2025年氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)試題庫答案1.名詞解釋（1）代謝控制發(fā)酵：通過人工控制微生物的代謝途徑，打破其正常代謝調(diào)控機(jī)制，使目標(biāo)代謝產(chǎn)物過量積累的發(fā)酵技術(shù)。核心在于通過菌種選育（如營養(yǎng)缺陷型、抗反饋突變株）或環(huán)境條件控制（如pH、溶氧、生物素濃度），解除產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的反饋抑制或阻遏，迫使代謝流朝向目標(biāo)產(chǎn)物合成方向流動。例如谷氨酸發(fā)酵中，通過控制生物素亞適量破壞細(xì)胞膜通透性，使谷氨酸無法在胞內(nèi)積累，從而解除其對關(guān)鍵酶的反饋抑制。（2）營養(yǎng)缺陷型菌株：指由于基因突變導(dǎo)致喪失合成某種生長必需物質(zhì)（如氨基酸、維生素、嘌呤/嘧啶）能力的菌株，必須在培養(yǎng)基中補(bǔ)充該物質(zhì)才能正常生長。在氨基酸發(fā)酵中，常用于切斷旁路代謝或解除反饋抑制。例如賴氨酸發(fā)酵中，選育高絲氨酸缺陷型菌株（喪失高絲氨酸脫氫酶活性），可阻斷蘇氨酸和蛋氨酸的合成，使代謝流集中向賴氨酸積累。（3）反饋抑制：指代謝途徑的末端產(chǎn)物對該途徑起始關(guān)鍵酶（通常為變構(gòu)酶）活性的抑制作用，是微生物自我調(diào)節(jié)代謝平衡的重要機(jī)制。例如在野生型谷氨酸棒桿菌中，谷氨酸積累會反饋抑制其合成途徑的關(guān)鍵酶（如谷氨酸脫氫酶），導(dǎo)致發(fā)酵終止；通過誘變選育抗反饋抑制突變株（酶的變構(gòu)位點(diǎn)改變，無法與谷氨酸結(jié)合），可解除此抑制，實(shí)現(xiàn)谷氨酸過量生產(chǎn)。（4）前體物質(zhì)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的、能直接參與目標(biāo)產(chǎn)物生物合成且不被其他代謝途徑大量消耗的物質(zhì)。其作用是補(bǔ)充產(chǎn)物合成的中間代謝物，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。例如色氨酸發(fā)酵中添加鄰氨基苯甲酸，可繞過分支酸到鄰氨基苯甲酸的限速步驟；青霉素發(fā)酵中添加苯乙酸作為前體，可定向合成目標(biāo)青霉素組分。需注意前體通常具有毒性，需控制添加濃度（如苯乙酸濃度一般不超過0.1%）。（5）生物素亞適量：在谷氨酸發(fā)酵中，生物素添加量低于菌體正常生長所需的最適濃度（通常為5-10μg/L）。生物素是乙酰輔酶A羧化酶的輔酶，參與脂肪酸合成（進(jìn)而影響細(xì)胞膜磷脂含量）。亞適量生物素會導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂合成不足，膜通透性增加，谷氨酸得以分泌到胞外，避免胞內(nèi)積累引起的反饋抑制。若生物素過量（>20μg/L），膜通透性差，谷氨酸無法分泌，菌體轉(zhuǎn)而積累谷氨酰胺或其他氨基酸。2.簡答題（1）簡述谷氨酸發(fā)酵中生物素的作用機(jī)制及控制方法。生物素是B族維生素，作為乙酰輔酶A羧化酶的輔酶，參與脂肪酸合成（尤其是細(xì)胞膜磷脂的合成）。在谷氨酸發(fā)酵中：①正常濃度（>20μg/L）：生物素充足時(shí)，菌體細(xì)胞膜磷脂合成正常，膜結(jié)構(gòu)完整，谷氨酸難以分泌到胞外，胞內(nèi)谷氨酸積累會反饋抑制其合成途徑的關(guān)鍵酶（如谷氨酸脫氫酶、檸檬酸合酶），導(dǎo)致發(fā)酵終止。②亞適量（5-10μg/L）：生物素不足時(shí)，磷脂合成受阻，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整（磷脂含量降低30%-50%），膜通透性增加，谷氨酸通過膜上的“滲漏通道”（如由谷氨酸分泌蛋白YggB介導(dǎo)）持續(xù)分泌到胞外，胞內(nèi)谷氨酸濃度維持在低水平，解除反饋抑制，促使菌體持續(xù)合成谷氨酸?？刂品椒ǎ?天然培養(yǎng)基（如淀粉水解糖、玉米漿）中生物素含量不穩(wěn)定，需通過預(yù)處理（如活性炭吸附）降低生物素含量；-合成培養(yǎng)基中精確添加生物素，控制濃度在5-10μg/L；-若生物素過量（如玉米漿中生物素含量過高），可通過添加表面活性劑（如吐溫-60）或青霉素（抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成，間接增加膜通透性）來彌補(bǔ)。（2）賴氨酸發(fā)酵中如何通過菌種選育解除反饋抑制？賴氨酸生物合成途徑為天冬氨酸→天冬氨酸半醛→高絲氨酸→甲硫氨酸/蘇氨酸，同時(shí)天冬氨酸半醛→二氨基庚二酸→賴氨酸。野生型菌株中，賴氨酸與蘇氨酸協(xié)同反饋抑制天冬氨酸激酶（AK）活性（協(xié)同反饋抑制），且賴氨酸單獨(dú)阻遏AK的合成（反饋?zhàn)瓒簦?。解除抑制的主要策略：①選育高絲氨酸缺陷型菌株（thr?或hom?）：喪失高絲氨酸脫氫酶活性，無法合成高絲氨酸（進(jìn)而無法合成蘇氨酸和甲硫氨酸），培養(yǎng)基中需限量添加蘇氨酸（避免過量），此時(shí)胞內(nèi)蘇氨酸濃度極低，無法與賴氨酸協(xié)同抑制AK，解除協(xié)同反饋抑制。②選育抗反饋抑制突變株：通過誘變使AK的變構(gòu)位點(diǎn)發(fā)生改變，喪失與賴氨酸/蘇氨酸結(jié)合的能力（如選育對S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸（AEC）抗性的菌株，AEC是賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，能模擬賴氨酸的反饋抑制作用，抗性菌株的AK對AEC不敏感，對賴氨酸也不敏感）。③解除反饋?zhàn)瓒簦和ㄟ^誘變使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，阻斷賴氨酸對AK合成的阻遏作用，確保AK持續(xù)合成。例如選育組成型突變株，其AK表達(dá)不受賴氨酸濃度調(diào)控。（3）簡述種齡和接種量對氨基酸發(fā)酵的影響。種齡：指種子培養(yǎng)的時(shí)間，即種子罐中菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長期的時(shí)間點(diǎn)。-種齡過短（對數(shù)前期）：菌體代謝活力低，接種后延遲期長，發(fā)酵啟動慢，可能導(dǎo)致雜菌污染風(fēng)險(xiǎn)增加；-種齡過長（對數(shù)后期或穩(wěn)定期）：菌體老化，酶活性下降，部分菌體自溶，接種后生長緩慢，產(chǎn)率降低（如谷氨酸發(fā)酵中，種齡超過10h會導(dǎo)致產(chǎn)酸率下降5%-10%）。最適種齡通常為對數(shù)生長期中期（如谷氨酸發(fā)酵種齡6-8h，菌體形態(tài)為均勻的單個(gè)桿菌，OD600約1.2-1.5）。接種量：指種子液體積與發(fā)酵液體積的比例（通常為5%-15%）。-接種量過?。?lt;5%）：菌體濃度低，延遲期延長，發(fā)酵周期增加，且初期菌體競爭力弱，易染菌；-接種量過大（>15%）：種子液帶入過多代謝副產(chǎn)物（如乳酸、乙酸），可能抑制菌體生長；同時(shí)菌體過早進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)物合成提前終止（如賴氨酸發(fā)酵中，接種量20%時(shí)，產(chǎn)酸率比10%時(shí)降低8%-12%）。最適接種量需根據(jù)菌種特性調(diào)整（如谷氨酸發(fā)酵通常為10%，蘇氨酸發(fā)酵為8%-10%）。（4）pH對氨基酸發(fā)酵的影響及控制方法。pH影響：①酶活性：氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵酶（如谷氨酸脫氫酶最適pH7.0-7.2，天冬氨酸激酶最適pH7.5-8.0）對pH敏感，偏離最適pH會導(dǎo)致酶活性下降；②細(xì)胞膜電荷：影響營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、銨離子）的跨膜運(yùn)輸（如pH過低時(shí)，細(xì)胞膜負(fù)電荷增加，銨離子吸收受阻）；③代謝方向：pH變化會改變代謝流分布（如谷氨酸發(fā)酵中，pH>7.5時(shí)，菌體易積累谷氨酰胺；pH<6.0時(shí)，可能積累α-酮戊二酸）；④產(chǎn)物穩(wěn)定性：部分氨基酸在極端pH下易分解（如精氨酸在pH>9.0時(shí)易脫氨）。控制方法：-基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)：通過添加緩沖物質(zhì)（如磷酸鹽，濃度0.1-0.2mol/L）維持pH穩(wěn)定；-流加調(diào)節(jié)：發(fā)酵過程中根據(jù)pH變化流加酸（如H2SO4）或堿（如氨水、NaOH）。例如谷氨酸發(fā)酵中，前期（0-12h）菌體生長需消耗銨離子，pH上升，需流加H2SO4維持pH7.0-7.2；中后期（12h后）谷氨酸合成需大量銨離子（作為氨基供體），流加氨水（既調(diào)節(jié)pH又補(bǔ)充氮源），維持pH7.2-7.5；-代謝調(diào)控：通過控制碳氮比間接調(diào)節(jié)pH（如氮源過量時(shí)，銨離子積累導(dǎo)致pH上升；碳源過量時(shí)，有機(jī)酸積累導(dǎo)致pH下降）。（5）簡述溶解氧（DO）對谷氨酸發(fā)酵的影響及控制策略。谷氨酸發(fā)酵為好氧過程，DO直接影響菌體呼吸和代謝：①DO過低（<10%飽和濃度）：-菌體轉(zhuǎn)為厭氧代謝，產(chǎn)生乳酸、琥珀酸等副產(chǎn)物，消耗葡萄糖但不合成谷氨酸；-關(guān)鍵酶（如檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶）活性下降，三羧酸循環(huán)（TCA）受阻，α-酮戊二酸積累不足（谷氨酸前體）；-細(xì)胞膜通透性因能量不足（ATP合成減少）而下降，谷氨酸分泌受阻。②DO過高（>50%飽和濃度）：-過度氧化導(dǎo)致葡萄糖大量消耗于菌體生長（而非產(chǎn)物合成），產(chǎn)酸率降低；-高溶氧可能引發(fā)活性氧（ROS）積累，損傷菌體細(xì)胞?？刂撇呗裕?前期（0-8h）：菌體生長階段，需較高DO（30%-40%）以滿足繁殖需求，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速（200-300rpm）或通氣量（0.8-1.0vvm）維持；-中期（8-24h）：谷氨酸合成階段，DO需維持在20%-30%（既能保證TCA循環(huán)正常進(jìn)行，又避免過度氧化），可通過降低攪拌轉(zhuǎn)速（150-200rpm）或調(diào)整通氣量（0.6-0.8vvm）控制；-后期（24h后）：菌體代謝減緩，DO可降至15%-20%，減少能耗；-異常情況處理：若因設(shè)備故障導(dǎo)致DO驟降，需立即停止補(bǔ)糖（避免厭氧代謝加?。?，待DO恢復(fù)后逐步恢復(fù)補(bǔ)料。3.論述題（1）以谷氨酸發(fā)酵為例，論述代謝控制發(fā)酵的關(guān)鍵策略。代謝控制發(fā)酵的核心是通過人工干預(yù)打破微生物的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，使代謝流定向積累目標(biāo)產(chǎn)物。以谷氨酸發(fā)酵（目標(biāo)產(chǎn)物為L-谷氨酸）為例，關(guān)鍵策略包括：①切斷旁路代謝：野生型谷氨酸棒桿菌的代謝途徑中，α-酮戊二酸（谷氨酸前體）可通過TCA循環(huán)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為琥珀酸、蘋果酸等。通過選育三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶缺陷型菌株（如琥珀酸脫氫酶缺陷株），阻斷α-酮戊二酸向琥珀酸的轉(zhuǎn)化，使代謝流集中向谷氨酸合成方向流動。②解除反饋抑制與阻遏：谷氨酸對其合成途徑的關(guān)鍵酶（如谷氨酸脫氫酶GDH、檸檬酸合酶CS）存在反饋抑制，同時(shí)谷氨酸過量會阻遏這些酶的合成。通過誘變選育抗反饋抑制突變株（如GDH的變構(gòu)位點(diǎn)突變，無法與谷氨酸結(jié)合）或組成型突變株（酶的合成不受谷氨酸調(diào)控），解除反饋抑制和阻遏。例如，選育對谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物（如谷氨酸羥肟酸）抗性的菌株，其GDH對谷氨酸不敏感。③控制細(xì)胞膜通透性：谷氨酸需分泌到胞外才能避免胞內(nèi)積累引起的反饋抑制。通過控制生物素亞適量（5-10μg/L），抑制細(xì)胞膜磷脂合成（生物素是乙酰輔酶A羧化酶的輔酶，參與脂肪酸合成），導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)不完整，通透性增加。此外，添加青霉素（抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成，間接增加膜通透性）或表面活性劑（如吐溫-60，破壞膜脂結(jié)構(gòu)）也可促進(jìn)谷氨酸分泌。④平衡碳氮比與前體供應(yīng)：谷氨酸合成需要大量碳源（葡萄糖）和氮源（銨離子）。碳源不足時(shí)，菌體生長受限；碳源過量則導(dǎo)致有機(jī)酸積累（如乳酸）。氮源不足時(shí)，氨基供體（NH4+）缺乏，谷氨酸合成受阻；氮源過量會導(dǎo)致pH上升，菌體轉(zhuǎn)向合成谷氨酰胺。通常控制初始葡萄糖濃度120-140g/L，流加氨水維持pH7.2-7.5，同時(shí)補(bǔ)充KH2PO4（0.5-1.0g/L）作為磷源（參與ATP合成）。⑤優(yōu)化發(fā)酵條件：溫度控制（前期30-32℃促進(jìn)生長，中后期34-36℃促進(jìn)產(chǎn)酸）；溶解氧維持20%-30%（保證TCA循環(huán)正常進(jìn)行，同時(shí)避免過度氧化）；pH通過流加氨水調(diào)節(jié)（既補(bǔ)氮又調(diào)pH）。例如，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時(shí)，開始流加葡萄糖（500g/L溶液），維持殘?zhí)?-5g/L，避免碳源饑餓或過量。通過以上策略的綜合應(yīng)用，谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率可從野生株的不足5g/L提升至150g/L以上（現(xiàn)代高產(chǎn)菌株），糖酸轉(zhuǎn)化率超過60%。（2）從菌種選育、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)、發(fā)酵過程控制三方面論述提高蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的技術(shù)路徑。蘇氨酸是含硫氨基酸，生物合成途徑為天冬氨酸→天冬氨酸半醛→高絲氨酸→蘇氨酸，關(guān)鍵酶為天冬氨酸激酶（AK）、高絲氨酸脫氫酶（HD）、蘇氨酸合酶（TS）。野生型菌株中，蘇氨酸對AK存在反饋抑制（與賴氨酸協(xié)同抑制），且高絲氨酸脫氫酶受蘇氨酸反饋抑制。提高產(chǎn)量的技術(shù)路徑如下：①菌種選育：-解除協(xié)同反饋抑制：選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株（如對α-氨基-β-羥基戊酸（AHV）抗性的菌株，AHV是蘇氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，能模擬其反饋抑制作用，抗性菌株的AK對蘇氨酸不敏感）；-切斷旁路代謝：選育甲硫氨酸缺陷型菌株（met?），阻斷高絲氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化（高絲氨酸→胱硫醚→甲硫氨酸），使代謝流集中向蘇氨酸合成；-增強(qiáng)關(guān)鍵酶活性：通過基因工程過表達(dá)AK（解除抑制的突變體）、HD（解除蘇氨酸反饋抑制的突變體）和TS（野生型或高效突變體），例如將AK基因（lysC）的Thr352→Ile突變（解除蘇氨酸抑制）、HD基因（hom）的Leu197→Phe突變（解除蘇氨酸抑制）克隆到質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化宿主菌（如大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌）；-阻斷蘇氨酸分解途徑：敲除蘇氨酸脫氨酶（tdcB）基因，防止蘇氨酸分解為α-酮丁酸。②培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：-碳源：選用葡萄糖（最適濃度80-100g/L）或蔗糖（需添加蔗糖酶），避免使用乳糖（誘導(dǎo)成本高）；-氮源：有機(jī)氮（酵母粉5-10g/L）提供生長因子，無機(jī)氮（硫酸銨20-30g/L）提供氨基，流加氨水調(diào)節(jié)pH；-生長因子：添加維生素B1（10mg/L）、生物素（0.1mg/L）促進(jìn)菌體生長；-前體物質(zhì)：添加天冬氨酸（2-5g/L）或高絲氨酸（1-2g/L），繞過限速步驟（天冬氨酸→天冬氨酸半醛為限速步驟，受AK活性限制）；-無機(jī)鹽：KH2PO42-3g/L（提供磷源），MgSO4·7H2O0.5-1.0g/L（激活酶活性），F(xiàn)eSO4·7H2O0.01-0.02g/L（參與電子傳遞）。③發(fā)酵過程控制：-溫度：前期（0-12h）30℃促進(jìn)菌體生長（OD600達(dá)10-15），中后期（12h后）升溫至33-35℃（TS最適溫度）促進(jìn)蘇氨酸合成；-pH：維持6.8-7.2（AK最適pH7.0），通過流加氨水（25%濃度）調(diào)節(jié)，同時(shí)補(bǔ)充氮源；-溶解氧：前期（0-8h）DO>30%（200rpm，1.0vvm）保證菌體增殖，中后期DO維持20%-25%（降低攪拌至150rpm，0.8vvm），避免過度氧化（蘇氨酸合成需適量還原力NADPH）；-補(bǔ)料策略：采用分批補(bǔ)料，當(dāng)殘?zhí)堑陀?g/L時(shí)，流加400g/L葡萄糖溶液，維持殘?zhí)?-5g/L；同時(shí)流加硫酸銨溶液（100g/L），維持氨氮濃度0.5-1.0g/L（避免過量抑制AK活性）；-誘導(dǎo)控制（若用誘導(dǎo)型啟動子）：在OD600達(dá)20時(shí)添加IPTG（0.1mmol/L）誘導(dǎo)目的基因表達(dá)（適用于大腸桿菌工程菌）。通過以上技術(shù)的整合，蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)量可從傳統(tǒng)菌株的30-40g/L提升至100-120g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率超過50%。4.計(jì)算題（1）某谷氨酸發(fā)酵罐體積為50m3（有效體積40m3），初始葡萄糖濃度120g/L，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)?g/L，谷氨酸產(chǎn)量150g/L。計(jì)算：①葡萄糖總消耗量（kg）；②糖酸轉(zhuǎn)化率（%）；③若發(fā)酵周期為32h，計(jì)算體積產(chǎn)率（g/L·h）。解：①葡萄糖總消耗量=有效體積×(初始濃度-殘?zhí)菨舛?=40m3×(120g/L-5g/L)=40×1000L×115g/L=4,600,000g=4600kg；②糖酸轉(zhuǎn)化率=(谷氨酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗量)×100%=(150g/L)/(120g/L-5g/L)×100%=150/115×100%≈130.4%（注：實(shí)際中因葡萄糖部分用于菌體生長和維持，轉(zhuǎn)化率通常為50%-60%，此處假設(shè)為理論值）；③體積產(chǎn)率=谷氨酸產(chǎn)量/發(fā)酵周期=150g/L/32h≈4.69g/L·h。