明香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的藥效物質基礎及作用機制提供參考。2實驗部分2.1儀器與試劑表1實驗儀器與試劑儀器型號/規(guī)格廠家氣相色譜-質譜聯用儀GCMS-TQ8050NX日本島津株式會社調溫電熱套DZTW常州恩培儀器制造有限公司機械超聲波清洗器KX-1613T科璽世紀科技有限公司電子天平YP20002B上海力辰邦西儀器科技有限公司正己烷GC河北克拉維爾生物科技有限公司2.2藥材香砂養(yǎng)胃丸為仲景宛西制藥股份有限公司制藥廠生產，產品批號230806，購自廣東高濟邦健藥店。2.3香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油的提取香砂養(yǎng)胃丸研磨，過3號篩，稱取60g粉末（料液比1:10）分三次進行超聲提取，設置超聲提取時間為30min，使用機械超聲波清洗器進行超聲提取時，在超聲波清洗器里加入冰塊，防止超聲提取過程中水溫升高對香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性組分產生影響。超聲提取完成后，將所有藥物溶液轉移至1000ml圓底燒瓶內?；亓魈崛?，保持微沸狀態(tài)共計8h，待裝置冷卻后，收集香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油，靜置分層，分離水分，得淡黃色透明油狀液體，置于冰箱冷藏保存，待下一步GC-MS分析檢測使用。2.4GC-MS分析2.4.1色譜條件載氣選用高純度氦氣；進樣量1μL，分流比50:1；對樣品進行程序升溫分析，開始時柱溫設定為50℃，維持此溫度3min，以2℃/min的速度升溫至100℃，保持10min，繼續(xù)以2℃/min的速度升溫至140℃，保持5min，最終以5℃/min的速度升溫至270℃，維持此溫度15min，后進樣口溫度270℃。2.4.2質譜條件離子源EI，離子源溫度230℃，溶劑延遲時間：3.5min，掃描范圍：45-500m/z。2.5香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油化學組分的鑒定取“2.3”項下香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油樣品經正己烷稀釋進樣，進樣量1μL，獲得樣品總離子流圖。3方法3.1香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性組分篩取和作用靶點預測對“2.5”項篩選所得的活性小分子的CAS號在PubChem（有機物生物活性數據庫，https:///）平臺中獲得效應成分的SMILES號，然后利用SMILES號通過小分子藥物靶點在線預測平臺（SwissTargetPrediction，www.swisstargetprediction.ch）進行預測，獲取活性小分子的靶點以及基因信息，最后進行整合篩除重復項。3.2香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的相關靶點搜集以“胃炎（gastritis）”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（人類基因數據儲存庫，）和DisGenet數據庫（疾病基因網絡數據儲存庫，）中檢索獲取胃炎相關作用靶點信息。將從2個數據庫獲取的信息去除重復靶點基因，得到較完備的胃炎靶點信息。 3.3蛋白質相互作用PPI網絡圖構建將“3.1”項所預測的作用靶點和“3.2”項所得的胃炎的相關靶點通過Venny2.1.0平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制出復方制劑與疾病的共有基因，獲得香砂養(yǎng)胃丸對胃炎發(fā)揮作用的潛在靶點。將所得交集基因導入STRING（/）數據庫中，限定物種設置為人，置信度設置為0.4，獲得以靶點為節(jié)點，以線表示靶標間交互作用的蛋白互作網絡圖。在Cytoscape3.6.0軟件中導入PPI網絡圖的tsv文件格式，利用網絡拓撲分析設定篩選條件為度值（Degree）高于平均值，且介數中心性（Betweenness）和接近中心性（Closeness）均高于中位值的靶點，獲得關鍵靶標。3.4核心靶點蛋白富集分析復制關鍵靶標粘貼至David數據庫(https:///)進行生物信息學分析，包括基因本體（GO）的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（DC）以及KEGG通路的富集情況。P值越小結果顯著性越高，GO和KEGG分別選取前10和前20條條目進行可視化處理。將富集分析的結果導入微生信網站（https://），調整參數，生成富集氣泡圖，從而將香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的潛在生物過程及信號通路可視化。3.5“活性小分子-靶點-通路”網絡構建在Cytoscape3.6.0軟件中導入香砂養(yǎng)胃丸的有效成分、治療胃炎關鍵靶點以及通路數據，構建“活性小分子-靶點-通路”可視化網絡圖，該網絡圖以成分、靶點和通路為節(jié)點，相互間的作用為邊，節(jié)點大小反映度值（Degree值）大小，聯系度越高節(jié)點越大。3.6分子對接根據網絡的拓撲分析選取活性成分中度值較大的主要成分依次與核心治療靶點進行對接，從PubChem數據庫下載有效成分3d結構保存為sdf文件，通過OpenBable工具轉換為mol2格式；利用PDB蛋白數據庫檢索并獲取目標蛋白結構，經Pymol軟件移除結構中的水分子和配體；運用AutoDockTools-1.5.7軟件對蛋白結構進行加氫處理，分子對接并記錄結合能大小。最后分子對接結果由Pymol軟件進行可視化處理。3.7香砂養(yǎng)胃丸單味藥材“藥物-活性成分-靶點-通路”網絡構建及分子對接在中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http:///index.php）中，分別輸入香砂養(yǎng)胃丸各單味藥材，以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18[6]為篩選標準，得到各單味藥材的活性成分信息，按照“3.1-3.6”項中的步驟和方法，對活性成分進行靶點預測、PPI網絡圖構建、分子對接等。4結果4.1香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油化學成分檢測結果由2.4.1和2.4.2，得香砂養(yǎng)胃丸總離子流圖，見圖1。時間/minIntensity時間/minIntensity圖1香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性組分總離子流圖由總離子流圖，香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性成分中分離出111種化合物，鑒定出46種化合物。鑒定出的化合物信息見表2。表2香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性組分分析峰號化合物名稱分子式1檸檬烯C10H162γ-松油烯C10H163芳樟醇C10H18O4樟腦C10H16O5龍腦C10H18O6(-)-4-萜品醇C10H18O7α-松油醇C10H18O8乙酸龍腦酯C12H20O29α-乙酸松油酯C12H20O210蒎烯C15H2411β-廣藿香烯C15H24121-乙烯基-1-甲基-2,4-雙(1-甲基乙烯基)-,[1S-(1α,2β,4β)]-環(huán)己烷C15H24131,2,4a,5,8,8a-六氫-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-，(1α,4aβ,8aα)-(+/-.)-萘C15H2414β-石竹烯C15H24續(xù)表2峰號化合物名稱分子式151,7-二甲基-7-(4-甲基-3-戊烯基)-,(-)三環(huán)[(2,6)]庚烷-C15H2416α-愈創(chuàng)木烯C15H2417西車烯C15H24181,4,7,-環(huán)三烯,1,5,9,9-四甲基-,Z,Z,Z-C15H2419薁,1,2,3a,4,5,6,7-八氫-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-,[1R-(1α,3aβ,4α,7β)]-C15H2420(E)-β-金合歡烯C15H24212-異丙烯基-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氫萘C15H2422γ-依蘭油烯C15H24231-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-基)環(huán)己-1,3-二烯C15H2424(+)-喇叭烯C15H2425萘,1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-4a,8-二甲基-2-(1-甲基乙烯基)-,[2R-(2α,4aα，8aβ)]-C15H2426薁,1,2,3,5,6,7,8,8a-八氫-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-,[1S-(1α,7α,8aβ)]-C15H2427Δ-杜松烯C15H24283-(1,5-二甲基-4-己烯基)-6-亞甲基,[S-(R*,S*)]-環(huán)己烯C15H2429環(huán)己烷甲醇,4-乙烯基-α,α,4-三甲基-3-(1-甲基乙烯基)-,[1R-(1α,3α,4β)]-C15H26O303,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇乙酸酯C17H28O231桉油烯醇C15H24O32石竹素C15H24O33正十七烷C17H3634桉葉油醇C15H26O35NeointermedeolC15H26O361,8,11,14-十七碳四烯,(Z,Z,Z)-C17H28377-異丙烯基-1,4a-二甲基-4,4a,5,6,7,8-六氫-3H-萘-2-酮C15H22O382-((2R,4aR)-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氫-萘-2-基)丙-2-烯-1-醇C15H24O39龍涎酮C16H26O40Z-α反式香檸檬醇C15H24O41棕櫚酸甲酯C17H34O242間樟腦烯C20H32續(xù)表2峰號化合物名稱分子式43鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O444十六烷酸乙酯C18H36O2459,12-十八碳二烯酸丁酯C22H40O246正四十烷C40H824.2活性小分子及靶點預測以Q-marker五原則為出發(fā)點[7]，選取檸檬烯、樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯等共8個活性小分子作為香砂養(yǎng)胃丸的質量標志物,其基本信息見表3。將8個活性小分子通過SwissTargetPrediction數據庫預測共得113個靶點蛋白；利用GeneCards、DisGenet數據庫查詢胃炎的相關靶點信息，整合去重，獲得1638個疾病靶點。表3活性小分子基本信息活性小分子結構式分子式CAS號檸檬烯C10H16138-86-3桉油精C10H18O470-82-6樟腦C10H16O76-22-2續(xù)表3活性小分子結構式分子式CAS號龍腦C10H18O6627-72-1乙酸龍腦酯C12H20O276-49-3百秋李醇C15H26O5986-55-0廣藿香酮C12H16O423800-56-8α-香附酮C15H22O473-08-54.3潛在靶點預測利用Venny2.1平臺，將8個活性小分子預測得到的113個靶點蛋白與胃炎疾病靶點取交集，獲得細胞色素P450同工酶CYP17A1、雄激素受體（AR）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（MAPK3）等潛在靶點共34個，占兩者之和的2%（見圖2）。圖2活性小分子與胃炎交集基因4.4PPI網絡構建基于String數據庫構建PPI網絡（如圖3），共有34個節(jié)點，112條邊；經Cytoscape3.6.0繪制得香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎潛在靶點蛋白互作網絡圖（見圖4）。經CytoNCA軟件分析，篩選出DC值大于平均值13，BC值和CC分別大于其中位值7和0.5的靶點，獲得核心靶點蛋白12個（如圖5），其中AKT1、EGFR、TLR4、MAPK3的度值較大。圖3活性小分子治療胃炎的潛在作用靶點的蛋白-蛋白相互作用圖4活性小分子治療胃炎潛在靶點蛋白互作網絡圖圖5核心靶點可視化網絡圖4.5核心靶點GO、KEGG富集分析經過GO分析，12個核心靶點共富集到75個BP、15個CC、22個MF，按P值大小從小到大排列（P<0.05）選取前10的條目。條目提示，BP主要富集在細胞對表皮生長因子刺激的反應、炎癥反應等；CC主要涉及細胞質、大分子復合物等；酶結合、氧化還原酶活性等是重要分子功能（如圖6）。經KEGG信號通路富集分析獲得80條生物信號通路，對P值較小的前20條通路進行分析，主要包括在癌癥中程序性死亡蛋白-L1（PD-L1）的表達和PD-1通路、HIF-1信號通路等（如圖7）。圖6BP、CC、MF三合一柱狀圖圖7KEGG富集氣泡圖4.6構建“活性小分子-核心靶點-通路”網絡利用Cytoscape3.6.0軟件構建“活性小分子-核心靶點-通路”網絡圖，共有40個節(jié)點，264條邊。以三角形活性小分子，圓形表示核心靶點，方形表示通路（如圖8）。由圖8可知，在12個核心靶點中MAPK3、AKT1、EGFR、ERBB2等靶點的連接度高于其它靶點；癌癥發(fā)病途徑、癌癥中蛋白聚糖等信號通路連接度較高。圖8活性小分子-核心靶點-通路網絡圖4.7分子對接將8個活性小分子分別與圖5中度值較大的關鍵靶點AKT1、TLR4、MAPK3、EGFR進行分子對接，對接詳細結果見表4，以熱圖形式更直觀展示（見圖9），活性小分子與核心靶點均能自發(fā)結合。其中檸檬烯、樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯均與TLR4結合能最低，桉油精、百秋李醇、廣藿香酮均與AKT1結合能最低，α-香附酮與MAPK3結合能最低。利用Pymol軟件對表4對接結果進行可視化展示（如圖10-11）。表4活性小分子分子對接結果活性小分子結合能/(kcal·mol-1)AKT1TLR4MAPK3EGFR檸檬烯-5.3-5.5-5.4-4.9桉油精-5.4-5.0-5.2-4.6樟腦-5.5-5.8-4.7-5.2龍腦-5.5-5.7-4.8-5.1乙酸龍腦酯-5.4-5.8-5.7-4.9百秋李醇-6.7-5.8-5.3-6.6廣藿香酮-5.3-4.9-5.0-5.2續(xù)表4活性小分子結合能/(kcal·mol-1)AKT1TLR4MAPK3EGFRα-香附酮-4.9-5.5-5.7-5.4圖9活性小分子分子對接結果熱力圖14321432865786571211109P1211109P16151413161514132019181720191817242322212423222127282625272826253231302932313029圖10分子對接可視化模型圖214321437685768511121091112109161514131615141317182019171820192423222124232221282726252827262532313029323130291.AKT1與檸檬烯2.AKT1與桉油精3.AKT1與樟腦4.AKT1與龍腦5.AKT1與乙酸龍腦酯6.AKT1與百秋李醇7.AKT1與廣藿香酮8.AKT1與α-香附酮9.TLR4與檸檬烯10.TLR4與桉油精11.TLR4與樟腦12.TLR4與龍腦13.TLR4與乙酸龍腦酯14.TLR4與百秋李醇15.TLR4與廣藿香酮16.TLR4與α-香附酮17.MAPK3與檸檬烯18.MAPK3與桉油精19.MAPK3與樟腦20.MAPK3與龍腦21.MAPK3與乙酸龍腦酯22.MAPK3與百秋李醇23.MAPK3與廣藿香酮24.MAPK3與α-香附酮25.EGFR與檸檬烯26.EGFR與桉油精27.EGFR與樟腦28.EGFR與龍腦29.EGFR與乙酸龍腦酯30.EGFR與百秋李醇31.EGFR與廣藿香酮32.EGFR與α-香附酮圖11分子對接口袋模型圖4.8基于“藥物-成分-靶點-通路”的拓撲分析在TCMSP數據庫中，以OB不小于30%、DL不小于0.18為篩選標準，搜集并整理得香附、砂仁、木香、陳皮、廣藿香、姜厚樸、生姜、枳實、白術、茯苓、半夏、豆蔻、甘草、大棗活性成分分別為18種、10種、6種、5種、11種、2種、5種、22種、7種、15種、13種、12種、92種、29種。去除沒有靶點映射的成分后，香附、砂仁、木香、陳皮、廣藿香、姜厚樸、生姜、枳實、白術、茯苓、半夏、豆蔻、甘草、大棗活性成分各剩15種、10種、6種、5種、11種、2種、5種、20種、7種、14種、13種、11種、90種、24種。通過SwissTargetPrediction數據庫預測共得1230個成分靶點。利用Venny2.1平臺，將香砂養(yǎng)胃丸預測得到的1230個成分靶點與胃炎疾病靶點取交集，獲得細胞色素P450的同工酶（CYP17A1、CYP51A1）、雄激素受體（AR）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）等潛在靶點共269個，在兩者之和中占10.4%（見圖12）。經String數據庫構建蛋白質互作網絡（如圖13），獲得267個節(jié)點，5688條邊；經Cytoscape3.6.0繪制得香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎潛在靶點蛋白互作網絡圖（如圖14，圖中度值越大，節(jié)點越大，顏色越深）。使用CytoNCA軟件進行分析，篩選DC值大于平均值85，同時BC值和CC分別大于其中位值72和0.5的靶點，獲得核心靶點蛋白89個（如圖15）。其中TNF、AKT1、TP53、IL6、IL1B、STAT3、SRC、JUN、BCL2、EGFR的度值較大，預示著在香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的過程中起著關鍵作用。經GO分析，89個核心靶點共富集到742個BP、76個CC、105個MF，按P值大小從小到大排列（P<0.05）選取前20的條目。結果顯示，生物過程主要富集在細胞凋亡過程的正負調控、對外源性刺激的反應、細胞對脂多糖的反應等；細胞組分主要包含大分子聚合物、細胞質、細胞核、線粒體等；酶聯、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、同種蛋白質聯結、蛋白激酶活性等是關鍵分子功能（如圖16）。經KEGG富集分析獲得165條信號通路，分析P值較小的前30條生物信息通路，主要涉及癌癥的發(fā)病途徑、脂質與動脈粥樣硬化、乙型肝炎病毒、C型凝集素受體信號傳導途徑、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染等（如圖17）。綜上，可以猜測香砂養(yǎng)胃丸可能作用于以上多種基因本體以及信號通路發(fā)揮對胃炎的治療作用。通過Cytoscape3.6.0版本軟件，構建香砂養(yǎng)胃丸“藥物-成分-靶點-通路”可視化網絡圖（見圖18），共有337個節(jié)點，3182條邊。藥物以三角形表示，成分以六邊形表示，核心靶點以圓形表示，通路以方形表示。各節(jié)點大小代表其連接度，即表示成分與核心靶點及通路之間的關聯數量，連接度越高，則節(jié)點越大顏色越深，表明該成分越重要。由圖18，在204個活性成分中，槲皮素、木犀草素、柚皮素、山奈酚、異鼠李素、熊竹素、橙皮素、白樺脂酸等8個活性化合物具有較高的連接度；在89個核心靶點中EGFR、GSK3B、AR、SRC、MMP9、PPARG、MMP2、PTGS2等靶點的連接度高于其它靶點；癌癥發(fā)病途徑、脂質與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路連接度較高。預示著香砂養(yǎng)胃丸通過多成分、多靶點、多途徑協同作用發(fā)揮治療胃炎的作用。選取圖18中度值較大的活性成分槲皮素、木犀草素、柚皮素、山奈酚分別與圖15中度值較大的核心靶點TNF、AKT1、TP53、IL6、IL1B、NFKB1進行分子對接，對接結果如表5所示，結果熱圖見圖19，配體與受體的結合能均小于0，說明主要活性成分與關鍵靶點結合是自發(fā)的過程。其中木犀草素與IL1B對接結合能最低，槲皮素、柚皮素、山奈酚均與IL6對接結合能最低。經Pymol軟件對表5對接結果進行可視化展示（如圖20-21）。圖12香砂養(yǎng)胃丸活性成分與胃炎交集基因圖13香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的潛在作用靶點的蛋白-蛋白相互作用圖14香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎潛在靶點蛋白互作網絡圖圖15核心靶點可視化網絡圖圖16BP、CC、MF三合一柱狀圖圖17KEGG富集氣泡圖圖18藥物-成分-核心靶點-通路網絡圖表5香砂養(yǎng)胃丸主要活性成分分子對接結果主要活性成分結合能/(kcal·mol-1)TNFAKT1TP53IL6IL1BNFKB1槲皮素-7.4-6.0-6.3-8.2-8.1-6.2木犀草素-7.6-6.1-7.0-8.2-8.4-6.4續(xù)表5主要活性成分結合能/(kcal·mol-1)TNFAKT1TP53IL6IL1BNFKB1柚皮素-8.7-6.0-7.3-8.8-8.5-6.4山奈酚-7.2-6.2-7.1-8.9-7.8-6.4圖19活性小分子分子對接結果熱力圖DCBADCBAFHGEFHGEKLJIKLJIPNOMPNOMTSRQTSRQXUVWXUVW圖20分子對接可視化模型圖CDBACDBAFHGEFHGEKLJIKLJIPONMPONMSTRQSTRQXWUVXWUVA.TNF與槲皮素B.TNF與木犀草素C.TNF與柚皮素D.TNF與山奈酚E.AKT1與槲皮素F.AKT1與木犀草素G.AKT1與柚皮素H.AKT1與山奈酚I.TP53與槲皮素J.TP53與木犀草素K.TP53與柚皮素L.TP53與山奈酚M.IL6與槲皮素N.IL6與木犀草素O.IL6與柚皮素P.IL6與山奈酚Q.IL1B與槲皮素R.IL1B與木犀草素S.IL1B與柚皮素T.IL1B與山奈酚U.NFKB1與槲皮素V.NFKB1與木犀草素W.NFKB1與柚皮素X.NFKB1與山奈酚圖21分子對接口袋模型圖5結論5.1基于“4.1-4.7”項下的分析與討論檸檬烯是陳皮、香附、枳實揮發(fā)油的主要成分[8-9]。砂仁、豆蔻揮發(fā)油中含桉油精、樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯等[10-11]，豆蔻富含桉油精，在抑菌抗炎、抗腫瘤、保護肝臟以及胃黏膜等方面具有顯著藥效[12]；砂仁中乙酸龍腦酯含量較高，主要具有抗炎鎮(zhèn)痛、胃腸保護的功能[13]。百秋李醇和廣藿香酮是廣藿香揮發(fā)油的主要活性成分，具有調節(jié)胃腸道、免疫功能以及抗炎抗腫瘤等藥理作用[14]。香附揮發(fā)油的關鍵藥效組分α-香附酮通過破壞腦內微管纖維的結構而減輕炎癥癥狀，也具有促進胃腸動力的功能[15]。由核心靶點可視化網絡圖可知，活性小分子治療胃炎的核心靶點蛋白包括AKT1、EGFR、TLR4、MAPK3等。EGFR是一種位于人體細胞表面的生長因子受體，對細胞生長、分化和修復過程具有關鍵作用。在正常的生理條件下，細胞凋亡是胃粘膜上皮細胞死亡的主要方式，EGFR的正常表達對維持胃粘膜穩(wěn)定性和功能至關重要。一旦EGFR出現過表達，可能會導致細胞生長和分裂失控，從而增加胃粘膜發(fā)生病變的風險。有研究檢測了胃癌組織、萎縮性胃炎組織及正常胃粘膜組織中EGFR的表達情況，結果顯示在胃癌組織中EGFR表達顯著，而在正常胃粘膜和萎縮性胃炎組織中均為陰性表達，提示EGFR參與胃癌的發(fā)展過程，并且晚期胃癌中的EGFR表達水平比早期胃癌更高[16]。文獻報道，EGFR與胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯系，通過抑制EGFR過度表達能促進胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞侵襲能力與轉移,EGFR介導的RAS/RAF/MEK/ERK信號通路所引起的細胞凋亡是抗癌的潛在靶點[17-18]。因此大量研究進一步從胃癌患者上驗證了通過抑制EGFR的過表達來實現治療效果。閔濤等[19]通過聯合使用順鉑HIPEC和靜脈化療，降低EGFR的表達水平，從而有效增強化療藥物對胃癌細胞的抗增殖和分化抑制作用，誘導癌細胞加速凋亡，同時阻斷新生血管的形成。薛珊等[20]采用FOLFIRI方案通過干擾腫瘤因子與受體之間的信號傳導，從而降低EGFR及CEA等關鍵分子的表達水平，及時消滅癌細胞組織，有效控制病情。隨著對胃癌輔助治療研究的不斷深入，以EGFR為靶點的分子靶向治療在臨床實踐中的應用逐漸普及，對延長晚期胃癌患者的總生存期具有顯著效果[21]?；诰W絡藥理學的分析結果，香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的核心靶點之一EGFR與既往研究結果一致。TLR4屬于Toll樣受體（TLR）家族的一員，能夠識別細菌或病毒的分子模型，以產生免疫應答反應[22]。有研究證明[23]，通過抑制TLR4的活化或表達，可以有效減輕胃炎的癥狀，保護胃黏膜進一步損傷。MAPK3在MAPK信號通路中發(fā)揮關鍵作用，其蛋白激酶活性具有抑制胃癌細胞遷移和增殖的能力，還能調控細胞增殖、分化和存活，維護機體的穩(wěn)定性和平衡炎癥反應[24]。經KEGG富集分析得80條信號通路，根據P值大小進行排序，選取前20條為主要信號通路如癌癥中程序性死亡蛋白-L1（PD-L1）的表達和PD-1通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號傳導途徑。研究表明[25]，阻斷PD-L1和PD-1的結合可釋放T細胞，攻擊癌細胞，達到治療的目的。HIF-1信號傳導途徑在調節(jié)炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡以及癌癥等多種生物學過程中發(fā)揮關鍵作用[26]。在AKT1、TLR4、MAPK3、EGFR這4個核心靶點中，TLR4和AKT1與檸檬烯等8個活性小分子的結合能力最強，平均結合能均為5.50kcal·mol-1。5.2基于“4.8”項下的分析與討論經TCMSP數據庫篩選結果可知，香附、廣藿香、豆蔻、甘草、大棗的相同成分是槲皮素，香附、枳實、豆蔻的相同成分是木犀草素，陳皮、枳實、甘草的相同成分是柚皮素，香附、甘草的相同成分是山奈酚。槲皮素、木犀草素、柚皮素、山奈酚等天然黃酮類化合物，在抗炎、抗氧化、抗癌等方面具有顯著生物活性。有研究表明槲皮素通過有效阻斷IRF8/IFN-y信號軸，顯著減輕胃部炎癥反應，促進胃液分泌，對“炎癌轉化”進行干預與防治[27]。胡曉婷等以急性胃粘膜損傷的小鼠為模型，發(fā)現槲皮素能保護胃上皮GES-1細胞，防治其受到氧化損傷并調節(jié)活性氧的產生，從而發(fā)揮保護胃黏膜的功能[28]。文獻報道，木犀草素能有效抑制腫瘤細胞增殖，保護細胞免受致癌因子侵害，并通過多種信號通路轉導觸發(fā)細胞凋亡，在體內外全面抑制癌癥的發(fā)展進程[29]。柚皮素通過發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用影響微生物群的組成和活性，并對腸道屏障功能和胃腸道炎癥產生有益影響，從而改善胃腸道功能[30]。山奈酚主要通過調節(jié)細胞凋亡、MAPK/ERK1/2、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路發(fā)生發(fā)揮抗癌作用，目前被認為是癌癥的替代治療方法[31]。根據核心靶點可視化網絡圖可知，香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的核心靶點蛋白包括TNF、AKT1、TP53、IL6、IL1B、NFKB1等。TNF和IL6是炎癥反應中的關鍵代表性成分，二者能夠抑制胃腺體萎縮、化生及腫瘤轉化，減輕胃癌發(fā)生的風險[32]。IL-6與胃黏膜退化、腸化生和胃部前期癌癥病變密切相關[33]，通過抑制IL-6及其下游信號通路，有效降低胃癌細胞內MMP9與c-MYC的蛋白表達水平，進而抑制胃癌細胞侵襲和增殖過程[34]。AKT1異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，程玉等[35]通過采集胃癌患者腫瘤和癌旁組織樣本，探究AKT1在這兩種組織中的表達差異，經qRT-PCR技術檢測，發(fā)現在正常胃組織中相對表達水平為0.35±0.05，而在胃癌組織中相對表達水平高達0.71±0.16，提示AKT1高表達與胃癌前病變及胃癌的發(fā)生具有顯著相關性，且與胃癌惡性程度、侵襲能力和預后不良有關。TP53是人體內最重要的抑癌基因之一，參與抑制腫瘤生成、調控細胞周期以及促進細胞凋亡的過程。有研究發(fā)現在非典型增生和胃癌的演變過程TP53的陽性表達率呈上升趨勢，提示TP53表達水平的高低對評估胃炎的病變程度及預后具有重要意義[36]。有研究證明[37]，IL1B基因多態(tài)性影響幽門螺桿菌感染后粘膜細胞因子的表達，強烈抑制胃酸分泌，從而增加胃炎和胃癌前病變的危險。在敲除小鼠的胃癌發(fā)展研究中，JunT.Low等[38]發(fā)現NFKB1的缺失會導致胃組織中的細胞因子白細胞介素（IL）6、IL22、IL11和腫瘤壞死因子（TNF）水平升高，從而激活STAT1途徑，觸發(fā)炎癥性免疫反應并促進胃癌發(fā)展。經過GO富集分析發(fā)現，香砂養(yǎng)胃丸核心靶點在生物過程中主要涉及細胞凋亡過程正負調控、對外源性刺激的反應，且大多為大分子復合物，廣泛分布于細胞質及細胞核內，多數具有與酶、蛋白質結合的功能。KEGG富集分析得165條信號通路，根據P值大小進行排序，選取前30位為主要信號通路如癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等。胃炎已被視為胃癌前病變，其具有與胃癌相似的某些生物學特性，香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的靶點富集到癌癥通路，可能同時緩解了胃炎的癥狀并降低了其向胃癌轉化的風險，為癌癥的早期預防和治療提供依據。有研究系統(tǒng)闡述巨噬細胞的炎癥反應、動脈粥樣硬化斑塊與癌癥三者的相互作用[39]，因此香砂養(yǎng)胃丸可以通過調節(jié)人巨細胞病毒感染通路和脂質與動脈粥樣硬化通路從而調治癌癥及癌前病變的發(fā)生。此外，乙型肝炎感染和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染均源于病毒引起的疾病的過程，可以推斷香砂養(yǎng)胃丸可能通過調節(jié)病毒與免疫系統(tǒng)的相互作用而發(fā)揮治療作用。在TNF、AKT1、TP53、IL6、IL1B、NFKB1這6個核心靶點中，IL6和IL1B與槲皮素等4個主要活性成分的結合能力最突出，其平均結合能分別達到8.5kcal·mol-1和8.2kcal·mol-1。分子對接結果證實香砂養(yǎng)胃丸主要有效成分與關鍵靶點之間的結合性均較好，能通過相互作用發(fā)揮香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的作用。6總結與展望本研究結合網絡藥理學方法，同時采用GC-MS技術對香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油的化學組分進行定性表征，分子對接驗證，初步闡明了香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的芳香藥效物質基礎和潛在作用機制，體現了香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎多成分、多靶點、多通路的治療方式。通過與文獻對比，香砂養(yǎng)胃丸與單味藥材相同的揮發(fā)性組分有所減少，其原因可能有兩個：一是本實驗采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性組分，在提取過程中高溫、發(fā)生化學反應等可能會破壞揮發(fā)性組分，或者因為本次實驗的提取條件并未達到香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)性組分的最佳提取條件；二是香砂養(yǎng)胃丸濃縮丸工藝復雜，木香等7種藥材提取揮發(fā)油成分后再混合入藥，提取與混勻過程中可能造成揮發(fā)性組分變化及含量降低。香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油的化學組分未能與網絡藥理學的篩選結果相匹配，其原因可能是通過網絡藥理學以OB≥30%、DL≥0.18篩選得到的活性組分包括揮發(fā)性組分和非揮發(fā)性組分，而GC-MS技術定性表征香砂養(yǎng)胃丸揮發(fā)油的化學組分只包括揮發(fā)性組分，由此造成影響。后續(xù)實驗中，將會設計正交試驗探究最佳提取條件，進一步采用HPLC技術提取非揮發(fā)性組分，以便更好地研究香砂養(yǎng)胃丸治療胃炎的藥效物質基礎和潛在作用機制。參考文獻張琳,張云云.血清胃蛋白酶原聯合胃泌素-17檢測對早期胃癌的診斷價值[J].川北醫(yī)學院學報,2020,35(6):1055-1058.LeiJ,RenF,LiWY,etal.Useoffolicacidsupplementationtohaltandevenreversetheprogressionofgastricprecancerousconditions:AMeta-analysis[J].BMCGastroenterol,2022,22(1):370.潘傳武,香砂養(yǎng)胃丸治療慢性萎縮性胃炎患者的效果分析[J].中國社區(qū)醫(yī)師,2022(35):63-65.中華人民共和國藥典,2020年版一部;1297-1298.宋闊魁,畢天,展曉日,等.網絡藥理學指導下的中藥有效成分發(fā)現策略[J].世界科學技術:中醫(yī)藥現代化,2014(1):27-31.XUX,ZHANGW,HUANGC,etal.Anovelchemometricmethodforthepredictionofhumanoralbioavailability[J].IntJMolSci,2012,13(6):6964-6982.LIUCX,CHENSL,XIAOXH,etal.AnewconceptonqualitymarkerofChinesemateriamedica:qualitycontrolforChinesemedicinalproducts[J].ChinTraditHerbDrugs(中草藥),2016,47(9):1443-1457.許姍姍,許浚,張笑敏,等.常用中藥陳皮、枳實和枳殼的研究進展及質量標志物的預測分析[J].中草藥,2018,49(1):35-44.鄭鵬.氣滯胃痛顆粒劑中揮發(fā)油提取、包合及穩(wěn)定性研究[D].2020.陳樹東,鄧婕,陳智安,等.氣相色譜-質譜聯用法比較分析不同產地砂仁揮發(fā)油成分[J].上海中醫(yī)藥雜志,2022,56(08):96-101.朱纓,談如藍,吳芝園.豆蔻果實揮發(fā)油成分研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2018(05):71-73.侯明櫧,常聰,陳林霖,等.桉油精的藥理作用研究進展[J].中國現代應用藥學,2021,v.38(16):2023-2032.李麗麗,田文倉,劉茵,等.砂仁中化學成分及其藥理作用的研究進展[J].現代生物醫(yī)學進展,2018(22):4390-4396.李楚,荊文光,莫小路,等.廣藿香化學成分和藥理作用研究進展及潛在質量標志物預測分析[J].中國藥學雜志,2023,v.58(11).AzimiA,GhaffariSM,RiaziGH,etal.Α-CyperoneofCyperusrotundusisaneffectivecandidateforreductionofinflammationbydestabilizationofmicrotubulefibersinbrain[J].JEthnopharmacol,2016,194:219-227.趙棲.VDR、EGFR在胃癌中表達及臨床意義分析[D].2022.繆鵬飚,徐倩,賈西云,等.下調EGFR表達對胃癌AGS細胞活力和基因表達譜的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2021(05):608-614.SooroMopaAlina,ZhangNi,ZhangPinghu.TargetingEGFR-mediatedautophagyasapotentialstrategyforcancertherapy[J].Internationaljournalofcancer,2018,(9).閔濤,劉麗華,李鑫月,等.順鉑腹腔熱灌注聯合靜脈化療治療胃癌療效及對血清IGF-1VEGFEGFR水平的影響[J].河北醫(yī)學,2022(03):451-456.薛珊,宋華偉,邢穎.FOLFIRI方案治療胃癌療效及對患者血清IGF-1、VEGF、EGFR及CEA的影響[J].浙江中西醫(yī)結合雜志,2020(12):988-990.ShitaraK,OhtsuA.Advancesinsystemictherapyformetastaticoradvancedgastriccancer[J].JNatlComprCancNetw,2016,14(10):1313-1320.DOI:10.6004/jnccn.2016.0138.王向前.NF-κB和TLR4在慢性萎縮性胃炎中的表達及意義[J].臨床醫(yī)學工程,2017(03):363-364.井貴平,劉曉棠,徐志雄.自擬化濁解毒湯加減治療慢性萎縮性胃炎的療效及血清TLR4、IL-4、TNF-α水平變化觀察[J].四川中醫(yī),2022,40(03):98-101.FengDu,LinaSun,YiChu,etal.DDIT4promotesgastriccancerproliferationandtumorigenesisthroughthep53andMAPKpathways[J].CancerCommunications,2018,(1).MaW,GilliganBM,YuanJ,etal.CurrentstatusandperspectivesintranslationalbiomarkerresearchforPD-1/PD-L1immunecheckpointblockadetherapy[J].JHematolOncol,2016,9(1):47.TALKSKL,TURLEYH,GATTERKC,etal.Theexpressionanddistributionofthehypoxia-induciblefactorsHIF-1αandHIF-2αinnormalhumantissues,cancers,andtumor-associatedmacrophages[J].AmJPathol,2000,157(2):411-421.喻春紅,盧霞泱,李玲玲,等.槲皮素介導IRF8/IFN-γ改善Hp感染誘導慢性萎縮性胃炎的機制研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2022,v.32(20).HuXT,DingC,ZhouN,etal.Quercetinprotectsgastricepithelialcellfromoxidativedamageinvitroandinvivo[J].EurJPharmacol,2015,754:115-124.MuhammadImran,AbdurRauf,TareqAbu-Izneid,etal.Luteolin,aflavonoid,asananticanceragent:Areview[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2019.YalaStevens,EvelienVanRymenant,CharlotteGrootaert,etal.TheIntestinalFateofCitrusFlavanonesandTheirEffectsonGastrointestinalHealth[J].Nutrients,2019,(7).QattanMalakYahia,KhanMohammadIdreesh,AlharbiShudayyedHasham,etal.TherapeuticImportanceofKaempferolintheTreatmentofCancerthroughtheModulationofCellSignallingPathways[J].Molecules,2022,(24).李萍,李園,李可歆,等.基于生物分子網絡探討胃復春片治療慢性萎縮性胃炎的作用機制研究[J].世界中西醫(yī)結合雜志,2020,v.15(01):48-53.黃懋敏,董丹丹,亓丹丹,等.慢性萎縮性胃炎患者Hp感染與TGF-βRⅡ、IL-6和TNF-α的表達研究[J].中國免疫學雜志,2018,v.34(05):751-756.YINY,SIXL,GAOY,etal.Thenuclearfactor-κBcorrelateswithincre-asedexpress-ionofinterleukin-6andpromotesprogressionofgastriccarcinoma[J].OncolRep,2013,29:34-8.程玉,李春輝,劉海旺,等.Akt1信號通路在胃癌組織中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學:560-562[2024-03-27],2015,v.36(04):560-562.武才琪,王慶林,李盼,等.P53、PCNA、CA724、胃泌素17及幽門螺桿菌抗體聯合檢測在萎縮性胃炎與早期胃癌鑒別中的應用價值[J].中國微生態(tài)學雜志,2020,v.32(02):191-195.FujiwaraY,ArakawaT,FukudaT,etal.Interleukin-8simulatesleukocytemigrationacrossamonolayerofculturedrabbitTNF,IL-1,IL-8andIL-lrainMonosodiumUratecrystalinducedrabbitar-thritis[J].LabInvest,1998,78(5):559.JunT.Low,MichaelChristie,MatthiasErnst,etal.LossofNFKB1ResultsinExpressionofTumorNecrosisFactorandActivationofSTAT1toPromoteGastricTumorigenesisinMice[J].Gastroenterology,2020.LeeRueckertMiriam,LappalainenJani,KovanenPetriT,etal.Lipid-LadenMacrophagesandInflammationinAtherosclerosisandCancer:AnIntegrativeView [J].FrontiersinCardiovascularMedicine,2022.ExplorationofXiangshaYangweiPillsBasedonGC-MSandNetworkPharmacologyFundamentalsofAromaticMedicinalSubstancesAbstract:ThisresearchemployedGC-MStechnologyfortheidentificat