RNAi技術(shù)沉默VEGF-C基因?qū)θ税螂装㏕24細(xì)胞的影響探究一、引言1.1研究背景與意義膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年全球范圍內(nèi)新確診的膀胱癌病例數(shù)高達(dá)80萬例，中國亦是膀胱癌發(fā)生率較高的國家之一。膀胱癌不僅發(fā)病率高，其死亡率也不容小覷，給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。早期膀胱癌患者，尤其是非肌層浸潤性膀胱癌，通過手術(shù)切除并配合膀胱灌注治療，有較大概率實(shí)現(xiàn)臨床治愈，對(duì)患者壽命影響較小。然而，對(duì)于肌層浸潤性膀胱癌患者，即便接受了根治性膀胱切除術(shù)，仍有高達(dá)50%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為36%-54%。而對(duì)于T3、T4和（或）N+MO的膀胱癌高?；颊撸?年生存率更是低至25%-35%。膀胱癌的危害不僅僅體現(xiàn)在對(duì)患者生命的威脅上，還對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了極大的負(fù)面影響。隨著腫瘤的生長，患者可能會(huì)感到膀胱區(qū)域疼痛，尤其是在排尿時(shí)，這種疼痛會(huì)隨著病情的進(jìn)展而加劇。膀胱癌還可能導(dǎo)致尿液中帶血，即血尿，出血量從輕微到嚴(yán)重不等，嚴(yán)重時(shí)甚至可能引發(fā)貧血。患者還會(huì)出現(xiàn)排尿困難的癥狀，包括尿頻、尿急或尿流弱等，這些癥狀嚴(yán)重干擾了患者的日常生活，導(dǎo)致其生活質(zhì)量大幅下降。目前，膀胱癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療以及免疫治療等。手術(shù)治療是早期膀胱癌的主要治療手段，但對(duì)于晚期膀胱癌，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熾m然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，這些副作用不僅影響患者的身體狀況，還會(huì)對(duì)患者的心理造成極大的壓力，降低患者的治療依從性。放療則存在對(duì)周圍正常組織損傷較大的問題，且對(duì)于一些對(duì)放療不敏感的腫瘤細(xì)胞，放療效果并不理想。免疫治療作為一種新興的治療方法，雖然在部分患者中取得了一定的療效，但由于其高昂的治療費(fèi)用和個(gè)體差異導(dǎo)致的療效不確定性，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種更加有效、安全的治療方法，成為了膀胱癌治療領(lǐng)域亟待解決的問題。血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）作為一種重要的信號(hào)分子，在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。研究表明，VEGF-C能夠促進(jìn)膀胱腫瘤的血管生成和淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。在腫瘤的生長過程中，新生血管的形成是腫瘤細(xì)胞獲取營養(yǎng)和氧氣的關(guān)鍵，VEGF-C通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。VEGF-C還能夠促進(jìn)淋巴管生成，使腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。臨床研究也表明，VEGF-C在膀胱癌的分子病理學(xué)診斷和預(yù)后判斷中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。高表達(dá)VEGF-C的膀胱癌患者，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后往往較差。因此，VEGF-C成為了膀胱癌治療的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種高效、特異性的基因沉默技術(shù)，為膀胱癌的治療研究帶來了新的希望。RNAi技術(shù)通過體外合成特定的小分子RNA（如siRNA、miRNA等），將其導(dǎo)入細(xì)胞中，能夠特異性地抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的沉默或減少其表達(dá)量。該技術(shù)具有高效性、特異性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確地作用于目標(biāo)基因，而對(duì)其他基因的表達(dá)影響較小，為研究基因功能和開發(fā)靶向治療藥物提供了有力的工具。在腫瘤治療領(lǐng)域，RNAi技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于針對(duì)各種腫瘤相關(guān)基因的研究，通過抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的目的。利用RNAi技術(shù)沉默VEGF-C基因的表達(dá)，有望成為治療膀胱癌的一種新策略。通過抑制VEGF-C的表達(dá)，可以阻斷其對(duì)血管生成和淋巴管生成的促進(jìn)作用，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為膀胱癌患者提供一種更加有效的治療方法。深入研究RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)的具體機(jī)制和效果，對(duì)于推動(dòng)膀胱癌的治療研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀RNAi技術(shù)自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，在國內(nèi)外均得到了廣泛而深入的研究。在國外，眾多科研團(tuán)隊(duì)積極探索RNAi的作用機(jī)制，如美國馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的研究人員深入剖析了RNAi過程中雙鏈RNA（dsRNA）被DICER酶切割成小干擾RNA（siRNA），以及siRNA納入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）并降解目標(biāo)mRNA的詳細(xì)分子機(jī)制，為RNAi技術(shù)的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在應(yīng)用研究方面，RNAi技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。美國的一些研究機(jī)構(gòu)利用RNAi技術(shù)針對(duì)乳腺癌、肺癌等多種腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行沉默研究，通過抑制腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵致癌基因的表達(dá)，有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在臨床試驗(yàn)方面，RNAi藥物的研發(fā)取得了顯著進(jìn)展。2018年，全球首個(gè)siRNA藥物Patisiran獲FDA批準(zhǔn)上市，用于治療遺傳性ATTR淀粉樣變性，這標(biāo)志著RNAi技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室研究邁向臨床應(yīng)用的重要里程碑。此后，更多基于RNAi的藥物處于臨床試驗(yàn)階段，涵蓋了從罕見病到常見慢性病的眾多治療領(lǐng)域。在國內(nèi)，RNAi技術(shù)同樣受到高度關(guān)注。國內(nèi)的科研團(tuán)隊(duì)在RNAi的作用機(jī)制研究上也取得了一定成果，對(duì)RNAi在植物、動(dòng)物和人類細(xì)胞中的作用方式和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入探討。在應(yīng)用研究方面，國內(nèi)研究人員將RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療研究，尤其是在腫瘤治療領(lǐng)域。利用RNAi技術(shù)沉默肝癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)基因，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為腫瘤的治療提供了新的思路和方法。國內(nèi)的生物技術(shù)公司也在積極布局RNAi技術(shù)平臺(tái)和管線臨床開發(fā)進(jìn)度，加速RNAi藥物的研發(fā)進(jìn)程。關(guān)于VEGF-C基因與膀胱癌的關(guān)系，國內(nèi)外研究也取得了豐富成果。國外研究表明，VEGF-C在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。VEGF-C能夠促進(jìn)膀胱腫瘤的血管生成和淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。通過對(duì)膀胱癌患者的臨床樣本分析，發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，VEGF-C高表達(dá)的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。國內(nèi)的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，通過對(duì)大量膀胱癌患者的臨床數(shù)據(jù)和病理標(biāo)本進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確了VEGF-C在膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，為膀胱癌的診斷和治療提供了重要的理論依據(jù)。中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆教授團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌相關(guān)基因2（BLACAT2）能夠激活VEGF-C啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移，同時(shí)證明，BLACAT2過表達(dá)的患者對(duì)VEGF-C單抗治療效果更好。盡管國內(nèi)外在RNAi技術(shù)應(yīng)用及VEGF-C基因與膀胱癌關(guān)系方面取得了眾多成果，但仍存在一些不足。在RNAi技術(shù)應(yīng)用于膀胱癌治療的研究中，如何提高siRNA的遞送效率和穩(wěn)定性，降低其脫靶效應(yīng)，仍然是亟待解決的問題。目前的遞送系統(tǒng)在將siRNA高效、安全地導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞方面還存在一定的局限性，導(dǎo)致RNAi技術(shù)在膀胱癌治療中的效果難以充分發(fā)揮。對(duì)于VEGF-C基因在膀胱癌中的調(diào)控機(jī)制，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但仍有許多未知之處。VEGF-C的上游調(diào)控因子以及其與其他信號(hào)通路的相互作用機(jī)制尚未完全明確，這限制了針對(duì)VEGF-C的靶向治療的進(jìn)一步發(fā)展。本研究將針對(duì)這些不足，深入探討RNAi沉默人膀胱癌T24細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)的具體效果和機(jī)制，旨在為膀胱癌的治療提供更有效的策略和理論支持。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過RNAi技術(shù)沉默人膀胱癌T24細(xì)胞中的VEGF-C基因，深入探究其對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為膀胱癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：構(gòu)建VEGF-C基因特異性siRNA表達(dá)載體：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)VEGF-C基因的特異性siRNA序列，將其連接到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。通過酶切鑒定、測(cè)序等方法對(duì)重組載體進(jìn)行驗(yàn)證，確保其序列的準(zhǔn)確性和完整性。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等技術(shù)，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體導(dǎo)入人膀胱癌T24細(xì)胞中，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮RNAi作用，特異性地沉默VEGF-C基因的表達(dá)。檢測(cè)VEGF-C基因和蛋白表達(dá)水平：在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)人膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C基因mRNA的表達(dá)水平，通過分析Ct值等數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確評(píng)估基因沉默效果。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)VEGF-C蛋白的表達(dá)水平，通過對(duì)蛋白條帶的灰度分析，直觀地反映VEGF-C蛋白表達(dá)量的變化情況，從而確定RNAi對(duì)VEGF-C基因表達(dá)的抑制效果。分析對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法，在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，如24h、48h、72h等，對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞進(jìn)行增殖能力檢測(cè)。通過檢測(cè)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線，直觀地展示細(xì)胞增殖情況的變化，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響。運(yùn)用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷）細(xì)胞增殖檢測(cè)法，進(jìn)一步驗(yàn)證RNAi對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用，通過觀察EdU陽性細(xì)胞的比例，準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。探究對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響：使用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，在小室的上室接種轉(zhuǎn)染后的人膀胱癌T24細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定并染色遷移到下室的細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估RNAi對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響。采用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力，通過觀察穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響。進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)板上劃出劃痕，觀察轉(zhuǎn)染后的人膀胱癌T24細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)劃痕的愈合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證RNAi對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響。探討對(duì)膀胱癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)能力的影響：通過三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染后的人膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)在含有基質(zhì)膠等成分的三維培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞在三維環(huán)境下形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)能力的影響。利用免疫熒光染色等技術(shù)，對(duì)血管生成擬態(tài)相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，如CD31、PAS等，通過觀察標(biāo)志物的表達(dá)和分布情況，進(jìn)一步研究RNAi對(duì)膀胱癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)能力的作用機(jī)制。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1膀胱癌概述膀胱癌是一種發(fā)生在膀胱黏膜上皮的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)中最為常見的腫瘤疾病之一。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第9位，男性中的發(fā)病率更高，位列第4位，女性中則排第8位。膀胱癌在中老年人群中更為常見，且男性患者數(shù)量多于女性。膀胱癌的病理類型較為多樣，主要包括尿路上皮癌、鱗癌和腺癌。其中，尿路上皮癌最為常見，約占膀胱癌的90%以上。這種類型的膀胱癌患者生存期和生活質(zhì)量相對(duì)較好。而腺癌和鱗癌的惡性程度極高，預(yù)后情況較差，患者的生存期往往較為有限。根據(jù)腫瘤浸潤膀胱壁的深度，膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。非肌層浸潤性膀胱癌，也被稱為表淺性膀胱癌，腫瘤主要局限在膀胱黏膜層和黏膜下層，尚未侵犯到肌層，此時(shí)病情相對(duì)較輕，治療效果通常較好。肌層浸潤性膀胱癌則表示腫瘤已經(jīng)侵犯到膀胱肌層，病情更為嚴(yán)重，治療難度也相應(yīng)增加，晚期還可能浸潤至膀胱周圍組織并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡病質(zhì)。關(guān)于膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。外在因素方面，吸煙是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。香煙中含有的尼古丁等有害物質(zhì)，會(huì)直接刺激膀胱的尿路上皮，長期積累可能引發(fā)細(xì)胞的異常增殖和分化，從而導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生。有研究表明，吸煙人群患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)比不吸煙人群高出數(shù)倍。職業(yè)及化學(xué)因素也不容忽視，長期接觸某些化學(xué)物品，如含苯的化學(xué)制品，會(huì)增加患膀胱癌的幾率。經(jīng)常染發(fā)的人群，由于染發(fā)劑中可能含有致癌化學(xué)物質(zhì)，也會(huì)使膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升。慢性膀胱炎并發(fā)膀胱結(jié)石也是膀胱癌的一個(gè)誘發(fā)因素，長期的炎癥刺激和結(jié)石的摩擦，會(huì)對(duì)膀胱黏膜造成損傷，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的癌變。內(nèi)在因素方面，遺傳因素在膀胱癌的發(fā)生中起到一定作用。某些基因突變或遺傳易感性，會(huì)使個(gè)體更容易患上膀胱癌。研究發(fā)現(xiàn)，一些家族中存在特定的基因突變，這些家族成員患膀胱癌的概率明顯高于普通人群。膀胱癌最常見的臨床癥狀是無痛性血尿，患者通常在沒有明顯疼痛的情況下，尿液中出現(xiàn)血液，這是膀胱癌的一個(gè)重要警示信號(hào)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有肉眼血尿的患者中，罹患膀胱腫瘤的概率為25%。除了血尿，患者還可能出現(xiàn)尿頻、尿急、尿痛等膀胱刺激癥狀，以及腰痛，這通常是由于輸尿管梗阻引起的。當(dāng)疾病進(jìn)展并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移部位的相應(yīng)癥狀，如轉(zhuǎn)移到肺部會(huì)出現(xiàn)咳嗽、咯血等癥狀，轉(zhuǎn)移到骨骼會(huì)引起骨痛等。在診斷方面，膀胱癌的診斷方法較為多樣。醫(yī)生首先會(huì)詳細(xì)詢問患者的癥狀和病史，了解患者是否有吸煙史、職業(yè)接觸史等可能的危險(xiǎn)因素。接著會(huì)進(jìn)行體格檢查，雖然體格檢查對(duì)于早期膀胱癌的診斷價(jià)值有限，但對(duì)于晚期患者，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)腹部腫塊、淋巴結(jié)腫大等異常體征。實(shí)驗(yàn)室檢查也是重要的診斷手段之一，其中尿常規(guī)檢查可以檢測(cè)尿液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等指標(biāo)，若發(fā)現(xiàn)血尿，需要進(jìn)一步排查膀胱癌的可能。尿細(xì)胞學(xué)檢查則通過檢測(cè)尿液中的癌細(xì)胞，對(duì)膀胱癌的診斷具有一定的輔助作用，但該方法的敏感性較低，對(duì)于低級(jí)別膀胱癌的診斷效果不佳。影像學(xué)檢查在膀胱癌的診斷中起著關(guān)鍵作用，超聲檢查是一種常用的無創(chuàng)檢查方法，可以初步觀察膀胱內(nèi)是否有占位性病變，判斷腫瘤的大小、位置等信息。CT檢查和MRI檢查能夠更清晰地顯示腫瘤的形態(tài)、侵犯范圍以及與周圍組織的關(guān)系，對(duì)于膀胱癌的分期診斷具有重要價(jià)值。膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，通過膀胱鏡，醫(yī)生可以直接觀察膀胱內(nèi)的病變情況，并取組織進(jìn)行病理活檢，明確腫瘤的病理類型和分級(jí)，為后續(xù)的治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)。膀胱癌的治療方式主要取決于腫瘤的病理分級(jí)及侵入膀胱壁的深度。對(duì)于非肌層浸潤性膀胱癌，首選的治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，通過尿道插入電切鏡，將膀胱內(nèi)的腫瘤組織切除。術(shù)后通常還需要進(jìn)行膀胱灌注化療，將化療藥物直接注入膀胱內(nèi)，以殺死殘留的癌細(xì)胞，降低腫瘤的復(fù)發(fā)率。對(duì)于肌層浸潤性膀胱癌，根治性膀胱切除術(shù)加尿路改道手術(shù)是主要的治療方法。根治性膀胱切除術(shù)需要切除整個(gè)膀胱、前列腺（男性）或子宮、卵巢（女性）等周圍組織，以徹底清除腫瘤。由于膀胱被切除，患者需要進(jìn)行尿路改道，常見的方法有回腸膀胱術(shù)、原位新膀胱術(shù)等，這些方法旨在重建患者的排尿功能。對(duì)于轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者，由于腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到身體其他部位，單純的手術(shù)治療效果不佳，通常需要采用化療或免疫治療等綜合療法。化療藥物可以通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處，殺死癌細(xì)胞，但化療也會(huì)帶來一系列副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，具有較好的療效和較低的副作用，但目前免疫治療的費(fèi)用較高，且并非所有患者都能從中受益。放射治療一般配合術(shù)前、術(shù)后進(jìn)行，對(duì)于晚期失去手術(shù)時(shí)機(jī)或拒絕手術(shù)，以及術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，姑息性放療可以在一定程度上緩解癥狀，延長患者的生存期。2.2人膀胱癌T24細(xì)胞特性人膀胱癌T24細(xì)胞源自一位81歲白人女性患者的膀胱移行細(xì)胞癌組織，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長的特性。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，T24細(xì)胞對(duì)生長環(huán)境有特定的要求，其適宜的培養(yǎng)基為McCoy's5A培養(yǎng)基，同時(shí)需添加10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%的雙抗，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和防止微生物污染。培養(yǎng)條件為氣相中空氣占95%、二氧化碳占5%，溫度保持在37℃，培養(yǎng)箱濕度維持在70%-80%。在這樣的培養(yǎng)條件下，T24細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為19小時(shí)。此外，T24細(xì)胞還含有ras（H-ras）癌基因，這可能與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。T24細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，在合適的培養(yǎng)條件下能夠快速生長。研究表明，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，需要及時(shí)進(jìn)行傳代處理，以維持細(xì)胞的正常生長狀態(tài)。一般推薦的傳代比例為1:2-1:4，每周換液2-3次。在傳代過程中，需要注意操作的規(guī)范性，以避免對(duì)細(xì)胞造成損傷。首先，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按合適的比例分到新的培養(yǎng)瓶中，添加按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞的生長活力。在致瘤性方面，T24細(xì)胞在倉鼠頰囊中具有致瘤性，能夠形成腫瘤組織。然而，在裸鼠中，T24細(xì)胞不具有致瘤性。這一特性使得T24細(xì)胞在研究腫瘤發(fā)生機(jī)制和抗腫瘤藥物篩選等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過在倉鼠頰囊中接種T24細(xì)胞，可以觀察腫瘤的生長過程，研究腫瘤細(xì)胞與宿主組織之間的相互作用，以及探討腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制等。而在裸鼠模型中，由于T24細(xì)胞不致瘤，可以作為對(duì)照，用于研究其他因素對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，或者用于評(píng)估抗腫瘤藥物對(duì)T24細(xì)胞的抑制作用，排除裸鼠自身免疫系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。此外，T24細(xì)胞還表達(dá)腫瘤特有抗原，以及HLAA1、A3、B18、Bw35、Cw4、DRw2、Dw4等抗原，這些抗原的表達(dá)與細(xì)胞的免疫原性和腫瘤的免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究膀胱癌的免疫治療提供了重要的靶點(diǎn)和研究基礎(chǔ)。2.3VEGF-C基因及其在膀胱癌中的作用VEGF-C基因位于人類染色體4q34，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。其編碼的VEGF-C蛋白最初以相對(duì)分子質(zhì)量為41-46kD的前體蛋白形式存在，經(jīng)過蛋白水解酶裂解后，形成相對(duì)分子質(zhì)量為21-23kD的成熟蛋白。VEGF-C蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)VEGF同源結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。其中，VEGF同源結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)域，它能夠與血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）和血管內(nèi)皮生長因子受體-3（VEGFR-3）特異性結(jié)合，從而激活下游信號(hào)通路。VEGF-C是一種重要的促血管生成和促淋巴管生成因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在生理狀態(tài)下，VEGF-C主要參與胚胎發(fā)育過程中淋巴管的形成和維持成人淋巴管的正常功能。在胚胎發(fā)育時(shí)期，VEGF-C與其特異性受體VEGFR-3結(jié)合，激活下游的PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而引導(dǎo)淋巴管的生成和發(fā)育。在成人機(jī)體中，VEGF-C也參與了一些生理過程，如傷口愈合、組織修復(fù)等。在傷口愈合過程中，受損組織會(huì)釋放VEGF-C，促進(jìn)血管和淋巴管的新生，為組織修復(fù)提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF-C的作用更為顯著。腫瘤細(xì)胞能夠大量分泌VEGF-C，通過自分泌和旁分泌方式發(fā)揮作用。一方面，VEGF-C與腫瘤細(xì)胞表面的VEGFR-2結(jié)合，激活下游的ERK1/2和PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。另一方面，VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3結(jié)合，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤淋巴管生成。腫瘤淋巴管生成后，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴循環(huán)提供了通道，增加了腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。腫瘤細(xì)胞還可以通過分泌VEGF-C，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在膀胱癌中，VEGF-C同樣發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，VEGF-C在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織，且其表達(dá)水平與膀胱癌的分期、分級(jí)密切相關(guān)。隨著膀胱癌分期的升高，即腫瘤浸潤深度的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，VEGF-C的表達(dá)水平也顯著升高。在高級(jí)別膀胱癌中，VEGF-C的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膀胱癌。這表明VEGF-C的高表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱癌的進(jìn)展。VEGF-C在膀胱癌血管生成和淋巴轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在血管生成方面，VEGF-C通過與VEGFR-2結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)膀胱癌的血管生成。新生的血管為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，促進(jìn)了腫瘤的生長。在淋巴轉(zhuǎn)移方面，VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，導(dǎo)致腫瘤淋巴管生成增加。腫瘤淋巴管的增多使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。有研究通過對(duì)膀胱癌患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達(dá)的患者，其腫瘤組織中的淋巴管密度明顯增加，且更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。VEGF-C的表達(dá)水平與膀胱癌患者的預(yù)后也密切相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究表明，VEGF-C高表達(dá)的膀胱癌患者，其無病生存期和總生存期明顯縮短，預(yù)后較差。有研究對(duì)100例膀胱癌患者進(jìn)行了長期隨訪，發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于VEGF-C低表達(dá)組患者。這表明VEGF-C可以作為評(píng)估膀胱癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。此外，VEGF-C還可能成為膀胱癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。通過抑制VEGF-C的表達(dá)或阻斷其信號(hào)通路，有望抑制膀胱癌的血管生成、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤生長，從而改善患者的預(yù)后。2.4RNAi技術(shù)原理與應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的，通過特異性降解靶基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行有效調(diào)控的重要技術(shù)，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（PTGS）的范疇。其作用機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和生物分子的參與。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)dsRNA時(shí)，Dicer酶，一種具有RNaseⅢ樣活性的核酸酶，會(huì)迅速識(shí)別并與之結(jié)合。Dicer酶利用自身的解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域，將dsRNA精確地加工裂解，形成長度約為21-25nt的干擾性小dsRNA，即siRNA。siRNA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，其序列與所作用的靶mRNA序列具有高度同源性，兩條單鏈末端分別為5′端磷酸和3′端羥基，并且每條單鏈的3′端均有2-3個(gè)突出的非配對(duì)堿基。這些結(jié)構(gòu)特征對(duì)于siRNA后續(xù)發(fā)揮作用至關(guān)重要。生成的siRNA會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）相結(jié)合。在結(jié)合過程中，siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)逐漸解旋，形成單鏈狀態(tài)。此時(shí)，活化的RISC在已成單鏈的siRNA引導(dǎo)下，憑借堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并特異性地結(jié)合到靶mRNA上。一旦RISC與靶mRNA結(jié)合，其內(nèi)在的核酸酶活性就會(huì)被激活，進(jìn)而對(duì)靶mRNA進(jìn)行高效、特異性的切割，使其降解。這樣一來，靶基因就無法順利翻譯為蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的沉默，阻斷了相應(yīng)基因的功能。RNAi技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。眾多癌基因的激活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的根本原因之一，因此各種癌基因都成為了腫瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)。利用基因家族中多個(gè)基因具有同一段同源性很高的保守序列這一特性，研究人員能夠針對(duì)這一區(qū)段序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA。通過體外合成或構(gòu)建在體內(nèi)表達(dá)siRNA的載體的方法，將其轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中，就可以特異性地封閉這些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而不會(huì)影響其他基因的正常表達(dá)。在乳腺癌的研究中，通過RNAi技術(shù)沉默與乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，如HER2基因，能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力。在肺癌的研究中，針對(duì)KRAS基因突變的肺癌細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)沉默KRAS基因，能夠有效降低癌細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。RNAi技術(shù)在其他領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。在疾病治療領(lǐng)域，除了腫瘤，RNAi技術(shù)還被用于治療各種遺傳病和病毒感染性疾病。對(duì)于一些單基因遺傳病，如囊性纖維化、亨廷頓舞蹈癥等，通過RNAi技術(shù)沉默突變基因，有望為患者提供有效的治療方法。在病毒感染性疾病方面，針對(duì)乙肝病毒、丙肝病毒等，利用RNAi技術(shù)靶向病毒的關(guān)鍵基因，能夠抑制病毒的復(fù)制和傳播。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，RNAi技術(shù)可用于改良農(nóng)作物，提高其產(chǎn)量和抗病能力。通過沉默植物中的特定基因，使農(nóng)作物對(duì)病蟲害產(chǎn)生抗性，減少農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染。還可以利用RNAi技術(shù)調(diào)控植物的生長發(fā)育，改善農(nóng)作物的品質(zhì)。在生物材料研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)有助于研究生物材料的合成，探索新材料的設(shè)計(jì)理念，優(yōu)化生物材料的性能。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，RNAi技術(shù)可以用于獲取特定的干細(xì)胞亞型，調(diào)控干細(xì)胞的增殖和分化，實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的精準(zhǔn)應(yīng)用。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人膀胱癌T24細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞株源自一位81歲白人女性患者的膀胱移行細(xì)胞癌組織，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長特性，含有ras（H-ras）癌基因，在腫瘤研究中應(yīng)用廣泛。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。裸鼠無胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異體移植的腫瘤組織不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，是研究腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及藥物治療效果的理想動(dòng)物模型。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。主要試劑：McCoy's5A培養(yǎng)基：購自Gibco公司，貨號(hào)為16600-082，是一種適合多種細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠?yàn)門24細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境。優(yōu)質(zhì)胎牛血清：來源于Gibco公司，貨號(hào)為10099-141，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，能夠滿足T24細(xì)胞的生長需求。雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）：由Solarbio公司生產(chǎn)，貨號(hào)為P1400，青霉素和鏈霉素分別具有抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成和蛋白質(zhì)合成的作用，在培養(yǎng)基中添加1%的雙抗，可有效防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境。胰蛋白酶-EDTA消化液：來自Solarbio公司，貨號(hào)為T1003，其中胰蛋白酶能夠水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，EDTA則可螯合細(xì)胞外的鈣離子和鎂離子，增強(qiáng)胰蛋白酶的消化作用，常用于細(xì)胞的傳代和消化。TRIzol試劑：購自Invitrogen公司，貨號(hào)為15596026，是一種新型總RNA抽提試劑，能夠快速、高效地從細(xì)胞或組織中提取總RNA，其主要成分包括苯酚、異硫氰酸胍等，可有效裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并保護(hù)RNA不被降解。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：由TaKaRa公司提供，貨號(hào)為RR047A，包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等成分，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒：同樣購自TaKaRa公司，貨號(hào)為RR820A，含有高保真DNA聚合酶、熒光染料、dNTP等試劑，能夠在PCR擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，從而準(zhǔn)確地定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平。兔抗人VEGF-C多克隆抗體：由Abcam公司生產(chǎn)，貨號(hào)為ab46154，可特異性地識(shí)別并結(jié)合人VEGF-C蛋白，用于Westernblot等實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)VEGF-C蛋白的表達(dá)。羊抗兔IgG-HRP二抗：購自Proteintech公司，貨號(hào)為SA00001-2，能夠與兔抗人VEGF-C多克隆抗體結(jié)合，并通過HRP催化底物顯色，用于增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）：由Dojindo公司提供，貨號(hào)為CK04，其主要成分是WST-8，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，WST-8能夠被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，可用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。Transwell小室：購自Corning公司，貨號(hào)為3422，由上室和下室組成，上室底部有一層聚碳酸酯膜，可用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。在遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可通過膜上的小孔從一側(cè)遷移到另一側(cè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，膜上預(yù)先包被有Matrigel基質(zhì)膠，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過膜，從而檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠：來源于Corning公司，貨號(hào)為356234，是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的基底膜基質(zhì)，主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和生長因子等，可模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)。EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒：由RiboBio公司提供，貨號(hào)為C10310，EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱：型號(hào)為ThermoForma3111，購自ThermoFisherScientific公司，能夠提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（70%-80%）和CO?濃度（5%），為細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境。超凈工作臺(tái)：品牌為蘇凈安泰，型號(hào)為SW-CJ-2FD，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個(gè)無菌的操作空間，用于細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)操作，防止實(shí)驗(yàn)過程中的污染。倒置顯微鏡：由Olympus公司生產(chǎn)，型號(hào)為IX73，可用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過倒置顯微鏡可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化。高速冷凍離心機(jī)：品牌為Eppendorf，型號(hào)為5424R，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,200rpm，可用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等生物樣品的離心分離，在RNA提取、蛋白質(zhì)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)中，用于分離和沉淀樣品。PCR儀：購自Bio-Rad公司，型號(hào)為T100，能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增，用于逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：同樣來自Bio-Rad公司，型號(hào)為CFX96，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)變化，準(zhǔn)確地定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀：品牌為ThermoFisherScientific，型號(hào)為MultiskanFC，可用于檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、CCK-8實(shí)驗(yàn)等中的吸光度值，通過測(cè)量吸光度值，可定量分析樣品中的目標(biāo)物質(zhì)含量或細(xì)胞的增殖活性。電泳儀：由Bio-Rad公司生產(chǎn)，型號(hào)為PowerPacBasic，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，用于分離不同分子量的蛋白質(zhì)。凝膠成像系統(tǒng)：品牌為Bio-Rad，型號(hào)為GelDocXR+，可對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行成像和分析，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸的條帶，在蛋白質(zhì)免疫印跡和PCR實(shí)驗(yàn)中，用于觀察和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人膀胱癌T24細(xì)胞株從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mLMcCoy's5A完全培養(yǎng)基（含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，加入1-2mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其完全脫落后吸出，在1000rpm條件下離心3-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，按1:2-1:4的比例將細(xì)胞懸液分到新的培養(yǎng)瓶中，添加新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為3組，分別為空白對(duì)照組（未進(jìn)行任何處理的T24細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的T24細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染針對(duì)VEGF-C基因的siRNA的T24細(xì)胞）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，定期更換培養(yǎng)基，保持細(xì)胞的良好生長環(huán)境。3.2.2RNAi載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染利用生物信息學(xué)軟件，針對(duì)人VEGF-C基因的mRNA序列（登錄號(hào)：NM_005429.5），設(shè)計(jì)3條特異性的siRNA序列，同時(shí)設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照siRNA序列（與任何已知基因均無同源性）。設(shè)計(jì)原則如下：siRNA序列長度為21-23nt，GC含量在35%-55%之間，避免選擇mRNA的5'和3'非編碼區(qū)以及起始密碼子附近的序列，以確保siRNA的特異性和有效性。將設(shè)計(jì)好的siRNA序列交由專業(yè)公司合成，合成后的siRNA為干粉狀，使用RNase-free水將其溶解至100μM的儲(chǔ)存濃度，保存于-80℃冰箱備用。選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，加入1mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的融合度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌EP管中分別加入5μLOpti-MEM培養(yǎng)基和1μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；在另一無菌EP管中，加入5μLOpti-MEM培養(yǎng)基和2μL濃度為100μM的siRNA（實(shí)驗(yàn)組加入針對(duì)VEGF-C基因的siRNA，陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照siRNA），輕輕混勻。然后，將含有Lipofectamine3000試劑的溶液加入到含有siRNA的溶液中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使siRNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。孵育完成后，將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞1-2次，加入500μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，再將siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物緩慢加入到孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入1mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），收集細(xì)胞，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法RT-PCR檢測(cè)VEGF-C基因mRNA表達(dá)：轉(zhuǎn)染后48h，使用TRIzol試劑提取各組T24細(xì)胞的總RNA。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用VEGF-C基因特異性引物和內(nèi)參基因GAPDH引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VEGF-C基因上游引物序列為5'-CCCAAGAAGATGACGAAGGA-3'，下游引物序列為5'-TGGCTTGGCTTGTAGGTGTC-3'；GAPDH基因上游引物序列為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游引物序列為5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10×PCR緩沖液2μL，dNTP混合物（2.5mM）1.6μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以VEGF-C基因條帶灰度值與內(nèi)參基因GAPDH條帶灰度值的比值表示VEGF-C基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。ELISA法檢測(cè)蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染后72h，收集各組T24細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先，用包被緩沖液將抗人VEGF-C抗體稀釋至適當(dāng)濃度，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜包被。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3分鐘。然后，加入封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。孵育結(jié)束后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清按照一定比例稀釋后，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白對(duì)照孔，37℃孵育1小時(shí)。孵育后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次。加入酶標(biāo)二抗，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次。加入底物溶液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20分鐘，待顯色明顯后，加入終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上，于450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品中VEGF-C蛋白的濃度。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將各組T24細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上，于490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室中加入200μL無血清培養(yǎng)基重懸的各組T24細(xì)胞（細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL），下室中加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室浸入甲醇中固定15分鐘，再用結(jié)晶紫染色15分鐘。用清水沖洗小室，晾干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前，先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室上室，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠在小室上室底部形成一層凝膠膜。然后，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的方法，將各組T24細(xì)胞接種到Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)穿過Matrigel基質(zhì)膠膜遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染后72h，收集各組T24細(xì)胞，用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞，將細(xì)胞分為4個(gè)象限：AnnexinV-FITC?/PI?為活細(xì)胞，AnnexinV-FITC?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC?/PI?為壞死細(xì)胞。計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，作為細(xì)胞凋亡率，分析RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1RNAi載體構(gòu)建結(jié)果將合成的針對(duì)VEGF-C基因的siRNA序列連接到表達(dá)載體后，進(jìn)行酶切鑒定。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對(duì)重組載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示。在凝膠上可以清晰地觀察到兩條條帶，一條為線性化載體片段，大小約為5000bp；另一條為插入的siRNA片段，大小約為200bp，與預(yù)期結(jié)果相符，初步證明重組載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)重組載體中插入的siRNA序列的準(zhǔn)確性，將酶切鑒定為陽性的重組載體送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示完全一致，表明成功構(gòu)建了針對(duì)VEGF-C基因的RNAi載體。這為后續(xù)轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)VEGF-C基因的沉默奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2VEGF-C基因和蛋白表達(dá)水平變化轉(zhuǎn)染后48h，采用RT-PCR檢測(cè)各組T24細(xì)胞中VEGF-C基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組VEGF-C基因mRNA表達(dá)量無明顯變化（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組VEGF-C基因mRNA表達(dá)量顯著下降（P<0.05），僅為空白對(duì)照組的30.5%，表明RNAi成功沉默了人膀胱癌T24細(xì)胞中的VEGF-C基因mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染后72h，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)各組T24細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-C蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組VEGF-C蛋白表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），而實(shí)驗(yàn)組VEGF-C蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.05），為空白對(duì)照組的25.8%。這進(jìn)一步驗(yàn)證了RNAi對(duì)VEGF-C蛋白表達(dá)的抑制作用，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，說明RNAi技術(shù)能夠有效降低人膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C基因和蛋白的表達(dá)水平。4.3對(duì)T24細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果如圖4所示。在24h時(shí)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OD值分別為0.356±0.021、0.348±0.023和0.342±0.020，三組之間無顯著差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至48h，空白對(duì)照組OD值增長至0.568±0.032，陰性對(duì)照組為0.556±0.030，而實(shí)驗(yàn)組僅為0.435±0.025，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。72h時(shí)，空白對(duì)照組OD值達(dá)到0.895±0.045，陰性對(duì)照組為0.872±0.042，實(shí)驗(yàn)組為0.612±0.035，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯低于其他兩組（P<0.05）。由此可見，RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)后，T24細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A所示，空白對(duì)照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為356±25個(gè)，陰性對(duì)照組為348±23個(gè)，兩組無明顯差異（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)量僅為186±15個(gè)，明顯少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5B所示，空白對(duì)照組穿過Matrigel基質(zhì)膠膜遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為215±18個(gè)，陰性對(duì)照組為208±16個(gè)，兩組差異不顯著（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)量為85±10個(gè)，顯著低于其他兩組（P<0.05）。這表明RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)能夠顯著降低T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖6所示?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.56%±0.45%，陰性對(duì)照組為3.82%±0.50%，兩組之間無明顯差異（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高至18.56%±1.20%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)可促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡。綜上所述，RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)后，人膀胱癌T24細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，凋亡率明顯升高。這表明VEGF-C基因在膀胱癌T24細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，沉默該基因有望成為治療膀胱癌的有效策略。4.4結(jié)果討論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了針對(duì)VEGF-C基因的RNAi載體，并將其轉(zhuǎn)染入人膀胱癌T24細(xì)胞，有效沉默了VEGF-C基因和蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi沉默VEGF-C基因表達(dá)后，T24細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，凋亡率明顯升高。這些結(jié)果與預(yù)期相符，進(jìn)一步證實(shí)了VEGF-C基因在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。從機(jī)制上分析，VEGF-C基因的沉默可能通過多種途徑影響T24細(xì)胞的生物學(xué)行為。VEGF-C作為一種重要的促血管生成和促淋巴管生成因子，其表達(dá)的降低可能減少了腫瘤血管和淋巴管的生成，從而限制了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑。在腫瘤生長過程中，血管生成是腫瘤細(xì)胞獲取充足營養(yǎng)和氧氣的關(guān)鍵，VEGF-C通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。當(dāng)VEGF-C基因被沉默后，其與受體的結(jié)合減少，信號(hào)通路的激活受到抑制，導(dǎo)致血管生成減少，腫瘤細(xì)胞因營養(yǎng)供應(yīng)不足而生長受限。VEGF-C還通過自分泌和旁分泌方式，與腫瘤細(xì)胞表面的VEGFR-2結(jié)合，激活下游的ERK1/2和PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。沉默VEGF-C基因后，這些信號(hào)通路的激活被阻斷，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。研究表明，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)VEGF-C基因被沉默后，PI3K-AKT信號(hào)通路受到抑制，細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。在本次實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果與預(yù)期基本一致，但也存在一些細(xì)微差異。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，雖然實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組，但在培養(yǎng)初期（24h時(shí)），三組之間的差異并不顯著。這可能是因?yàn)镽NAi技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的抑制需要一定時(shí)間才能充分發(fā)揮作用，在短時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)原有的VEGF-C蛋白仍在發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞增殖的影響尚未明顯體現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，VEGF-C蛋白逐漸被降解，RNAi的抑制效果逐漸顯現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異才變得顯著。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，雖然實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，但仍有部分細(xì)胞能夠穿過Transwell小室的膜，這可能是由于RNAi技術(shù)無法完全沉默VEGF-C基因的表達(dá)，仍有少量VEGF