HB-infusionTM無縫克隆試劑盒使用說明（附原理說明）一、產(chǎn)品簡介HB-infusionTM無縫克隆試劑盒是一種新型、快速并且高效的GibsonAssemblyDNA定向克隆技術(shù)，可以在任意載體的任意位置一次插入多個目的基因片段。HB-infusionTM無縫克隆試劑盒操作極其簡單，僅需在載體的克隆位點進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入與載體克隆位點兩端完全一致的15~25bp同源序列（圖1，圖3）。將上述線性化的克隆載體和帶有同源序列的PCR片段按合適比例混合，并加入HB-infusionTMMastermix，通過反應(yīng)體系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及連接酶的在50℃反應(yīng)20min即可快速完成定向克隆，陽性率幾近100%。圖1.HB-infusionTM快速克隆試劑盒原理示意圖。1.線性化目的載體（左上）；2.PCR獲取目的片段。設(shè)計的引物５’需要和線性化載體末端有15~25bp的重疊（圖中藍(lán)色和黃色片段，細(xì)節(jié)可參考圖3）；3.按照一定比例把二者混合在HB-infusionTM的2預(yù)混液內(nèi)，50C反應(yīng)20min后直接轉(zhuǎn)化E.coli即可。二、HB-infusionTM試劑盒的優(yōu)點1.相比于傳統(tǒng)的同源重組的無縫克隆方法進(jìn)行，HB-infusionTM試劑盒更高效，操作更簡單，只需要一次反應(yīng)即可完成定向克?。?.對酶切位點無要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點；3.連接片段之間不會引入任何其他序列；4.可以同時克隆多個片段。三、產(chǎn)品包裝產(chǎn)品組成使用次數(shù)體積2xHB-infusionTMMastermix20tests200lPositivelinearizedpUCvector（250ng）5tests25lPositivecontrolinsert(500ng)5tests25l儲存條件-20℃四、使用說明漢恒生物建議2-3個片段連接時，DNA片段的使用總量為0.02~0.5pmols，4~6片段連接時加入的DNA總量為0.2~1.0pmols。DNA拼接效率隨著拼接片段的數(shù)量增加或者拼接片段長度的增加逐漸降低。附：片段摩爾數(shù)量計算公式：pmols=片段質(zhì)量(ng)1000/(堿基對數(shù)650daltons)（堿基數(shù)越多，pmols越少；質(zhì)量越大，pmols越多），舉例如下：線性化載體（~5000bp）50ng插入片段（~500bp）10~25ng注：50ng的5000bp（0.015pmols）的線性化dsDNA和10~25ng（0.03~0.075pmols）500bp的PCR產(chǎn)物體系（PCR產(chǎn)物和線性化載體的摩爾比=2：1~5：1）。五、操作步驟1.制備線性化載體和插入片段1.1.載體制備---線性化處理A.質(zhì)粒酶切法在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點進(jìn)行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進(jìn)行割膠純化。注：1.為了降低載體自連背景，提高陽性率，建議采用雙酶切載體質(zhì)粒。酶切最好能切出一個較大片段，這樣回收的目的條帶可以和沒有切開的質(zhì)粒明顯分開。GibsonAssembly拼接DNA的原理說明DCBADCBA包含重疊區(qū)域的DNA片段均勻混在一起，Mix內(nèi)的5‘外切酶可以從5’端消化DNA雙鏈中一條鏈（A）；重疊區(qū)域的DNA形成單鏈，在50°C配對（這一步不需要酶的參與）（B）；同時外切酶的活性在50°C會逐漸喪失；DNA聚合酶從5‘-3’方向延伸（類似PCR中引物結(jié)合之后的