152023-01-28發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、鄂托克前旗農(nóng)牧I馬鈴薯腐爛莖線蟲的qPCR檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了利用qPCR檢測技術(shù)對馬鈴薯腐爛莖線蟲檢測的試劑、儀器、樣品處理、DNA提取、結(jié)本文件適用于土壤和馬鈴薯植物樣品中腐爛莖線蟲的qPCGB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T1121.1土壤檢測第1部分：土壤樣品的采集、處理和儲存3.1腐爛莖線蟲ditylenchusdest腐爛莖線蟲屬于線蟲門（Nematoda）、側(cè)尾腺綱（Secernrntea）、墊刃目（Tylenchida）萎蔫、塊莖干腐等癥狀，導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)降低。參3.2依據(jù)熒光信號的強(qiáng)度對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測4.1.1除特別規(guī)定外，所有實驗用試劑均為分析純，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中相關(guān)規(guī)定。14.1.3CTAB緩沖液：2%CTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，0.02MEDTA，pH=8.0。E緩沖mMTris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0。4.1.4TE緩沖液：10mMTris-HCl，），4.2儀器20℃),超低溫冰箱（-80℃),制冰機(jī)，水浴鍋，渦旋振蕩儀，磁力攪拌器，高壓滅菌鍋，定量熒），），4.3材料），），），土壤樣品采集方法采用NY/T1121.1。濕環(huán)境。此外，土壤樣品也可于干燥箱中(≤40℃)進(jìn)行24h烘干。取6.2.2中經(jīng)前處理的土壤樣品，按照四分法進(jìn)行取樣，將土樣平鋪于塑料薄膜或紙張上，呈四方每份土樣取3個重復(fù)，每個重復(fù)取10g土樣于50mL離心管中，加入20mL土壤提取緩沖液，渦旋震2混勻一次，水浴完畢后12000rpm離心10min，將上清移至新的2mL離心管中，加入1mL氯仿，震蕩混勻，12000rpm離心10min，將上清移至新的2mL離心管中，加入1mLTris飽和酚，震蕩混勻，12000MGB。反應(yīng)體系中各試劑的量在保持濃度不變的前提下可隨總體積進(jìn)行調(diào)整，也可使用商業(yè)化qPCR試劑3MgCl2DNA模板倍稀釋液或50倍稀釋液為模板，進(jìn)行qPCR檢測，每個樣品設(shè)置三個技術(shù)最小檢測濃度為每個反應(yīng)體系5個靶標(biāo)片段拷貝，在反應(yīng)體系正常工作的前提下，根據(jù)Ct值進(jìn)行結(jié)——待測樣品DNA原液或任一濃度稀釋液檢測結(jié)果Ct＜35，判定該樣品中檢出腐爛莖線蟲；——待測樣品DNA原液及所有稀釋液檢測結(jié)果均為Ct≥40，判定該樣品中未檢出腐爛莖線蟲；——待測樣品DNA原液及稀釋液檢測所得最小Ct值范圍為35≤Ct＜40時，應(yīng)重新進(jìn)行檢測，結(jié)4后續(xù)研究和生產(chǎn)需要。保存期滿后，馬鈴薯腐爛莖線蟲5），A.2生物學(xué)特性該線蟲可在5℃~34℃下發(fā)育繁殖，最適溫度為20℃~27℃。在27℃~28℃下完成生活史需要18d，20℃~24℃時需要20d～26d，在6℃~10℃時需要68d高溫在35℃以上即停止活動，即恢復(fù)活動，浸在水中半個月，莖線蟲并不完全死亡。在15℃~20℃,相對濕度90%～100%條件下危害最重，相對濕度低于40%線蟲不能存活。該線蟲不形成抗性休眠體，不耐干燥，以卵