ICS65.020.20

CCSB05

3717

菏澤市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB3717/T23—2024

植物種苗組培技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofplantmicropropagation

2024-06-28發(fā)布2024-07-28實(shí)施

菏澤市市場(chǎng)監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB3717/T23—2024

目次

前言........................................................................................................................................................................II

1范圍...................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件..............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義......................................................................................................................................................1

4培養(yǎng)基的配制..................................................................................................................................................1

4.1母液的配制...............................................................................................................................................1

4.2植物接種培養(yǎng)基.......................................................................................................................................1

5植物材料的選擇與外植體滅菌......................................................................................................................2

5.1植物組培苗外植體母本圃種植...............................................................................................................2

5.2植物材料選擇時(shí)間...................................................................................................................................2

5.3植物材料部位的確定和選擇...................................................................................................................2

5.4儀器和植物外植體材料的滅菌...............................................................................................................2

5.5儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時(shí)間...............................................................................................................2

5.6儀器和培養(yǎng)基與外植體消毒...................................................................................................................2

5.7植物外植體的無菌操作...........................................................................................................................3

6組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng)......................................................................................................................................3

6.1愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)...........................................................................................................................3

6.2增殖繼代培養(yǎng)...........................................................................................................................................3

6.3植物組織生根培養(yǎng)...................................................................................................................................3

6.4組織苗煉苗移栽.......................................................................................................................................3

6.5移栽穴盤苗的管理...................................................................................................................................3

7包裝與運(yùn)輸......................................................................................................................................................3

7.1包裝...........................................................................................................................................................3

7.2運(yùn)輸...........................................................................................................................................................4

附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基母液配制................................................................................................................5

附錄B（規(guī)范性）不同植物品種常用培養(yǎng)基配法........................................................................................6

附錄C（規(guī)范性）生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制................................................................................................7

附錄D（規(guī)范性）植物不同器官消毒順序....................................................................................................9

附錄E（規(guī)范性）器皿及培養(yǎng)基的最少滅菌時(shí)間......................................................................................10

附錄F（規(guī)范性）儀器和培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系..........................................................11

附錄G（規(guī)范性）植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果......................................................................12

附錄H（規(guī)范性）ABT生根粉種類及使用濃度............................................................................................8

附錄I（規(guī)范性）不同植物激素種類與使用濃度........................................................................................13

I

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由菏澤市林業(yè)局提出、歸口并組織實(shí)施。

本文件起草單位：菏澤市林業(yè)科學(xué)研究院、菏澤市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心、菏澤市自然資源和規(guī)劃局、

菏澤市行政審批踏勘評(píng)審中心、菏澤林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心、鄆城縣陽光花卉有限公司。

本文件主要起草人：袁全國(guó)﹑王金國(guó)﹑任升﹑李艷玲﹑陳和平、晁新勝﹑羅松﹑李新艷﹑劉金錦﹑

王海燕﹑蘇麗娟﹑張淼﹑王傳印﹑左傳偵。

II

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植物種苗組培技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了植物種苗組培的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基配制、接種操作流程、包裝和運(yùn)輸。

本文件適用于菏澤市植物種苗的組培。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T1965-2003日光溫室和塑料大棚結(jié)構(gòu)與性能要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

種苗germchit

種子播種發(fā)芽后，一般生長(zhǎng)到2對(duì)真葉，適合移植到其它環(huán)境生長(zhǎng)的幼小植株。

3.2

組培苗tissuecultureseedling

利用植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工條件下，培育植株。

4培養(yǎng)基的配制

4.1母液的配制

4.1.1MS培養(yǎng)基母液的配制

培養(yǎng)基母液配制參見附錄A。不同植物品種常用培養(yǎng)基配制方法見附錄B。配制好的母液瓶上分別

貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)﹑配制倍數(shù)﹑日期及配制1L培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.1.2生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制

生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見附錄C，定容后貯藏于冰箱中保存?zhèn)溆?，若貯藏時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)生乳析現(xiàn)

象應(yīng)震蕩均勻后使用。

4.2植物接種培養(yǎng)基

4.2.1配制

1

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4.2.1.1先將貯藏的母液依次按順序擺放好,再準(zhǔn)備好各種玻璃器皿﹑量筒﹑燒杯﹑吸管﹑玻璃棒﹑漏

斗等。稱好瓊脂﹑蔗糖，配好生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。準(zhǔn)備好蒸餾水和封瓶口用的繩子﹑封口紙。

4.2.1.2根據(jù)培養(yǎng)基的配方分別用吸管吸取培養(yǎng)基母液，把依母液的濃度量取規(guī)定量滴入量筒中。加

完母液依培養(yǎng)基的配方計(jì)算出所需生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的量，吸取滴入量筒中，定容到1000ml所需的體積。把

定容的培養(yǎng)基液倒入含有0.6%～1.0%瓊脂﹑1%～5%蔗糖的加熱容器內(nèi)繼續(xù)加熱，不斷攪拌，直至使

瓊脂完全溶解。

4.2.1.3接種培養(yǎng)基的pH值控制在5.5～6.0，用0.1N～1N的HCL(NaOH)對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整。

4.2.2分裝

趁熱分裝培養(yǎng)基，一般占試管、三角瓶等容器1/3～1/4左右為宜。注意避免培養(yǎng)基粘到瓶壁上，防

止感染雜菌。

4.2.3消毒

分裝好的培養(yǎng)基、無菌水、接種工具放入高壓消毒鍋中(滅菌壓力0.11MPa～0.14MPa,120℃～

126℃,15min～20min)，不要裝入太滿影響蒸汽循環(huán)。高壓滅菌后培養(yǎng)基取出，放置凝固后接種使用。

5植物材料的選擇與外植體滅菌

5.1植物組培苗外植體母本圃種植

將性狀優(yōu)良的組培苗種植在溫室內(nèi),加強(qiáng)水肥管理,使植株生長(zhǎng)健壯,減少植物體表面的細(xì)菌﹑真菌

﹑微生物的數(shù)量。

5.2植物材料選擇時(shí)間

3月植物外植體形成愈傷組織最多，7月次之，最次12月愈傷組織形成最少，確定最佳時(shí)間為3月份。

5.3植物材料部位的確定和選擇

根據(jù)組織培育目的，可選擇根﹑莖﹑葉等組織和器官，一般選擇植物的莖段作為植物培育外植體。

5.4植物不同器官滅菌順序

見附件D。

5.5儀器及培養(yǎng)基的最少消毒時(shí)間

見附錄E。器皿和金屬器械滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌法，器皿、金屬器械和培養(yǎng)基的最少滅菌時(shí)

間參見附錄。

5.6儀器﹑培養(yǎng)基與外植體消毒

5.6.1儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系

見附錄F。

5.6.2植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果

見附錄G。

2

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5.6.3無菌室的滅菌

接種前一天,高錳酸鉀與甲醛混合產(chǎn)生的霧化氣體封閉無菌室滅菌，并紫外燈照射30min。

5.7植物外植體的無菌操作

植物組織的整個(gè)接種過程均需無菌操作。將滅菌沖洗干凈的嫩梢0.5cm～1cm小段放在超凈工作臺(tái)

無菌的環(huán)境中,用左手鑷子夾住莖尖,右手用解剖刀除去幼芽的外面部分,切取頂端0.5mm～1mm大小的芽

接種在滅菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織分化培養(yǎng)，可將病毒除去。

6組織培養(yǎng)苗試管培養(yǎng)

6.1愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/L+KT0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右，培養(yǎng)室溫25±2℃，

每天12h光照。（不同植物激素使用種類與濃度見附錄H）。

6.2增殖繼代培養(yǎng)

6.2.1愈傷組織脫分化培養(yǎng)后，切下形成的小芽，接種在MS+6-BA2mg/L+IAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%

瓊脂,pH值為6.0左右的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng),經(jīng)24周器官分化,形成纖弱小芽。

6.2.2芽長(zhǎng)至12cm時(shí)切下轉(zhuǎn)到MS+6-BA（2mg/L～）+KT（0.3mg/L）+IAA（0.5mg/L）+3%蔗糖+0.7%

瓊脂,pH值為6.0～左右的培養(yǎng)基上,用于壯苗。隨著繼代增殖培養(yǎng)逐漸減少6-BA的用量，最后一次繼代

增殖培養(yǎng)可以加少量的IAA﹑NAA﹑IBA便于外植體的復(fù)壯與生根。

6.3植物組織生根培養(yǎng)

生長(zhǎng)健壯、適于生根的叢生無根苗,接種在1/2MS(大量元素減半)+NAA0.2-0.5mg/L+IBA2.0mg/L+3%

蔗糖+0.7%瓊脂,PH值6.0左右的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～40天,基部切口處產(chǎn)生新根。

6.4組織苗煉苗移栽

6.4.1當(dāng)組培苗新根長(zhǎng)至1㎝～5㎝,苗高5cm～8cm時(shí),培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入少量無菌水,轉(zhuǎn)移到23℃～25℃的

溫室中接受自然光的照射，3天～6天后取出試管,無菌蒸餾水沖干凈黏附在根部的瓊脂。

6.4.2將清洗干凈的試管苗在50%可濕性粉劑多菌靈30～70倍液與ABT生根劑液中浸泡（ABT生根

粉種類與濃度見附錄I），定植在混合基質(zhì)中，混合基質(zhì)配方是泥炭：蛭石：珍珠巖（2：1：1）。注

意覆蓋小拱棚及遮陰網(wǎng)，避強(qiáng)光且保濕；移栽前試管苗澆灌0.5g/L的多菌靈溶液進(jìn)行基質(zhì)消毒。

6.5移栽穴盤苗的管理

溫度控制在15℃～28℃，相對(duì)濕度控制在80%～90%，光照強(qiáng)度控制在5000LX～10000LX。施肥用

10%MS培養(yǎng)基澆灌。每3天噴施稀釋1000～1500倍的多菌靈或百菌清等殺菌劑一次。

7包裝與運(yùn)輸

7.1包裝

3

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試管苗及穴盤苗包裝:將代有試管的組培苗裝在泡沫箱里,外面在用紙箱包裝；穴盤苗連同穴盤放在

紙箱里，層層放置，保持立體空間。每箱貼上標(biāo)簽,注明品種﹑等級(jí)﹑規(guī)格﹑數(shù)量、產(chǎn)地等放在托盤上

運(yùn)輸。

7.2運(yùn)輸

及時(shí)冷藏運(yùn)輸,避免極端天氣。

4

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附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基母液配制

培養(yǎng)基母液配置見表A.1。

表1.1培養(yǎng)基母液配置

母液體積1L培養(yǎng)基吸取

母液編號(hào)化合物名稱規(guī)定量擴(kuò)大倍數(shù)稱取量

(ml)量(ml)

KNO?19001019000

NH4NO?16501016500

MgSO4·7H2O370103700

KH2PO4170101700

母液11000100

CaCl2·2H2O440104400

MnSO4·4H2O22.31002230

ZnSO4·7H2O8.6100860

H3BO36.2100620

MnSO4·4H2O22.31002230

ZnSO4·7H2O8.6100860

H3BO36.2100620

母液2IK0.8310083100010

Na2MoO4·2H2O0.2510025

CuSO4·5H2O0.0251002.5

CaCl26H2O0.0251002.5

Na2-EDTA37300----

母液310005

FeSO4?7H2O27800----

甘氨酸2.050100

維生素B10.45020

母液4維生素B60.5502550010

煙酸0.55025

肌醇100505000

5

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附錄B

（規(guī)范性）

不同植物品種常用培養(yǎng)基配法

不同植物品種常用培養(yǎng)基配法見表B.1。

表1.2不同植物品種常用培養(yǎng)基配法

名稱愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基繼代增值培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基

泡桐MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+B90.5mg/L

康乃

MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.5mg/L

馨

蘋果MS+6-BA0.5mg/L+KT2.0mg/LMS+6-BA0.5mg/L+GA35mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA1.0mg/L

滿天

MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L1/2MS+NAA0.5mg/L

星

獼猴

MS+6-BA3.0mg/L+KT0.5mg/LMS+IBA0.5mg/L+ZT2.0mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+0.4~0.5%活性炭

桃

水仙MS+ZT2.0+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/LMS+NAA2.0mg/L+IAA0.5mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L

人參MS+6-BA0.1mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L

甜橙MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/LMS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.4mg/L

菠蘿MS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/LMS+6-BA0.5mg/L+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L

蝴蝶

MS+GA30.4mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/LMS+GA30.2mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.02mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L+0.5%活性炭

蘭

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附錄C

（規(guī)范性）

生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制

生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制見表C.1。

表1.3生物調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制

名稱溶質(zhì)濃度(mg/ml)稱取量(單位:mg)母液體積(ml)

IAA95%酒精少量0.110100

NAA95%酒精少量0.110100

IBA95%酒精少量0.110100

KT1NHCL少量0.110100

6-BA1NHCL少量0.110100

ZT95%酒精少量0.110100

7

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附錄D

（規(guī)范性）

植物不同器官消毒順序

植物不同器官消毒順序見表D.1。

表1.4植物不同器官消毒順序

消毒順序

器官

消毒前消毒消毒后備注

純酒精浸泡15分鐘,用10%次氯酸鈣20~30min,無菌水沖洗3次，放在無菌環(huán)用幼芽與幼根產(chǎn)生愈傷組

種子

無菌水沖洗再用1%溴水浸泡5min。境中發(fā)芽?？棥?/p>

無菌水反復(fù)沖洗，清除內(nèi)部組

果實(shí)純酒精迅速清洗2%的次氯酸鈉浸泡15min獲得無菌組織。

織和種子。

直接接種在培養(yǎng)基上或切

莖切段洗滌液清洗2%的次氯酸鈉浸泡15min無菌水清洗3~5次

取組織進(jìn)行培養(yǎng)

貯藏2%次氯酸鈉浸泡取出消毒材料內(nèi)部組織進(jìn)

自來水沖洗無菌水清洗3~5次

器官20~30min行培養(yǎng)

用自來水清洗吸干用洗70%的酒精漂洗;2%次氯無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸嫩葉﹑葉片平放或扦插在

葉片

滌液清洗酸鈉浸泡20~30min干。培養(yǎng)基中。

8

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附錄E

（規(guī)范性）

儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時(shí)間

儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時(shí)間見表E.1。

表1.5儀器和培養(yǎng)基的最少滅菌時(shí)間

容器的體積(ml)在121℃下最少滅菌時(shí)間(min)

20~5015

7520

250~50025

100030

150035

200040

9

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附錄F

（規(guī)范性）

儀器﹑培養(yǎng)基的消毒壓力和溫度與排氣的關(guān)系

儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系見表F.1。

表1.6儀器﹑培養(yǎng)基的壓力和溫度與排氣的關(guān)系

排氣溫度(℃)空氣的排除量

壓力(磅)完全排除2/3排除1/2排除1/3排除未排除

5109100949072

1011510910510090

15121115112109100

20126121118115109

25130126124121115

10

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附錄G

（規(guī)范性）

植物外植體常用消毒劑效果

植物外植體常用消毒劑效果見表G.1。

表1.7植物外植體常用消毒劑效果

消毒劑使用濃度(%)去除的難易消毒時(shí)間(min)效果

次氯酸鈣9~10易5~30很好

次氯酸鈉2易5~30很好

過氧化氫10~12最易5~15好

溴水1~2易2~10很好

硝酸銀1較難5~30好

抗菌劑4~50