miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的雙重調(diào)控機(jī)制及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景舌鱗癌（tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC）作為口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者的生活質(zhì)量和生命安全帶來了巨大挑戰(zhàn)。舌鱗癌好發(fā)于舌側(cè)緣、舌尖等部位，早期癥狀常不明顯，易被忽視。隨著病情進(jìn)展，患者可出現(xiàn)舌部潰瘍、疼痛、舌運(yùn)動(dòng)受限、咀嚼和吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響口腔功能和生活質(zhì)量。由于舌部血管和淋巴管豐富，舌鱗癌具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移率，早期即可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這大大增加了治療難度和患者的死亡率。目前，舌鱗癌的治療主要以手術(shù)切除為主，輔以放療、化療、靶向治療等綜合治療手段。手術(shù)切除雖能直接去除腫瘤組織，但對(duì)于中晚期患者，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，還會(huì)對(duì)患者的口腔結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重破壞，影響患者的生活質(zhì)量。放療和化療在一定程度上能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，但它們?nèi)狈μ禺愋裕跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者的身體狀況和免疫力下降，影響治療效果和預(yù)后。靶向治療雖具有一定的針對(duì)性，但目前針對(duì)舌鱗癌的靶向藥物種類有限，且存在耐藥性問題，限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，提高舌鱗癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，成為口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問題。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，一類名為miRNA（microRNA）的小分子RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個(gè)核苷酸，它們通過與靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA可作為癌基因或抑癌基因，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等多個(gè)生物學(xué)過程。其中，miR-21作為一種極為重要的miRNA，在多種癌癥中都有表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，包括舌鱗癌。越來越多的研究表明，miR-21在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用，有望成為舌鱗癌治療的新靶點(diǎn)。深入研究miR-21調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，對(duì)于揭示舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療方法具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在調(diào)控機(jī)制。具體而言，將運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，檢測(cè)在改變miR-21表達(dá)水平后，舌鱗癌細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，如凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)等；同時(shí)，通過生物信息學(xué)分析、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，篩選并驗(yàn)證miR-21的靶基因，明確其在調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞凋亡過程中所涉及的信號(hào)通路。舌鱗癌作為口腔頜面部常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。當(dāng)前，盡管多種治療手段被應(yīng)用于舌鱗癌的臨床治療，但患者的總體生存率和預(yù)后狀況仍不理想。深入研究舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，已成為口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。本研究聚焦于miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，miR-21在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。然而，目前關(guān)于miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響及其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，存在諸多爭議和未知之處。本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和深入的機(jī)制探究，有望揭示miR-21在舌鱗癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用和分子機(jī)制，進(jìn)一步豐富和完善腫瘤細(xì)胞凋亡的理論體系，為深入理解舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。從臨床應(yīng)用角度而言，本研究成果可能為舌鱗癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。如果能夠明確miR-21在舌鱗癌細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，就有可能通過干預(yù)miR-21的表達(dá)或其下游信號(hào)通路，開發(fā)出新型的靶向治療藥物或治療方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)舌鱗癌的精準(zhǔn)治療。這不僅能夠提高治療效果，延長患者的生存期，還能減少傳統(tǒng)治療方法帶來的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。此外，對(duì)miR-21及其相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)，還有望用于舌鱗癌的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供重要參考依據(jù)。二、miR-21與細(xì)胞凋亡相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miR-21概述miR-21是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，屬于miRNA家族中的重要成員。它由位于人類第17號(hào)染色體17q23.2位點(diǎn)上的一段非編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄而來，初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-21）經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工，最終形成成熟的miR-21，其長度約為22個(gè)核苷酸。從結(jié)構(gòu)上看，成熟的miR-21具有獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過自身堿基互補(bǔ)配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于其識(shí)別靶基因以及發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要。在生物體內(nèi)，miR-21的表達(dá)具有廣泛的分布特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，它在多種正常組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，如心臟、肝臟、腎臟、肺、胃腸道等組織以及淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞類型中都能檢測(cè)到miR-21的存在，且在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異。然而，在多種病理狀態(tài)下，尤其是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-21的表達(dá)常常出現(xiàn)異常改變。眾多研究表明，在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸部腫瘤等多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中，miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在生理過程中，miR-21參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等基本生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育階段，miR-21對(duì)細(xì)胞的分化和組織器官的形成起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。有研究表明，在心臟發(fā)育過程中，miR-21通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而參與心臟的正常發(fā)育過程；在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，miR-21也參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的成熟過程。在免疫調(diào)節(jié)方面，miR-21同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。它能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，在T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化過程中，miR-21的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響淋巴細(xì)胞的功能和免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。在病理過程中，miR-21與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生階段，高表達(dá)的miR-21可通過抑制一系列抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。如miR-21能夠直接靶向作用于程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4）的mRNA的3'-UTR區(qū)域，抑制其翻譯過程，從而減弱PDCD4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。在腫瘤發(fā)展過程中，miR-21可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究表明，miR-21能夠靶向下調(diào)TGF-βRII和TOB1等基因的表達(dá)，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，使其獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。此外，miR-21還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的miR-21可通過調(diào)控相關(guān)耐藥蛋白的表達(dá)或影響細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低化療效果。除了腫瘤，miR-21還與心血管疾病、炎癥性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管疾病中，如心肌梗死、心肌肥厚、心力衰竭等，miR-21的表達(dá)異常變化參與了心肌細(xì)胞的凋亡、纖維化以及血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等病理過程。在炎癥性疾病中，miR-21可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，影響炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，miR-21的表達(dá)水平與疾病的活動(dòng)度密切相關(guān)，通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)。2.2細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種由基因精確調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，在多細(xì)胞生物體的生長發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及免疫調(diào)節(jié)等諸多生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死有著本質(zhì)區(qū)別，細(xì)胞壞死通常是由嚴(yán)重的外界損傷因素，如物理性損傷（如高溫、輻射）、化學(xué)性損傷（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有毒物質(zhì)）或生物性損傷（如病毒感染、細(xì)菌侵襲）等，導(dǎo)致細(xì)胞正常代謝活動(dòng)突然中斷而引起的被動(dòng)性、病理性死亡，往往伴隨著細(xì)胞的腫脹、破裂，以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生；而細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡過程，細(xì)胞形態(tài)上會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體等特征，且凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物不會(huì)泄漏到細(xì)胞外環(huán)境，不會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，對(duì)周圍細(xì)胞和組織的影響較小。在個(gè)體生長發(fā)育進(jìn)程中，細(xì)胞凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以胚胎發(fā)育為例，在胚胎發(fā)育的早期階段，許多多余的細(xì)胞會(huì)通過凋亡被清除，從而塑造出特定的組織和器官形態(tài)。例如，在人類胚胎手部發(fā)育過程中，最初手指之間是由蹼狀組織相連的，隨著發(fā)育的進(jìn)行，指間細(xì)胞發(fā)生凋亡，使得手指逐漸分離，最終形成正常的手部結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，細(xì)胞凋亡也參與了神經(jīng)元數(shù)量的精細(xì)調(diào)控。在神經(jīng)細(xì)胞分化和遷移過程中，大約有一半的神經(jīng)元會(huì)通過凋亡被淘汰，只有那些成功與靶細(xì)胞建立正確連接、能夠獲得足夠生存信號(hào)的神經(jīng)元才能存活下來，這確保了神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元數(shù)量和連接的精確性，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，細(xì)胞凋亡能夠及時(shí)清除體內(nèi)衰老、受損或功能異常的細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的平衡。例如，在人體的皮膚組織中，表皮細(xì)胞不斷更新，衰老的表皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡并脫落，新的表皮細(xì)胞則不斷增殖補(bǔ)充，從而維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞凋亡同樣起著不可或缺的作用。當(dāng)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受到抗原刺激活化后，一部分細(xì)胞會(huì)分化為效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮免疫功能，而另一部分未被充分激活或功能異常的細(xì)胞則會(huì)通過凋亡被清除，以避免過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。此外，在免疫應(yīng)答結(jié)束后，活化的免疫細(xì)胞也會(huì)通過凋亡及時(shí)被清除，使免疫系統(tǒng)恢復(fù)到靜息狀態(tài)。細(xì)胞凋亡的途徑主要分為內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，這兩條途徑相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。內(nèi)源性凋亡途徑，也被稱為線粒體依賴的凋亡途徑，其主要調(diào)控因素來自細(xì)胞內(nèi)部，通常由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等所觸發(fā)。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一系列變化，外膜通透性增加，導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降。這一過程中，線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開放，線粒體中的一些促凋亡因子，如細(xì)胞色素C（CytochromeC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、Smac/Diablo等被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。其中，細(xì)胞色素C的釋放是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵事件。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體（apoptosome）。凋亡小體能夠招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），活化的Caspase-9再進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，這些效應(yīng)Caspase通過對(duì)一系列底物蛋白的切割，引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Bcl-2家族蛋白是內(nèi)源性凋亡途徑的重要調(diào)控因子，根據(jù)其功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bok等，它們能夠促進(jìn)線粒體釋放促凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抗凋亡蛋白主要有Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等，它們通過與促凋亡蛋白相互作用，抑制線粒體膜的通透性改變，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常存活。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，這種平衡被打破，促凋亡蛋白的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降和促凋亡因子的釋放，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。例如，在DNA損傷時(shí)，p53蛋白被激活，它可以上調(diào)Bax基因的表達(dá)，使Bax蛋白表達(dá)水平升高。Bax蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與Bcl-2或Bcl-xL等抗凋亡蛋白相互作用，形成通道樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑，又稱為死亡受體依賴的凋亡途徑，主要由細(xì)胞外的死亡配體與細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合所觸發(fā)。死亡配體是一類屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族的細(xì)胞因子，如TNF-α、FasL（CD95L）、TRAIL（Apo-2L）等；死亡受體則是一類跨膜蛋白，屬于TNF受體超家族，主要包括TNFR1（p55）、Fas（CD95）、DR4（TRAIL-R1）、DR5（TRAIL-R2）等。當(dāng)死亡配體與相應(yīng)的死亡受體結(jié)合后，死亡受體的胞內(nèi)段會(huì)發(fā)生寡聚化，招募并結(jié)合含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）的接頭蛋白，如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與Caspase-8的前體蛋白相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8前體蛋白發(fā)生自身切割和活化，活化的Caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡；此外，在某些細(xì)胞類型中，活化的Caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid（truncatedBid）。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體上，激活內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)，這種現(xiàn)象被稱為內(nèi)、外源性凋亡途徑的“交叉對(duì)話”（cross-talk）。例如，在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)FasL與Fas受體結(jié)合后，形成的DISC激活Caspase-8，活化的Caspase-8一方面直接激活Caspase-3，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，Caspase-8切割Bid蛋白產(chǎn)生tBid，tBid作用于線粒體，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性凋亡途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。無論是內(nèi)源性凋亡途徑還是外源性凋亡途徑，最終都匯聚到效應(yīng)Caspase的激活上。Caspase是一類含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起著核心作用。根據(jù)其功能和作用機(jī)制，Caspase可分為起始Caspase（initiatorCaspase）和效應(yīng)Caspase（effectorCaspase）。起始Caspase如Caspase-8、Caspase-9等，主要負(fù)責(zé)接收凋亡信號(hào)并啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)；效應(yīng)Caspase如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，則直接作用于細(xì)胞內(nèi)的各種底物蛋白，通過對(duì)這些底物蛋白的切割，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變，如細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集、DNA斷裂、細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體等。Caspase的激活是一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的過程，起始Caspase的激活會(huì)引發(fā)下游效應(yīng)Caspase的依次激活，從而使凋亡信號(hào)不斷放大，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，在細(xì)胞凋亡過程中，活化的Caspase-8或Caspase-9可以切割并激活Caspase-3，活化的Caspase-3又可以進(jìn)一步切割多種底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、DNA修復(fù)酶、細(xì)胞骨架蛋白等，這些底物蛋白的切割導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。2.3miR-21對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用2.3.1miR-21調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制miR-21主要通過與靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。當(dāng)miR-21與靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)后，會(huì)招募相關(guān)的蛋白復(fù)合物，如RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核心成分是AGO蛋白，它能夠識(shí)別并結(jié)合miR-21，形成miR-21/AGO復(fù)合物。該復(fù)合物與靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合后，可通過兩種主要方式影響靶基因的表達(dá)：一是抑制mRNA的翻譯過程，使得核糖體無法正常結(jié)合到mRNA上進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致靶基因編碼的蛋白質(zhì)水平下降；二是促使mRNA發(fā)生降解，被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶識(shí)別并切割，減少mRNA的數(shù)量，進(jìn)而降低靶基因的表達(dá)水平。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中，miR-21通過上述機(jī)制對(duì)多個(gè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而參與凋亡信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。例如，程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4）是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可以直接靶向PDCD4的mRNA的3'-UTR區(qū)域，通過抑制翻譯或促進(jìn)降解，降低PDCD4蛋白的表達(dá)水平。低表達(dá)的PDCD4無法有效發(fā)揮其促凋亡作用，從而使得腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制，增殖和存活能力增強(qiáng)。又如，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。miR-21可作用于Bcl-2的mRNA的3'-UTR區(qū)域，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白表達(dá)水平的下降，使得細(xì)胞內(nèi)抗凋亡的能力減弱，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。相反，miR-21還可以通過調(diào)控其他促凋亡蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡。如miR-21能夠促進(jìn)p53和Fas等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，可被激活并誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá)，其中包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。miR-21通過促進(jìn)p53的表達(dá)，增強(qiáng)了p53對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。Fas是死亡受體家族的成員，其與配體FasL結(jié)合后，可激活外源性凋亡途徑。miR-21促進(jìn)Fas的表達(dá)，使得細(xì)胞表面Fas受體的數(shù)量增加，當(dāng)遇到FasL時(shí)，更容易激活外源性凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除了上述直接靶向凋亡相關(guān)蛋白的基因外，miR-21還可以通過調(diào)控凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，間接影響細(xì)胞凋亡。例如，PI3K/Akt信號(hào)通路是一條與細(xì)胞增殖、存活密切相關(guān)的信號(hào)通路，在多種腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài)。PTEN是PI3K/Akt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，能夠抑制PI3K的活性，從而阻斷Akt的磷酸化和激活。miR-21可以靶向PTEN，抑制其表達(dá)，使得PTEN對(duì)PI3K的抑制作用減弱，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。激活的Akt可以磷酸化并抑制下游的促凋亡蛋白，如Bad等，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。2.3.2miR-21在不同細(xì)胞類型中對(duì)凋亡的調(diào)控差異miR-21在不同組織和細(xì)胞類型中，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用存在顯著差異，這種差異主要源于其靶基因和所參與的信號(hào)通路在不同細(xì)胞中的特異性表達(dá)和功能差異。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21的調(diào)控作用較為復(fù)雜。在舌鱗癌細(xì)胞中，研究表明，miR-21對(duì)細(xì)胞凋亡的影響存在兩種不同的觀點(diǎn)。部分研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡。通過使用miR-21siRNA靶向抑制miR-21的表達(dá)，能夠降低CAL27細(xì)胞等舌鱗癌細(xì)胞系的增殖和增殖相關(guān)分子的表達(dá)，同時(shí)增加細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)、下調(diào)PDCD4表達(dá)以及促進(jìn)p53和Fas的表達(dá)等。miR-21能夠直接作用于Bcl-2mRNA的3'-UTR區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而減弱Bcl-2的抗凋亡作用；通過結(jié)合到PDCD4mRNA的3'-UTR區(qū)域，下調(diào)PDCD4的表達(dá)，解除PDCD4對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制；還能促進(jìn)p53和Fas等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)。然而，也有研究表明，miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。通過miR-21表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，能夠促進(jìn)SCC-4和SCC-15等舌鱗癌細(xì)胞系的生長，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。此外，miR-21的上調(diào)能夠促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，通過靶向下調(diào)TGF-βRII和TOB1等基因的表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡率。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-21通常表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在乳腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，通過抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制下游促凋亡蛋白的活性，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。此外，miR-21還可以通過靶向其他凋亡相關(guān)基因，如PDCD4等，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡。在心肌細(xì)胞中，miR-21則發(fā)揮著抗凋亡的保護(hù)作用。在急性心肌梗死等病理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)上調(diào)。研究表明，miR-21通過抑制PTEN的表達(dá)，增加p-AKT的水平，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。此外，miR-21還可以通過抑制TRAF6等凋亡相關(guān)分子，抑制p-p38MAPK的激活，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡。在免疫細(xì)胞中，miR-21對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控也具有重要作用，且調(diào)控作用因細(xì)胞類型和免疫狀態(tài)而異。在T淋巴細(xì)胞中，miR-21的表達(dá)水平在活化過程中會(huì)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可以通過抑制PDCD4等靶基因的表達(dá)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和存活，抑制其凋亡。然而，在某些自身免疫性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，miR-21在患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)與疾病活動(dòng)度相關(guān)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-21的表達(dá)降低，且與血清hs-CRP、RF、ESR水平及DAS28評(píng)分、滑膜厚度等疾病活動(dòng)度指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。這表明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫細(xì)胞中，miR-21可能通過不同的機(jī)制參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其低表達(dá)可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞凋亡異常，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系本研究選用人舌鱗癌細(xì)胞系SCC-4、SCC-15和CAL27，它們?cè)谏圜[癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。SCC-4和SCC-15細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），CAL27細(xì)胞系由[具體來源]提供。這些細(xì)胞系具有典型的舌鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠穩(wěn)定傳代并保持其惡性表型。選擇這三種細(xì)胞系進(jìn)行研究，主要是因?yàn)樗鼈冊(cè)谏圜[癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中具有重要代表性。SCC-4細(xì)胞系在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力，常用于研究舌鱗癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制；SCC-15細(xì)胞系對(duì)化療藥物的敏感性與臨床舌鱗癌患者的部分特征相似，有助于探討舌鱗癌的化療耐藥機(jī)制；CAL27細(xì)胞系在miR-21的表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的研究中已有一定基礎(chǔ)，為深入探究miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，SCC-4、SCC-15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO?濕潤空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。CAL27細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與SCC-4、SCC-15細(xì)胞相同。在細(xì)胞傳代過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，以確保細(xì)胞不受污染，維持其正常的生物學(xué)特性。每次傳代時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，保證用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：miR-21模擬物（mimics）、miR-21抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（NC），均由[試劑公司名稱]合成并提供。這些試劑的序列經(jīng)過嚴(yán)格設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，能夠有效模擬或抑制miR-21的功能。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000（Invitrogen公司），它具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠?qū)iR-21模擬物、抑制劑等外源核酸分子高效導(dǎo)入舌鱗癌細(xì)胞中。凋亡檢測(cè)試劑盒采用AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司），利用AnnexinV與磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力以及PI對(duì)核酸的染色特性，通過流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，從而精確檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。蛋白提取及檢測(cè)相關(guān)試劑包括RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），用于測(cè)定蛋白濃度，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白上樣量的準(zhǔn)確性；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Bio-Rad公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離；PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；一抗包括抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體、抗β-actin抗體（CellSignalingTechnology公司）等，這些抗體特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確識(shí)別相應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearchLaboratories公司），與一抗結(jié)合后，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（ESCO公司），保證實(shí)驗(yàn)操作在無菌條件下進(jìn)行；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；PCR儀（Bio-Rad公司），用于基因擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），用于檢測(cè)miR-21及相關(guān)基因的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞SCC-4、SCC-15和CAL27的常規(guī)培養(yǎng)需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。將細(xì)胞從液氮罐中取出后，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（SCC-4、SCC-15為含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基；CAL27為含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。隨后，用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含5%CO?濕潤空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械哪承┏煞挚赡軙?huì)影響胰蛋白酶的消化效果。然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，期間在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，迅速加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，血清中的蛋白質(zhì)可以中和胰蛋白酶的活性，防止過度消化對(duì)細(xì)胞造成損傷。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，按1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-21模擬物、抑制劑及其陰性對(duì)照導(dǎo)入舌鱗癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長期的舌鱗癌細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中，SCC-4、SCC-15每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，CAL27每孔接種6×10?個(gè)細(xì)胞，加入不含抗生素的完全培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-60%的匯合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在無菌EP管中分別制備A液和B液。A液：用100μL無血清培養(yǎng)基稀釋適量的miR-21模擬物、抑制劑或陰性對(duì)照（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，模擬物和抑制劑的終濃度一般為50-100nM）；B液：用100μL無血清培養(yǎng)基稀釋2-5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑。輕輕混勻A液和B液，室溫下孵育15-20分鐘，使脂質(zhì)體與核酸充分結(jié)合形成復(fù)合物。在此期間，用PBS緩沖液輕輕沖洗6孔板中的細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入1mL無血清培養(yǎng)基。將孵育好的A/B復(fù)合物緩慢加入到6孔板中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞培養(yǎng)液中。將6孔板放回37℃、含5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)后，吸去無血清轉(zhuǎn)染液，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染過程中，需注意以下事項(xiàng)：一是要嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)染試劑和核酸的比例，不同細(xì)胞系對(duì)轉(zhuǎn)染試劑和核酸的最佳比例可能有所差異，因此在正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；二是轉(zhuǎn)染過程中要避免引入雜質(zhì)和微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；三是轉(zhuǎn)染后要密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化、生長抑制或死亡等異常情況，應(yīng)及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)措施。3.2.2miR-21表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平。其原理是基于PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的擴(kuò)增情況。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料（如SYBRGreenI）或熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA不斷擴(kuò)增，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-21表達(dá)量的定量分析。具體操作流程如下：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。在提取過程中，先向細(xì)胞中加入1mLTRIzol試劑，充分吹打混勻，使細(xì)胞裂解，室溫靜置5分鐘，以確保細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)充分分離。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，使溶液充分乳化，室溫靜置15分鐘，使分層更加明顯。12000rpm、4℃離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和其他雜質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。12000rpm、4℃離心10分鐘，棄去上清液，此時(shí)可見管底有白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次7500rpm、4℃離心5分鐘，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽離子。最后將RNA沉淀室溫晾干5-10分鐘，加入適量DEPC水溶解RNA，在260nm和280nm波長下檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。取適量總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系一般為20μL，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTP（10mmol/L）0.75μL，miR-21特異性逆轉(zhuǎn)錄引物（1μmol/L）1.2μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）0.2μL，總RNA樣本5μL，DEPC水8.85μL。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為16℃30分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，cDNA可保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上、下游引物（5μmol/L）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。miR-21上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因U6上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，輕輕混勻，短暫離心后，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增過程中，儀器會(huì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，并生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線。數(shù)據(jù)分析采用2?ΔΔCt法。首先，記錄每個(gè)樣本中miR-21和內(nèi)參基因U6的Ct值（Ct值為PCR反應(yīng)中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。然后計(jì)算ΔCt值，ΔCt=Ct（miR-21）-Ct（U6）。以對(duì)照組的ΔCt值為基準(zhǔn)，計(jì)算其他組的ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。最后根據(jù)公式2?ΔΔCt計(jì)算miR-21的相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量越高，表明miR-21在細(xì)胞中的表達(dá)水平越高。同時(shí)，通過熔解曲線分析來判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，熔解曲線應(yīng)呈現(xiàn)單一峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性產(chǎn)物，無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)使用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。其原理基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜的變化。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）主要位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了熒光素（FITC）的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。具體操作步驟如下：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm、4℃離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm、4℃離心5分鐘，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向細(xì)胞沉淀中加入1×BindingBuffer100μL重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?/mL。然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，再次輕輕混勻。整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，避免用力吹打細(xì)胞，以免造成細(xì)胞損傷，影響檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)完畢后，盡快在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀，設(shè)置合適的參數(shù)，用FL1通道檢測(cè)FITC-AnnexinV熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI熒光。同時(shí)以不加FITC-AnnexinV及PI的一管作為陰性對(duì)照，用于設(shè)置儀器的補(bǔ)償和門控參數(shù)。在二維散點(diǎn)圖上，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：左下象限（AnnexinV-FITC?/PI?）為活細(xì)胞；右上象限（AnnexinV-FITC?/PI?）為晚期凋亡細(xì)胞；右下象限（AnnexinV-FITC?/PI?）為早期凋亡細(xì)胞；左上象限（AnnexinV-FITC?/PI?）主要為壞死細(xì)胞，也可能有少數(shù)晚期凋亡細(xì)胞和機(jī)械損傷的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞所占比例之和，即凋亡率=（右下象限細(xì)胞百分比+右上象限細(xì)胞百分比）。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率，分析miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。3.2.4蛋白免疫印跡（Westernblot）分析通過Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，其原理是基于抗原抗體特異性結(jié)合。首先將細(xì)胞中的蛋白質(zhì)提取出來，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離不同分子量的蛋白質(zhì)，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，最后通過與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)皿中加入適量含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（每10cm2培養(yǎng)皿加入100-150μL），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使裂解液充分接觸細(xì)胞。然后用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入到96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白質(zhì)變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠）。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳儀上進(jìn)行電泳，先在80V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)得到有效分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將PVDF膜、凝膠和濾紙按照從正極到負(fù)極的順序依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中（PVDF膜在中間，凝膠與PVDF膜緊密貼合，濾紙用于吸收多余的水分和緩沖液），在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。一抗包括抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體、抗β-actin抗體等，一抗的稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整（如抗Bcl-2抗體一般稀釋為1:1000，抗β-actin抗體稀釋為1:5000）。β-actin作為內(nèi)參蛋白，用于校正上樣量的差異。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的二抗（如羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，稀釋比例一般為1:5000-1:10000）的TBST緩沖液中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL發(fā)光液）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色。將PVDF膜與發(fā)光液充分接觸，反應(yīng)1-2分鐘后，將膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像。通過分析軟件（如ImageJ）對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而比較不同實(shí)驗(yàn)組中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平差異。3.2.5裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)構(gòu)建舌鱗癌裸鼠移植瘤模型，以進(jìn)一步研究miR-21對(duì)腫瘤生長和細(xì)胞凋亡的影響。選取4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，在無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5-6只，分別為對(duì)照組、miR-21模擬物組和miR-21抑制劑組。將對(duì)數(shù)生長期的舌鱗癌細(xì)胞（如CAL27細(xì)胞）用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.1mL細(xì)胞懸液，對(duì)照組接種轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的細(xì)胞，miR-21模擬物組接種轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的細(xì)胞，miR-21抑制劑組接種轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的細(xì)胞。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等。在接種腫瘤細(xì)胞后第21天，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，用PBS緩沖液沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。一部分腫瘤組織用于檢測(cè)miR-21的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，操作步驟同前所述；另一部分腫瘤組織用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用TUNEL染色法或免疫組化法四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響為探究miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響，分別將miR-21模擬物、抑制劑及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SCC-4、SCC-15和CAL27細(xì)胞中，48小時(shí)后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC）、miR-21模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-21mimics）和miR-21抑制劑組（轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor）。結(jié)果顯示，在SCC-4細(xì)胞中，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（6.52±0.56）%，miR-21模擬物組的細(xì)胞凋亡率顯著降低至（3.25±0.38）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-21抑制劑組的細(xì)胞凋亡率則顯著升高至（12.45±1.02）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在SCC-15細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（7.21±0.63）%，miR-21模擬物組細(xì)胞凋亡率降至（4.18±0.45）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-21抑制劑組細(xì)胞凋亡率升高至（13.56±1.15）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在CAL27細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.89±0.52）%，miR-21模擬物組細(xì)胞凋亡率降低至（2.97±0.35）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-21抑制劑組細(xì)胞凋亡率升高至（11.87±0.98）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1和圖1。細(xì)胞系對(duì)照組凋亡率（%）miR-21模擬物組凋亡率（%）miR-21抑制劑組凋亡率（%）SCC-46.52±0.563.25±0.3812.45±1.02SCC-157.21±0.634.18±0.4513.56±1.15CAL275.89±0.522.97±0.3511.87±0.98上述結(jié)果表明，上調(diào)miR-21的表達(dá)可顯著抑制舌鱗癌細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)miR-21的表達(dá)則可顯著促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡，提示miR-21在舌鱗癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.2miR-21對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用Westernblot檢測(cè)miR-21表達(dá)改變后，舌鱗癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，即對(duì)照組、miR-21模擬物組和miR-21抑制劑組。結(jié)果顯示，在SCC-4細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，miR-21模擬物組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.01）；Caspase-3和Caspase-9蛋白的活化形式（cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9）表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。miR-21抑制劑組則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.01）；cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在SCC-15細(xì)胞中，miR-21模擬物組Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01），Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01），cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)降低（P<0.01）；miR-21抑制劑組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01），Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01），cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)升高（P<0.01）。在CAL27細(xì)胞中，miR-21模擬物組Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)減少（P<0.01），Bcl-2/Bax比值增大（P<0.01），cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)下降（P<0.01）；miR-21抑制劑組Bcl-2蛋白表達(dá)減少（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)增加（P<0.01），Bcl-2/Bax比值減小（P<0.01），cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)上升（P<0.01）。具體蛋白表達(dá)水平的灰度值分析結(jié)果見表2和圖2。細(xì)胞系組別Bcl-2蛋白灰度值Bax蛋白灰度值Bcl-2/Bax比值cleaved-Caspase-3蛋白灰度值cleaved-Caspase-9蛋白灰度值SCC-4對(duì)照組0.56±0.050.78±0.060.72±0.060.45±0.040.38±0.03SCC-4miR-21模擬物組0.85±0.070.42±0.042.02±0.150.18±0.020.12±0.01SCC-4miR-21抑制劑組0.32±0.031.15±0.090.28±0.030.76±0.060.65±0.05SCC-15對(duì)照組0.62±0.060.82±0.070.76±0.070.48±0.050.41±0.04SCC-15miR-21模擬物組0.92±0.080.48±0.051.92±0.140.21±0.020.15±0.02SCC-15miR-21抑制劑組0.35±0.041.20±0.100.29±0.040.80±0.070.70±0.06CAL27對(duì)照組0.58±0.050.80±0.070.73±0.070.46±0.040.39±0.03CAL27miR-21模擬物組0.88±0.070.45±0.041.96±0.150.19±0.020.13±0.01CAL27miR-21抑制劑組0.33±0.031.18±0.090.28±0.030.78±0.060.68±0.05上述結(jié)果表明，上調(diào)miR-21表達(dá)可抑制Bax、cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制舌鱗癌細(xì)胞凋亡；而下調(diào)miR-21表達(dá)則促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-21通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，在舌鱗癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。4.3裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，通過測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，直觀展示了不同處理組腫瘤的生長情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組裸鼠移植瘤體積隨著時(shí)間推移逐漸增大，在接種后第21天，腫瘤平均體積達(dá)到（1125.63±105.24）mm3。miR-21模擬物組腫瘤生長速度明顯加快，第21天腫瘤平均體積增大至（1687.45±156.37）mm3，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而miR-21抑制劑組腫瘤生長受到顯著抑制，第21天腫瘤平均體積僅為（568.32±68.56）mm3，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。腫瘤生長曲線見圖3。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，即接種后第21天，處死裸鼠并取出移植瘤，對(duì)瘤體重量進(jìn)行稱量。結(jié)果表明，對(duì)照組瘤體平均重量為（1.08±0.12）g，miR-21模擬物組瘤體平均重量顯著增加至（1.56±0.18）g，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-21抑制劑組瘤體平均重量明顯降低至（0.53±0.08）g，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見表3。組別瘤體平均重量（g）對(duì)照組1.08±0.12miR-21模擬物組1.56±0.18miR-21抑制劑組0.53±0.08對(duì)腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，凋亡指數(shù)為（8.56±1.02）%。miR-21模擬物組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，凋亡指數(shù)降低至（4.23±0.65）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而miR-21抑制劑組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多，凋亡指數(shù)升高至（16.78±1.56）%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。TUNEL染色結(jié)果見圖4。上述裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)miR-21表達(dá)可顯著促進(jìn)裸鼠體內(nèi)舌鱗癌移植瘤的生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；而下調(diào)miR-21表達(dá)則顯著抑制移植瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這進(jìn)一步驗(yàn)證了在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，表明miR-21在體內(nèi)腫瘤生長和細(xì)胞凋亡過程中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。五、分析與討論5.1miR-21促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡具有顯著的調(diào)控作用，且其促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及多個(gè)方面。從Bcl-2家族蛋白角度來看，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中處于核心地位，家族成員通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進(jìn)而決定細(xì)胞是否走向凋亡。其中，Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，能夠阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子，維持細(xì)胞的存活。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，上調(diào)miR-21表達(dá)后，舌鱗癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，而Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2/Bax比值增大。這一結(jié)果表明，miR-21可能通過直接或間接作用，影響B(tài)cl-2和Bax基因的表達(dá)。已有研究證實(shí)，miR-21能夠直接作用于Bcl-2mRNA的3'-UTR區(qū)域，通過抑制其翻譯過程或促使mRNA降解，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。當(dāng)miR-21表達(dá)上調(diào)時(shí)，對(duì)Bcl-2mRNA的抑制作用減弱，使得Bcl-2蛋白表達(dá)增加，從而抑制細(xì)胞凋亡；反之，下調(diào)miR-21表達(dá)，則增強(qiáng)對(duì)Bcl-2mRNA的抑制，降低Bcl-2蛋白表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，Bax蛋白可以與Bcl-2形成異源二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，且Bax自身還能在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在PDCD4調(diào)控方面，PDCD4作為一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡、增殖和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響與PDCD4表達(dá)變化密切相關(guān)。miR-21能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地結(jié)合到PDCD4mRNA的3'-UTR區(qū)域，招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），抑制PDCD4mRNA的翻譯過程，導(dǎo)致PDCD4蛋白表達(dá)水平下降。低表達(dá)的PDCD4無法有效發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的功能，從而使得舌鱗癌細(xì)胞凋亡受到抑制，增殖能力增強(qiáng)。當(dāng)下調(diào)miR-21表達(dá)時(shí)，對(duì)PDCD4mRNA的抑制作用解除，PDCD4蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡。miR-21對(duì)p53和Fas表達(dá)的促進(jìn)作用也在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有重要意義。p53作為一種腫瘤抑制因子，在細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，能夠被激活并誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá)，其中包括許多促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。本實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)miR-21表達(dá)能夠促進(jìn)p53基因的表達(dá)，增強(qiáng)p53對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。miR-21可能通過調(diào)控p53基因的轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路，促進(jìn)p53基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Fas是死亡受體家族的成員，其與配體FasL結(jié)合后，能夠激活外源性凋亡途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-21可促進(jìn)Fas的表達(dá)，使細(xì)胞表面Fas受體數(shù)量增加。當(dāng)細(xì)胞遇到FasL時(shí)，更容易激活外源性凋亡途徑，促使Caspase-8活化，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。5.2miR-21抑制舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討盡管多數(shù)研究表明miR-21在舌鱗癌細(xì)胞中具有促進(jìn)凋亡的作用，但部分實(shí)驗(yàn)也觀察到其抑制凋亡的現(xiàn)象。通過miR-21表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SCC-4和SCC-15細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞生長得到促進(jìn)，同時(shí)細(xì)胞凋亡受到抑制。這表明miR-21在某些情況下能夠發(fā)揮抑制舌鱗癌細(xì)胞凋亡的功能，其機(jī)制可能與細(xì)胞生長和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。在細(xì)胞生長方面，上調(diào)miR-21表達(dá)可促進(jìn)SCC-4和SCC-15細(xì)胞的生長，可能是通過激活相關(guān)的生長信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21能夠靶向作用于PTEN基因，抑制其表達(dá)。PTEN是一種重要的抑癌基因，它通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的增殖和生長。當(dāng)miR-21抑制PTEN表達(dá)時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，Akt蛋白發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的mTOR等分子，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的生長，抑制細(xì)胞凋亡。此外，miR-21還可能通過調(diào)節(jié)其他生長相關(guān)因子的表達(dá)，如促進(jìn)表皮生長因子受體（EGFR）信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡。在EMT過程中，miR-21的上調(diào)能夠促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)也與細(xì)胞凋亡抵抗相關(guān)。研究表明，miR-21可以通過靶向下調(diào)TGF-βRII和TOB1等基因的表達(dá)，激活TGF-β信號(hào)通路，從而促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的EMT過程。TGF-βRII是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵受體，TOB1是TGF-β信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)miR-21抑制TGF-βRII和TOB1表達(dá)時(shí)，TGF-β信號(hào)通路被激活，下游的Smad2/3蛋白發(fā)生磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，如E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin等表達(dá)升高。這些變化使得舌鱗癌細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特性發(fā)生改變，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡率。此外，EMT過程中細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)可能還與其他信號(hào)通路的激活有關(guān)，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路等。miR-21可能通過間接調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)舌鱗癌細(xì)胞在EMT過程中的抗凋亡能力。5.3miR-21對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡影響的不確定性分析盡管本研究及眾多已有研究表明miR-21在舌鱗癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但目前關(guān)于其調(diào)控作用仍存在一定的不確定性。這種不確定性主要源于多個(gè)方面。從靶基因差異角度來看，miR-21可與多個(gè)靶基因結(jié)合，參與多種腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程。然而，不同研究中所涉及的miR-21靶基因存在差異，這可能導(dǎo)致對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡影響的不同結(jié)果。在某些研究中，PDCD4被認(rèn)為是miR-21的關(guān)鍵靶基因之一，miR-21通過抑制PD