生物分離純化技術(shù)日期:目錄CATALOGUE02.物理分離方法04.電泳技術(shù)應(yīng)用05.膜分離技術(shù)01.基本原理03.色譜技術(shù)詳解06.優(yōu)化與評(píng)估基本原理01定義與核心概念基于目標(biāo)分子與雜質(zhì)在物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)上的差異（如分子大小、電荷、溶解度、親和性等），通過(guò)特定技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)分離。核心分離原理

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實(shí)際應(yīng)用中常采用多級(jí)分離技術(shù)（如粗提、精制、拋光）逐步提高純度，避免單一技術(shù)的局限性。多步驟協(xié)同策略生物分離純化是指從復(fù)雜的生物體系中提取、分離和純化目標(biāo)生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）的技術(shù)過(guò)程，旨在獲得高純度、高活性的目標(biāo)產(chǎn)物。生物分離純化的定義純化過(guò)程需兼顧產(chǎn)物的純度、收率、活性及規(guī)?；尚行裕ǔＭㄟ^(guò)電泳、色譜、離心等技術(shù)評(píng)估純化效果。純化目標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)應(yīng)用范圍純化特定蛋白質(zhì)或核酸用于結(jié)構(gòu)解析（如X射線晶體學(xué)）、功能研究（如酶活性測(cè)定）或診斷試劑開(kāi)發(fā)。生物醫(yī)學(xué)研究食品與農(nóng)業(yè)環(huán)境生物技術(shù)用于重組蛋白（如抗體、疫苗）、基因治療載體（如AAV病毒）的規(guī)?；a(chǎn)，滿足GMP標(biāo)準(zhǔn)下的純度要求。提取功能性成分（如乳清蛋白、植物多糖）或去除有害物質(zhì)（如過(guò)敏原、毒素），提升產(chǎn)品安全性。從微生物群落中分離特定菌株或酶制劑，用于污染物降解或生物能源生產(chǎn)。制藥工業(yè)關(guān)鍵分離機(jī)制分子篩效應(yīng)疏水作用與反相色譜電荷相互作用生物特異性親和利用凝膠過(guò)濾色譜或超濾膜按分子大小分離，適用于脫鹽或不同量級(jí)生物分子的分級(jí)。通過(guò)離子交換色譜根據(jù)分子表面電荷差異分離，可精細(xì)區(qū)分等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)?；诜肿邮杷圆町?，尤其適用于肽段或小分子代謝產(chǎn)物的分離純化。采用抗體、配體或標(biāo)簽（如His-tag）的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高選擇性純化，單步純度提升顯著。物理分離方法02沉淀技術(shù)鹽析沉淀法通過(guò)加入高濃度中性鹽（如硫酸銨）降低蛋白質(zhì)溶解度，利用蛋白質(zhì)在不同鹽濃度下的沉淀特性實(shí)現(xiàn)分離，適用于大規(guī)模粗提和濃縮。有機(jī)溶劑沉淀法利用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑改變?nèi)芤簶O性，使蛋白質(zhì)或核酸因溶解度降低而析出，需嚴(yán)格控制溫度和pH以避免變性。等電點(diǎn)沉淀法調(diào)節(jié)溶液pH至目標(biāo)物質(zhì)的等電點(diǎn)（pI），使其表面電荷為零而聚集沉淀，常用于分離兩性電解質(zhì)如氨基酸和多肽。熱變性沉淀法通過(guò)加熱使雜蛋白變性沉淀，保留目標(biāo)蛋白活性，適用于熱穩(wěn)定性差異顯著的蛋白質(zhì)純化。離心分離差速離心法基于顆粒大小和密度差異，通過(guò)階梯式轉(zhuǎn)速分離細(xì)胞器（如線粒體、溶酶體），需優(yōu)化離心力和時(shí)間以提高分辨率。在蔗糖或氯化銫梯度介質(zhì)中，利用沉降系數(shù)差異分離DNA、RNA或病毒顆粒，超速離心可達(dá)百萬(wàn)g級(jí)離心力。目標(biāo)物質(zhì)在梯度介質(zhì)中遷移至與自身密度相等的區(qū)域，適用于分離脂蛋白或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，需精確控制離心時(shí)間。處理大體積樣品時(shí)，通過(guò)連續(xù)進(jìn)樣和出樣實(shí)現(xiàn)高通量分離，廣泛應(yīng)用于工業(yè)級(jí)生物制劑生產(chǎn)。差速離心法差速離心法差速離心法過(guò)濾技術(shù)微濾（MF）采用0.1-10μm孔徑膜去除細(xì)菌、細(xì)胞碎片，操作壓力低（<2bar），常用于培養(yǎng)基澄清和預(yù)過(guò)濾步驟。超濾（UF）截留分子量1-1000kDa的溶質(zhì)，通過(guò)切向流設(shè)計(jì)減少膜污染，適用于蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換。納濾（NF）選擇性分離二價(jià)離子和小分子有機(jī)物（200-1000Da），在生物制藥中用于脫鹽和低分子量雜質(zhì)去除。深層過(guò)濾技術(shù)結(jié)合纖維素/硅藻土等多孔介質(zhì)，通過(guò)吸附和機(jī)械截留去除微小顆粒，成本低但需定期更換濾芯。色譜技術(shù)詳解03離子交換色譜分離原理基于分子表面電荷差異，通過(guò)固定相（離子交換樹(shù)脂）與流動(dòng)相中帶電分子的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離，適用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的純化。01樹(shù)脂類(lèi)型選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（如磺酸基團(tuán)）用于帶正電分子分離，陰離子交換樹(shù)脂（如季銨基團(tuán)）用于帶負(fù)電分子分離，需根據(jù)目標(biāo)分子等電點(diǎn)優(yōu)化pH條件。洗脫策略采用梯度鹽濃度（如NaCl梯度）或pH梯度洗脫，逐步削弱目標(biāo)分子與樹(shù)脂的結(jié)合力，提高分離分辨率。應(yīng)用場(chǎng)景廣泛用于單克隆抗體純化、酶制劑制備及質(zhì)粒DNA提取等生物制藥領(lǐng)域。020304親和色譜特異性結(jié)合機(jī)制利用生物分子間高親和力相互作用（如抗原-抗體、酶-底物、受體-配體），通過(guò)固定化配體（如ProteinA/G）選擇性捕獲目標(biāo)物質(zhì)。工業(yè)應(yīng)用單抗藥物生產(chǎn)中ProteinA親和層析為核心步驟，純度可達(dá)95%以上，但需注意配體脫落導(dǎo)致的產(chǎn)物污染風(fēng)險(xiǎn)。配體設(shè)計(jì)需考慮配體穩(wěn)定性（如耐酸堿、抗蛋白酶降解）和結(jié)合容量，常用配體包括鎳柱（His標(biāo)簽純化）、凝集素（糖蛋白純化）等。洗脫條件優(yōu)化采用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫（如咪唑競(jìng)爭(zhēng)His標(biāo)簽）、pH驟變或溫和還原劑（如DTT）破壞相互作用，避免目標(biāo)蛋白變性。凝膠過(guò)濾色譜1234分子篩效應(yīng)依據(jù)分子大小差異進(jìn)行分離，大分子因無(wú)法進(jìn)入凝膠孔徑（如Sephadex、Superdex）而先流出，小分子滯留時(shí)間更長(zhǎng)。需匹配目標(biāo)分子量范圍，如SephacrylS-200HR適用于10-1500kDa蛋白，Superose6Increase適合超大分子復(fù)合物分析。介質(zhì)選擇緩沖液要求需保持恒定離子強(qiáng)度和pH以避免非特異性吸附，常用Tris-HCl或PBS緩沖體系，流速控制在0.5-1mL/min以平衡分辨率與耗時(shí)。應(yīng)用優(yōu)勢(shì)無(wú)需結(jié)合洗脫步驟即可脫鹽、緩沖液置換或寡聚體分析，常用于單抗聚合體去除或病毒顆粒純化。電泳技術(shù)應(yīng)用04SDS分析蛋白質(zhì)分子量測(cè)定SDS（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）通過(guò)SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合形成均勻負(fù)電荷，消除蛋白質(zhì)形狀差異，使遷移率僅與分子量相關(guān)，廣泛用于精確測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量。純度檢測(cè)與分離該技術(shù)可分離復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)組分，通過(guò)染色或熒光標(biāo)記評(píng)估樣品純度，常用于重組蛋白表達(dá)純化后的質(zhì)量控制。WesternBlot前處理作為WesternBlot的關(guān)鍵預(yù)處理步驟，SDS將蛋白質(zhì)按分子量分離后轉(zhuǎn)移至膜上，便于后續(xù)抗體特異性檢測(cè)目標(biāo)蛋白。動(dòng)態(tài)范圍優(yōu)化通過(guò)調(diào)整凝膠濃度（如8%-16%梯度膠），可針對(duì)不同分子量范圍（10-250kDa）的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)最佳分辨率。等電聚焦利用pH梯度凝膠和電場(chǎng)作用，蛋白質(zhì)遷移至與其等電點(diǎn)（pI）相同的pH區(qū)域并聚焦成窄帶，分辨率可達(dá)0.01pH單位，適用于蛋白質(zhì)變體或翻譯后修飾分析。等電點(diǎn)精確測(cè)定與SDS聯(lián)用構(gòu)成2D，先按等電點(diǎn)分離，再按分子量分離，大幅提高復(fù)雜樣本（如細(xì)胞裂解液）的分辨能力。二維電泳第一維分離可檢測(cè)蛋白質(zhì)脫酰胺、磷酸化等修飾導(dǎo)致的電荷變異，廣泛應(yīng)用于生物制藥中單克隆抗體的電荷異構(gòu)體分析。電荷異質(zhì)性研究現(xiàn)代等電聚焦采用預(yù)鑄的固相pH梯度膠（IPG膠條），克服了傳統(tǒng)載體兩性電解質(zhì)的穩(wěn)定性問(wèn)題，提升重復(fù)性和上樣量。固相pH梯度技術(shù)高效微量分析多種分離模式毛細(xì)管電泳（CE）在數(shù)十微米內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行，僅需納升級(jí)樣品，適用于珍貴或微量樣本（如單細(xì)胞分析）的高效分離。包括自由溶液區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動(dòng)色譜（MEKC）和篩分電泳（CGE），可針對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、小分子等不同物質(zhì)優(yōu)化分離條件。毛細(xì)管電泳高靈敏度檢測(cè)結(jié)合紫外、激光誘導(dǎo)熒光（LIF）或質(zhì)譜檢測(cè)器，CE的檢測(cè)限可達(dá)飛摩爾級(jí)別，常用于藥物代謝產(chǎn)物或生物標(biāo)志物超痕量分析。自動(dòng)化與高通量現(xiàn)代多通道毛細(xì)管陣列電泳系統(tǒng)（如遺傳分析儀）支持96孔板同步上樣，廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)序和片段分析，單次運(yùn)行時(shí)間可短至10分鐘。膜分離技術(shù)05超濾方法4膜材料選擇3應(yīng)用領(lǐng)域2操作參數(shù)優(yōu)化1分子量截留機(jī)制常用聚醚砜（PES）、聚偏氟乙烯（PVDF）等材料，需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性和親水性進(jìn)行篩選。需控制跨膜壓力（0.1-1MPa）、流速和溫度，避免濃差極化和膜污染，同時(shí)采用錯(cuò)流過(guò)濾模式以延長(zhǎng)膜壽命。廣泛應(yīng)用于生物制藥（單克隆抗體純化）、食品工業(yè)（乳清蛋白濃縮）及廢水處理（去除膠體顆粒）。超濾通過(guò)特定孔徑的膜實(shí)現(xiàn)分子量分級(jí)，截留大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖）而允許小分子（如水、無(wú)機(jī)鹽）透過(guò)，截留范圍通常為1-1000kDa。透析技術(shù)半透膜擴(kuò)散原理利用濃度梯度驅(qū)動(dòng)小分子溶質(zhì)（如鹽類(lèi)、代謝廢物）通過(guò)半透膜（截留分子量1-10kDa），而大分子（如蛋白質(zhì)）被保留。透析效率受膜面積、緩沖液體積和更換頻率影響，通常需4-24小時(shí)完成平衡，低溫操作可防止樣品變性。需匹配目標(biāo)分子的pH和離子強(qiáng)度，常用Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，避免滲透壓劇烈變化導(dǎo)致樣品失活。用于血液透析（清除尿素）、蛋白脫鹽及細(xì)胞培養(yǎng)液更換，成本低但處理量較小。半透膜擴(kuò)散原理半透膜擴(kuò)散原理半透膜擴(kuò)散原理微濾操作在生物反應(yīng)器收獲（菌體分離）、飲料澄清（果汁過(guò)濾）及空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)（顆粒物采集）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。工業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用使用前需進(jìn)行高壓滅菌或乙醇浸泡，并通過(guò)泡點(diǎn)法檢測(cè)膜完整性，確保分離效率。滅菌與完整性測(cè)試死端過(guò)濾適合低固含量樣品，切向流可減少膜堵塞，需優(yōu)化剪切力以平衡通量與膜污染。死端與切向流模式微濾膜孔徑為0.1-10μm，可截留細(xì)菌、細(xì)胞碎片和懸浮顆粒，適用于澄清和除菌步驟。粒徑篩分特性?xún)?yōu)化與評(píng)估06純化策略設(shè)計(jì)多步驟組合純化根據(jù)目標(biāo)分子的理化性質(zhì)，設(shè)計(jì)層析、超濾、沉淀等技術(shù)的組合流程，逐步提高產(chǎn)物純度并減少雜質(zhì)干擾。例如，先采用離子交換層析去除帶電雜質(zhì)，再通過(guò)疏水層析分離疏水性差異組分。連續(xù)純化技術(shù)應(yīng)用整合模擬移動(dòng)床色譜（SMB）或連續(xù)逆流層析，實(shí)現(xiàn)不間斷進(jìn)料與分離，顯著提升處理通量并降低緩沖液消耗，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。親和層析優(yōu)化利用生物特異性相互作用（如抗原-抗體、酶-底物）實(shí)現(xiàn)高選擇性純化。需優(yōu)化配基固定化密度、洗脫緩沖液pH和離子強(qiáng)度，平衡結(jié)合效率與產(chǎn)物回收率。效能評(píng)價(jià)指標(biāo)動(dòng)態(tài)結(jié)合容量評(píng)估測(cè)定層析介質(zhì)在特定流速下的動(dòng)態(tài)載量（DBC），優(yōu)化填料類(lèi)型與操作參數(shù)，避免柱超載導(dǎo)致的穿透或分辨率下降。宿主蛋白殘留檢測(cè)運(yùn)用ELISA或質(zhì)譜法量化工藝中宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留，確保其低于監(jiān)管閾值（通常<100ppm），避免引發(fā)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。純度與收率平衡采用HPLC或CE分析目標(biāo)產(chǎn)物純度，同時(shí)計(jì)算各步驟收率，通過(guò)質(zhì)量平衡模型評(píng)估工藝整體效率。純度需滿足下游應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)（