實驗雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度第一頁，共二十六頁。一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測定的原理和方法3.掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法第二頁，共二十六頁。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對物質(zhì)進行定性分析1．原理第三頁，共二十六頁。2．主要方法：（1）比較吸收光譜曲線（2）比較最大吸收波長蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm，核酸的最大吸收波長為260nm。第四頁，共二十六頁。（3）比較吸光度的比值

純DNA第五頁，共二十六頁。（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進行定量分析第六頁，共二十六頁。 1．原理 Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強度；I為透射光強度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度第七頁，共二十六頁。2．常用方法 （1）標準曲線法

標準曲線與樣品的測定條件必須一致。第八頁，共二十六頁。（2）標準管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX，可求得CX。 （3）摩爾吸光系數(shù)法 C=A/

（

為L=1cm，C為1mol/L時的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。第九頁，共二十六頁。四、分光光度計的使用

第十頁，共二十六頁。

1．722型分光光度計的外形第十一頁，共二十六頁。2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動調(diào)整零透射比“波長設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長第十二頁，共二十六頁。3.樣品測試操作①打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長設(shè)置”按鈕將波長設(shè)置在您將要使用的分析波長位置上③打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路④蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零⑤取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比⑥按“方式鍵”（MODE）將測試方式設(shè)置為吸光度方式(A)⑦將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中⑧打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋⑨將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A⑩將被測溶液拉入光路中，此時，顯示器上所顯示是被測樣品的吸光度參數(shù)實驗完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。第十三頁，共二十六頁。返回光路第十四頁，共二十六頁。返回光路第十五頁，共二十六頁。返回第十六頁，共二十六頁。微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中加入強堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中，然后再用標準酸溶液進行滴定，滴定所用無機酸的量(mol)相當于被測樣品中氨的量(mol)，根據(jù)所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。因為蛋白質(zhì)含氮量通常在16%左右，所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。第十七頁，共二十六頁。Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)濃度

蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(—CO—NH—)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進Folin試劑(磷鉬酸—磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸—磷鎢酸試劑，生成藍色物質(zhì)。在一定條件下，藍色強度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。第十八頁，共二十六頁。紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度

由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。第十九頁，共二十六頁。總蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）

準確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是20－2000μg/ml；MicroBCA試劑測定范圍是0.5-20μg/ml

快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便

經(jīng)濟實用：除試管外，測定可在微孔板中進行，大大節(jié)約樣品和試劑用量

不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響

檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍第二十頁，共二十六頁。

基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。第二十一頁，共二十六頁?？捡R斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)濃度

考馬斯亮藍在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。第二十二頁，共二十六頁。CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第二十三頁，共二十六頁。（二）雙縮脲法測定蛋白質(zhì)

H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3

雙縮脲雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在堿性條件下與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法測定蛋白質(zhì)范圍1-10mg

第二十四頁，共二十六頁。三、操作步驟1.取15支試管，按下表編號、加試劑管號0123456樣品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白體積(mL)00.30.61.21.82.43.0－待測液體積(mL)