152023-09-15發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：王萍、劉杰才、陳貴華、許珂、尚鵬、李石恒、I籽用西葫蘆種子病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了籽用西葫蘆種子病毒RT-P本文件適用于籽用西葫蘆種子中黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvi3.1黃瓜花葉病毒cucumbermos3.2西瓜花葉病毒watermelonmosaicvir種類。受侵染的病株葉片表現(xiàn)花葉、畸形、新生3.3小西葫蘆黃化花葉病毒zucchiniyellowmosaic可由多種蚜蟲以非持久性方式傳播，也能通14.2核酸染料。4,6TE緩沖液(pH8.0)：分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見4.5)和2mL乙二胺四乙酸4,11CMV病毒檢測上游引物CMV-F:5′-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3′,下游引物CMV-R:5′-4.13ZYMV病毒檢測上游引物ZYMV-F:5′-ATGCAGAGGCACCATACAT-3′,下游引物ZYMV-R:5′-5.3PCR擴增儀。5.6凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。2經(jīng)過RT-PCR擴增和測序分析精確不含采集適量的籽用西葫蘆種子，放入自封袋中8.1.3RNA濃度檢測：提取的樣品總RNA用Nanodrop微量分光光度計測定RNA相對濃度，當(dāng)OD260/OD2808.2反轉(zhuǎn)錄8.3PCR擴增38.4瓊脂糖凝膠電泳檢測8.4.2電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像，進行結(jié)果分析。如需通過序列分析確認PCR擴增片段是否為目的DNA片段，按照8.4.3的規(guī)定執(zhí)行。9.1.2試樣和陽性對照擴增出CMV病毒特異性條9.1.3試樣、陰性對照和空白對照未擴增出CMV病毒特異性條帶，陽性對照擴增出9.1.4陽性對照未擴增出CMV特異性條帶，試樣、陰性對照和空白對照擴增出CMV特異性條帶或條帶不清楚。說明檢測結(jié)果無效，將實驗中的所有9.2.1判定條件：RT-PCR產(chǎn)物在485bp處有無條帶（參9.2.2試樣和陽性對照擴增出WMV病毒特異性條帶，陰性對9.2.3試樣、陰性對照和空白對照未擴增出WMV病毒特異性條帶，陽性對照擴增出WMV特異49.2.4陽性對照未擴增出WMV特異性條帶，試樣、陰性對照和空白對照擴增出WMV特異性條帶或條帶不清楚。說明檢測結(jié)果無效，將實驗中的所有9.3ZYMV基因檢測結(jié)果分析9.3.4陽性對照未擴增出ZYMV特異性條帶，陰性對照和空白對照擴增出ZYMV特異性條帶或條帶不清楚。說明檢測結(jié)果無效，將實驗中的所有試劑更換，并重新提取樣品RNA，進行RT-PCR檢測。5注1：序列方向為5′-3′。注