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臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)部分

抗血清的制備

【原理】:用抗原刺激機(jī)體可以產(chǎn)生抗體,抗原的性質(zhì)、純度和活性影響其免疫動(dòng)物后獲得的抗體的的特異性和

效價(jià)。在體外有目的的制備抗原,經(jīng)初次、再次免疫的過程可以獲得高質(zhì)量的抗體。

【注意事項(xiàng)】

①制備佐劑時(shí),一定要順著同一方向用勁磨。

②檢查油包水的方法:培養(yǎng)皿內(nèi)加水,滴入混勻液,不散開即可.如果第1次檢查不合格,第2次檢查必須重新倒

水在平業(yè).

③免疫動(dòng)物皮內(nèi)注射時(shí),可以在足墊、腋下、背部等處多點(diǎn)注射,總劑量1ml/只。

凝集反應(yīng)

顆粒性Ag或可溶性Ag(Ab)與載體顆粒結(jié)合成的致敏顆粒,與相應(yīng)Ab(Ag)發(fā)生特異性反應(yīng).在一定條件下,

形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

一、直接凝集反應(yīng):顆粒性Ag,與相應(yīng)Ab直接結(jié)合。在一定條件下,形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象.

(1)玻片法凝集反應(yīng):

【原理】:顆粒性Ag(細(xì)菌、紅細(xì)胞等),與相應(yīng)Ab直接結(jié)合。在一定條件下,形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

【意義】:①定性試驗(yàn),5r用已知抗體的診斷血清來測(cè)未知的抗原。②可用于細(xì)菌分型、ABO僉型鑒定等.

【結(jié)果觀察】:

①對(duì)照區(qū)不發(fā)生凝集,為均勻渾濁的禮狀液。

②試臉區(qū),傷寒菌液(Ag)與相應(yīng)的Ab發(fā)生反應(yīng),出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊,為陽性。如與對(duì)照相同則為陰性。

(2)試管法凝集反應(yīng):

【原理】:用已知細(xì)菌作為一定濃度的懸液Ag,與一系列稀釋的受檢血清混合,經(jīng)靜置保溫后現(xiàn)察每管內(nèi)顆粒性

Ag的凝集程度.

【結(jié)果觀察】:

①先看好照管,應(yīng)無凝集現(xiàn)象,輕搖試管,細(xì)菌分散均勻,混濁。再從第1管開始看.

②根據(jù)凝集度打“+”.

—:管底無沉淀,液體混濁,細(xì)菌分散均勻。

++++:管底有沉淀,上液澄清,細(xì)菌全部凝集。

+++:管底有沉淀,液體箱混,細(xì)菌1/4不凝集。

++:管底有沉淀,液體滉濁,細(xì)菌1/2不凝集

+:管底僅少量有沉淀,液體混濁。

效價(jià)判斷:以出現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋度,為該血清的凝集效價(jià)。

二、間接凝集反應(yīng):必須借助顆粒性載體,將可溶性Ag(Ab)致敬載體,成致敏顆粒,再檢測(cè)標(biāo)本由相應(yīng)的Ab(Ag)o

間接凝集反應(yīng)(膠乳凝集抑制試驗(yàn)):

【定義】:間接凝集反應(yīng):將可溶性Ag掛在一個(gè)無關(guān)免疫的載體(聚苯乙飾膠乳)上,制備成顆粒Ag,與其相

應(yīng)的Ab相結(jié)合,為間接凝集反應(yīng)。

以檢測(cè)尿中HCG為例:

陽性:尿含HCG+抗HCGT+HCG膠乳顆粒T不凝集

陰性:尿不含HCG+抗HCGT+HCG膠乳顆粒T凝集

沉淀反應(yīng)

【定義】:可溶性Ag+相應(yīng)AbT形成肉眼可見的沉淀物質(zhì)(Ag—Ab復(fù)合物)

一、對(duì)流免疫電泳

【原理】:利用電場(chǎng)的作用加強(qiáng)和加快雙向獷散的一種方法。

在pH8。6的堿性緩沖液瓊脂中進(jìn)行電泳,帶有較多負(fù)電荷的Ag泳向陽極,而Ab球蛋白等電點(diǎn)偏高(約為6--7),

在pH8。6時(shí)帶負(fù)電荷較少,加上分子量較大,泳動(dòng)慢,受電滲(指也場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng))干擾

后向陰極倒退,這樣抗原抗體作相對(duì)運(yùn)動(dòng),在較短時(shí)間內(nèi)即可相遇,在孔間兩者分子比例合適的地方彩成沉淀線。

【意義】:對(duì)流免疫電泳主要用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗原如AFP、HBsAg等。本法較雙向瓊脂擴(kuò)散忖間大為縮短(一

般只需30分鐘到1小時(shí)),且靈敏度比雙擴(kuò)高約數(shù)十倍。

沉淀線的位置與Ag、Ab分子電荷情況有關(guān),也與Ag、Ab比例有關(guān)。有沉淀線為陽性,無沉淀線為陰性。

【特點(diǎn)】

優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便,觀察結(jié)果快,敏感度比雙擴(kuò)高8-16倍。

缺點(diǎn):分班率差,當(dāng)有多種Ag、Ab系統(tǒng)存在時(shí),形成的沉淀線位置易重登,難以分辨,所以用此目的時(shí),不如雙

擴(kuò)。

二、雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

【原理】:定性試驗(yàn).月務(wù)可溶性抗原與相應(yīng)抗體分別加入瓊脂板上相對(duì)應(yīng)的孔內(nèi),抗原抗體從孔內(nèi)向四周擴(kuò)散,在

兩者對(duì)應(yīng)比例適宜處形成沉淀線。

【意義】:可用已知抗原(抗體)來檢測(cè)未知的抗體(抗原),同時(shí)檢測(cè)抗原抗體的純度。臨床上常用來檢測(cè)甲

胎蛋白[AFP),作為原發(fā)性肝癌等的輔助診斷。

【結(jié)果判斷】:

①在陽性對(duì)照孔與中間的抗體孔之間出現(xiàn)一條或多條白色沉淀線(一對(duì)抗原抗體系統(tǒng)即可出現(xiàn)一條沉淀線,如有

多對(duì)抗原抗體可出現(xiàn)多條沉淀線)。

②觀察標(biāo)本孔與中間的抗體孔之間有無出現(xiàn)沉淀線,有即為陽性,無即為陰性。

以上兩實(shí)險(xiǎn)的注意事項(xiàng):

①澆瓊脂板時(shí)注意動(dòng)作要迅速,瓊脂不要溢出玻片,成品瓊脂板平整無氣泡,打孔時(shí),不要將瓊脂劃破;②加樣

時(shí),不要溢出孔外;③加樣用的槍頭不要混用。

三、免疫電泳

【原理】:區(qū)帶電泳后進(jìn)行雙相瓊脂■!廣散實(shí)臉.

將待測(cè)標(biāo)本置于瓊脂凝膠中電泳,樣品中各蛋白成分因分子量及電泳迂移率不同,被分成肉眼不可見的若干區(qū)帶。

電泳結(jié)束后,沿與電泳方向平行的兩例開槽并加入抗血清,置室溫或37度使兩者擴(kuò)散.18—24h后,各區(qū)帶蛋白與

相應(yīng)的Ab在相應(yīng)的位置上形成弧形沉淀線。Ag越多,沉淀線越靠近Ab槽,其沉淀線越粗,可做細(xì)微的蛋白質(zhì)組

分分析,僅為定性實(shí)驗(yàn)。

【用途】:定性實(shí)臉,主要用于純化Ag和Ab成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識(shí)別和鑒定等方面。

注意事項(xiàng):①開槽處距玻片邊緣>5mm,開孔處〉7。5mm。②槽中加抗血清時(shí),加滿即可,切忌溢出。

四、單向瓊脂擴(kuò)散電泳

【原理】:?jiǎn)蜗颦傊瑪U(kuò)散擴(kuò)實(shí)臉是凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)定量試臉。一般是用已知抗體測(cè)定未知量的相應(yīng)抗原。定

量抗體與加熱熔化的含緩沖液的瓊脂混合后,制板,打孔,加入待檢抗原,在合適條件下,形成乳白色的沉淀環(huán).沉

淀環(huán)大小與抗原(抗體)量成正相關(guān),因而可以根據(jù)沉淀環(huán)的大小確定相應(yīng)抗原(抗體)的量。

【意義】:?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散試驗(yàn)主要用于血清中IgG、IgM、IgA和補(bǔ)體等蛋白質(zhì)的定性、定量測(cè)定。

以上兩實(shí)臉的注意事項(xiàng):

制備抗體掠脂板時(shí),瓊脂溫度必須嚴(yán)格控制。溫度太低會(huì)導(dǎo)致瓊脂凝固,太高將影響所加抗體的活性.

加樣孔中的瓊脂應(yīng)挑干凈,且不可損壞孔的邊緣,確保每孔的液面基本一致.

ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay)

該技術(shù)基礎(chǔ)是抗原或抗體因相化和酶標(biāo)記的抗體或抗原,因相化和酹標(biāo)記的抗原抗體仍保持其免疫活性°

在測(cè)定聆,把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體

起反應(yīng),用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)

本中受檢物質(zhì)的量有一定的比例,加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物

質(zhì)的量直接相關(guān),根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

常用的ELISA的方法有:間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法

乙肝兩對(duì)半:

乙型肝炎病毒抗原T人體產(chǎn)生的相應(yīng)抗體

HBsAgTHBsAb、HBeAgTHBeAb、(HBcAg)THBcAb

大三陽:HBsAg,HBeAg,HBcAb陽性。小三陽:HBsAg,HBeAb,HBcAb陽性。

【實(shí)驗(yàn)E的】:定性或定量測(cè)定人血清或血漿中乙型肝炎病毒表面抗體(抗HBs),可用于判斷乙型肝炎疫苗接

種效果和乙型肝炎病毒感染的治療效果和預(yù)后情況。

【實(shí)險(xiǎn)原理】:雙抗原夾心法檢測(cè)人血清或血漿中的抗一HBs(一步法)。

采用純化HBsAg包被反應(yīng)板,加入待測(cè)標(biāo)本,同時(shí)加入HBsAg-HRP進(jìn)行孵育,當(dāng)標(biāo)本中存在抗一HBs時(shí),該抗體與

包被HBsAg結(jié)合并與酶結(jié)合物形成HBsAg-抗HBs—HBsAg-HRP復(fù)合物。洗去游離反應(yīng)物,加入顯色劑后,將有明

顯顏色變化。若標(biāo)本中無抗-HBs時(shí),加入底物后沒有或只有很輕微的顏色變化,在一定范圍內(nèi),顏色的深淺變化

與標(biāo)本的含量呈正比。

【結(jié)果判斷】

未加終止液前,陽性孔呈藍(lán)色,陰性禮和空白孔無色,標(biāo)本孔如呈藍(lán)色即為陽性,顏色深淺與標(biāo)本中的抗HBs量

呈正比。

加終止液后,藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色,放入酶標(biāo)儀中檢測(cè),使用0D450-492nm波長(zhǎng)測(cè)定0D值,計(jì)算cutoff值,讀數(shù)需在

終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成.

cutoff值:C0V二陰性對(duì)照平均0D值X2。1

標(biāo)本0口值2c0V為陽性,標(biāo)本0口值WCOV為陰性。陰性對(duì)照0D值低于0。05,作0。05計(jì)算,高

于0。05按實(shí)際0D值計(jì)算。

免疫熒光色素技術(shù)

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化

合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:

①異硫篇酸熒光素(FITC):為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389。4,最大吸收光波

長(zhǎng)為490—495nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)520-530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,是應(yīng)用最廣泛的熒光素c其主要優(yōu)點(diǎn)是:

①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠包熒光少于紅色。

②四乙基羅丹明;③四甲基異硫氨酸羅丹明等。

【實(shí)臉原理】:利用受光標(biāo)記第二抗沐檢測(cè)未知Ag或未知Ab的方法。以檢測(cè)人血清中抗核抗體(ANA)為例。

小鼠肝細(xì)胞作為抗原片,將病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA,就會(huì)與細(xì)胞核成分發(fā)生特異性結(jié)合,

再加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG又可與ANA結(jié)合,在熒光顯微鏡下細(xì)胞核部位呈現(xiàn)熒光。

以檢測(cè)血清中ANA(抗核抗體)為例。

鼠肝細(xì)胞+ANA(1:5血清),一抗+抗人IgG—FITC,二抗T熒光顯微鏡下觀察T無熒光為陰性,有

熒光為陽性

【實(shí)臉結(jié)果】

細(xì)胞核發(fā)黃綠:色熒光為“+”,陽性待檢血清作進(jìn)一步稀釋后可測(cè)定效價(jià)。不發(fā)熒光為“一”

根據(jù)細(xì)胞核著染熒光的圖像,可區(qū)分為:

①均質(zhì)性:細(xì)胞核呈均勻一致的熒光。

②周邊性:核周呈現(xiàn)熒光.

③斑點(diǎn)型(顆粒型):核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光。

④核仁型:核仁部分呈現(xiàn)熒光。

⑤混合型:兩種以上核染色。

【注意事項(xiàng)】:抗原片要新鮮,厚薄一致,要盡量薄。待檢血清要新鮮.沖洗時(shí)要干凈,動(dòng)作要輕柔。觀察結(jié)果要

及時(shí),以免熒光漫滅.

補(bǔ)體CH50實(shí)驗(yàn)

【實(shí)驗(yàn)原理】:補(bǔ)體與抗體(溶血素)致敏的羊紅細(xì)胞接觸后,被激活(C1途徑),從而使致敏的SRBC溶解,其溶

血程度與補(bǔ)體量呈正比。因此,將新鮮待檢血清做不同稀釋后,與致敏紅細(xì)胞反應(yīng),測(cè)定溶血程度,以50%溶血時(shí)

的最小血清量判定終點(diǎn),可測(cè)知補(bǔ)體總?cè)苎钚?。?0$溶血判斷結(jié)果比100%溶血靈敏、準(zhǔn)確,

溶血素+SRBC,在補(bǔ)體的作用下T溶血

【實(shí)臉結(jié)果】

①對(duì)照管不溶;②目視比較,最接近標(biāo)準(zhǔn)管的一管。

根據(jù)U管中加入的血清量,求出總補(bǔ)沐值:補(bǔ)體活性(u/ml)=1/血清量(ml)X稀釋倍數(shù)(20)

③無法E測(cè)的,用722在542nm處讀T值也可。

大小吞噬實(shí)驗(yàn)

【實(shí)臉E的】:體內(nèi)具有吞噬功能的細(xì)胞稱為吞噬細(xì)胞,主要包括血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和組織中的巨

噬細(xì)胞。通過測(cè)定細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)可了解吞噬細(xì)胞的吞噬功能。

一、小吞噬試臉

【實(shí)臉原理】:中性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬殺菌功能,當(dāng)與顆粒性物質(zhì)(細(xì)菌等)混合孵育一定時(shí)間后,顆粒性物

質(zhì)被吞噬殺滅。根據(jù)吞噬率、吞噬指數(shù)可反映該細(xì)胞的吞噬功能。

【結(jié)果觀察】:鏡下可見RBC被染成紅色,其它為藍(lán)色,找到中性在細(xì)胞,計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)。

吞噬率(階二200個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/200X100%

吞噬指數(shù)二200個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬的細(xì)菌總數(shù)/200

二、大吞噬試驗(yàn)

【實(shí)聆原理】:血液中的大單核細(xì)胞游走至組織中形成巨噬細(xì)胞.,有吞嗤顆粒性物質(zhì)的功能.

【實(shí)臉結(jié)果】:鏡下可見梭形雞RBC被巨噬細(xì)胞吞入胞漿內(nèi)。

【注意事項(xiàng)】:

①、5%淀粉的作用:注射豚鼠后,誘導(dǎo)血液里的單核細(xì)胞進(jìn)入組織里,變成巨噬細(xì)胞。

②、5%雞RBC:有核,梭形,染色后核為藍(lán)色,周圍為紅色。

③、巨噬細(xì)胞在吞噬后形態(tài)會(huì)不規(guī)則,不易找到;所以可先找到有核的雞RBC,看是否被其他細(xì)胞包裹。如果包

裹物也有核,則為巨噬細(xì)胞.

PFC(溶血空斑形成試臉)

【定義】:溶血空斑形成試驗(yàn)是一種沐外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞(漿細(xì)胞)的方法。故又稱體外抗體形成細(xì)胞測(cè)

定技術(shù)。

【實(shí)臉Z的】:測(cè)定抗體生成細(xì)胞功能(B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力)。

【實(shí)驗(yàn)原理】:將經(jīng)SRBC免疫過的小鼠脾細(xì)胞與一定量的SRBC混合,在補(bǔ)體參與下,使抗體形成細(xì)胞周圍那些

受到抗體分子致敬的綿羊紅細(xì)胞溶解。

抗體生成細(xì)胞(已致敏)+Ag(SRBC)+補(bǔ)體T溶血

【結(jié)果判斷】取上清,722上413nm七色,檢測(cè)上清中SRBC裂解釋放的血紅蛋白量(以0D值反映補(bǔ)體溶解SRBC

的程度)。

淋巴細(xì)胞功能測(cè)定系列實(shí)驗(yàn)

一、淋巴細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)

淋巴細(xì)胞成功分離后,便于在體外對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞進(jìn)行鑒定、計(jì)數(shù)或功能測(cè)定;還可以用于E花環(huán)試驗(yàn)、淋巴細(xì)

胞轉(zhuǎn)化試臉及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(需無菌操作)。

淋巴細(xì)胞的方便來源是外周血,分離的原則是收率較高,純度較好,失活較低。無論采用哪種方法,應(yīng)最大可能保

持細(xì)胞應(yīng)有活性.

【原理】:分離的技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞的物理性狀和表面標(biāo)志設(shè)計(jì),根據(jù)不同實(shí)臉目的可采用密度梯度離心法、吸附

分離法和其它特殊分離法。本實(shí)驗(yàn)采用的是密度梯度離心法。該方法是根據(jù)各類血細(xì)胞比重的差異(外周血中各

種細(xì)胞的密度不同,入紅細(xì)胞密度為1。093,粒細(xì)胞為1.092,淋巴細(xì)胞為(1.074±0.001),利用比重介于某兩

類細(xì)胞之間的細(xì)胞分離液(等滲的果蔗糖一泛影葡胺,F(xiàn)icolI)對(duì)血液離心,使一定比重的血細(xì)胞依相應(yīng)的密度

梯度分布于不同的獨(dú)立帶,從而達(dá)到分離的目的。

二、E玫瑰花環(huán)形成試臉

【原理】:人T淋巴細(xì)胞表面的CD2分子即綿羊紅細(xì)胞受體(ER),在一定的實(shí)險(xiǎn)條件下,可與綿羊紅細(xì)胞(SRBC)

結(jié)合,形成玫瑰花結(jié),稱為EJ攵瑰花環(huán)試驗(yàn)(erythrocyte—roseetteformationtest)(>該試驗(yàn)常用于臨床檢測(cè)

人外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例,由此可間接反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀況。

總E花環(huán)和活躍花環(huán):

淋巴細(xì)胞與SRBC在4“C環(huán)境作用2h以上形成花環(huán),代表外周血中T細(xì)胞總數(shù)占淋巴細(xì)胞的百分比,成為總E

花環(huán)實(shí)驗(yàn)(Et).

如果兩和細(xì)胞懸液混合后,不經(jīng)37℃和4℃作用立即反應(yīng)仍有部分淋巴細(xì)胞形成花環(huán),稱為活躍花環(huán)(Ea),代

表對(duì)SRBC親和力高的一個(gè)T細(xì)胞亞群。

①總花環(huán)實(shí)臉(Et花環(huán))實(shí)驗(yàn)結(jié)果

計(jì)數(shù)花環(huán)個(gè)數(shù),結(jié)合3個(gè)以上的SRBC為一個(gè)花環(huán),計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞,計(jì)算E花環(huán)形成率,正常值為50%—80%。

E花環(huán)形成率=形成花結(jié)的淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)(形成花結(jié)+未形成花結(jié))X100%

②活躍花環(huán)試臉(Ea花環(huán)實(shí)臉結(jié)果)

Ea花環(huán)的結(jié)果代表T淋巴細(xì)胞中一類亞群,計(jì)數(shù)花環(huán)個(gè)數(shù),結(jié)合3個(gè)以上的SRBC為一個(gè)花環(huán),計(jì)算E花環(huán)形成率,

正常值為20%-30%。

E花環(huán)形成率=形成花結(jié)的淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)(形成花結(jié)+未形成花結(jié))X100%

三、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試臉

【原理】:T淋巴細(xì)胞與許多特異或非特異抗原在體外共同培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞的代謝和形態(tài)可以發(fā)生一系列的變化:細(xì)

胞形態(tài)向淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化;電荷的改變;細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成的增加。

【結(jié)果觀察】:

①轉(zhuǎn)化細(xì)胞:

淋巴母細(xì)胞:體積大,核膜清楚,染色質(zhì)疏松呈細(xì)網(wǎng)狀,核/細(xì)胞比例變小。

過渡型淋巴細(xì)胞:類似母細(xì)胞。

核絲分裂相細(xì)胞:核體呈現(xiàn)有絲分裂,胞內(nèi)可見組織染色體。

②未轉(zhuǎn)化細(xì)胞:

成熟小淋巴細(xì)胞:體積小,核染色體致密,核/細(xì)胞比例大。

細(xì)胞類別轉(zhuǎn)化細(xì)胞未轉(zhuǎn)化細(xì)胞

母細(xì)胞過渡型

細(xì)胞體積(um)212?2012-166-8

細(xì)胞大小增大增大不增大

染色質(zhì)疏松疏松密集

核仁1?4個(gè)有或無無

有絲分裂+或-,■

胞漿增色+++,

著色嗜堿嗜堿天青色

空泡+或?+或?,

偽足

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