人結(jié)腸腺癌裸鼠模型活體近紅外熒光成像技術(shù)的應(yīng)用與探索一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）數(shù)據(jù)顯示，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均位居前列，每年新增病例約185萬，死亡病例約91萬，分別占所有癌癥的一定比例。在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，已成為發(fā)病率第三、死亡率第五的惡性腫瘤，且患者診斷時(shí)年齡較輕，晚期比例較高。結(jié)腸癌不僅給患者帶來身體上的痛苦，如腹痛、腹脹、便血、貧血等癥狀，影響生活質(zhì)量，還會導(dǎo)致器官功能損傷衰竭，甚至危及生命，同時(shí)也給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在結(jié)腸癌的研究中，人結(jié)腸腺癌裸鼠模型發(fā)揮著不可或缺的作用。由于裸鼠缺乏胸腺，T淋巴細(xì)胞功能缺陷，對異種移植的腫瘤組織幾乎沒有免疫排斥反應(yīng)，因此將人結(jié)腸腺癌細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，能夠構(gòu)建出模擬人類結(jié)腸癌生長和發(fā)展過程的模型。通過該模型，科研人員可以深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，如腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，探索基因、信號通路等在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，該模型也是評估抗癌藥物療效和安全性的重要工具，能夠?yàn)樾滤幯邪l(fā)提供關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選出更有效的治療方案，為臨床治療提供有力的支持?；铙w近紅外熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)，為結(jié)腸癌研究帶來了新的突破。傳統(tǒng)的檢測方法，如結(jié)腸鏡檢查、CT、MRI等，在檢測微小病灶、實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤動態(tài)變化等方面存在一定的局限性。而近紅外熒光成像技術(shù)利用近紅外熒光探針與腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的特定靶點(diǎn)結(jié)合，在近紅外光的激發(fā)下發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的可視化檢測。該技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率、實(shí)時(shí)成像、對生物體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，能夠在活體狀態(tài)下實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及藥物在體內(nèi)的分布和代謝情況。將活體近紅外熒光成像技術(shù)應(yīng)用于人結(jié)腸腺癌裸鼠模型，能夠更加直觀、準(zhǔn)確地觀察結(jié)腸癌的發(fā)展過程，為結(jié)腸癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評估提供了新的技術(shù)手段，具有重要的研究價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型構(gòu)建方面，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究并取得顯著成果。早在20世紀(jì)，國外就有研究人員將人結(jié)腸腺癌細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，成功構(gòu)建出皮下移植瘤模型，為后續(xù)結(jié)腸癌研究奠定了基礎(chǔ)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，如今除了皮下移植瘤模型，原位種植瘤模型也逐漸成為研究熱點(diǎn)。例如，有研究將人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW1116接種于裸鼠皮下，形成穩(wěn)定傳代的皮下種植瘤后，再取該腫瘤組織塊原位種植于裸鼠結(jié)腸壁，成功建立了類似于臨床的結(jié)腸癌模型，該模型的原位種植成瘤率為100%，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率100%，腹膜轉(zhuǎn)移率為91.7%，肝轉(zhuǎn)移率為75.0%，腹水出現(xiàn)率為25.0%，荷瘤裸鼠晚期出現(xiàn)消瘦和全身衰竭，中位生存期為10周，其生物學(xué)行為與臨床病程非常相似，為研究結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了理想的動物模型。國內(nèi)學(xué)者也在不斷優(yōu)化模型構(gòu)建方法，通過改進(jìn)細(xì)胞接種方式、選擇合適的裸鼠品系和調(diào)整飼養(yǎng)環(huán)境等，提高模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性。有研究采用組織塊法建立皮下移植瘤模型，4周后隨機(jī)挑選部分裸小鼠切除腫瘤組織，建立裸小鼠人結(jié)腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模型，該模型模擬了臨床腫瘤根除術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程，為研究結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和術(shù)后抗轉(zhuǎn)移治療提供了可靠的動物模型。在近紅外熒光成像技術(shù)應(yīng)用于結(jié)腸癌研究方面，國外起步較早，已經(jīng)在熒光探針的研發(fā)和成像設(shè)備的改進(jìn)上取得了諸多突破。一些研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了多種特異性針對結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)的近紅外熒光探針，如靶向CD24分子的AntiCD24-IRDye800CW熒光探針，通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)以及臨床標(biāo)本孵育實(shí)驗(yàn)，證明了該探針在檢測結(jié)直腸癌及其癌前病變方面展現(xiàn)出高靈敏度和特異性，能夠檢測出小于1毫米的微小病變。在成像設(shè)備方面，不斷提高成像的分辨率和靈敏度，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的更精準(zhǔn)檢測。國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究也發(fā)展迅速，許多科研團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)新型的近紅外熒光探針和探索其在結(jié)腸癌診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用。江西中醫(yī)藥大學(xué)癌癥研究中心開發(fā)了一種新型近紅外分子熒光探針MPA?PEG4?r-ABT-510，其能特異性靶向高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中的膜受體CD36，在皮下、原位和肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌小鼠模型中具有出色的信噪比和選擇性，有望用于結(jié)直腸癌原位及肝轉(zhuǎn)移術(shù)中導(dǎo)航。中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院李堅(jiān)主任醫(yī)師團(tuán)隊(duì)與中國科學(xué)院分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作，應(yīng)用自主研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的DPM公司“慧眼”設(shè)備，進(jìn)行了基于近紅外熒光成像技術(shù)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶術(shù)中可視化新方法的前瞻性隨機(jī)對照臨床研究，結(jié)果表明該技術(shù)能夠檢出的人均肝內(nèi)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)更多，患者的住院時(shí)間更短，一年期復(fù)發(fā)率更低，為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療提供了新的有效手段。然而，目前將活體近紅外熒光成像技術(shù)應(yīng)用于人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的研究仍存在一些不足之處。一方面，熒光探針的特異性和穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高，部分探針可能存在非特異性結(jié)合或在體內(nèi)代謝過快等問題，影響成像效果和準(zhǔn)確性。另一方面，成像技術(shù)在檢測深度和分辨率上也存在一定局限，對于深部腫瘤的檢測能力有限，難以滿足對腫瘤全面、精準(zhǔn)檢測的需求。此外，如何將裸鼠模型中的研究成果更好地轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，也是當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)之一。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過構(gòu)建人結(jié)腸腺癌裸鼠模型，系統(tǒng)地探究活體近紅外熒光成像技術(shù)在結(jié)腸癌研究中的應(yīng)用，具體目的如下：一是優(yōu)化人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，提高模型的穩(wěn)定性、重復(fù)性以及與臨床結(jié)腸癌的相似性，為后續(xù)成像研究提供可靠的動物模型；二是篩選和開發(fā)具有高特異性、高穩(wěn)定性的近紅外熒光探針，使其能夠精準(zhǔn)地靶向結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)，減少非特異性結(jié)合，提高成像的準(zhǔn)確性和清晰度；三是運(yùn)用活體近紅外熒光成像技術(shù)，實(shí)時(shí)、動態(tài)地監(jiān)測人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，獲取腫瘤在不同發(fā)展階段的生物學(xué)信息，為深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供可視化的數(shù)據(jù)支持；四是通過對裸鼠模型的成像研究，評估近紅外熒光成像技術(shù)在結(jié)腸癌早期診斷、治療效果監(jiān)測以及預(yù)后評估等方面的應(yīng)用價(jià)值，為該技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在熒光探針的設(shè)計(jì)與合成上，創(chuàng)新性地將兩種或多種具有不同靶向功能的分子片段進(jìn)行組合，構(gòu)建出多功能復(fù)合熒光探針。這種探針不僅能夠同時(shí)靶向多個(gè)結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)，提高檢測的準(zhǔn)確性和特異性，還能通過不同分子片段之間的協(xié)同作用，增強(qiáng)探針與腫瘤細(xì)胞的親和力，減少在體內(nèi)的非特異性分布。在成像技術(shù)方面，結(jié)合多模態(tài)成像原理，將近紅外熒光成像與其他成像技術(shù)，如磁共振成像（MRI）或超聲成像相結(jié)合。利用MRI的高分辨率和軟組織分辨能力，以及超聲成像的實(shí)時(shí)性和便捷性，彌補(bǔ)近紅外熒光成像在檢測深度和解剖結(jié)構(gòu)定位上的不足，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的全方位、多層次成像，為結(jié)腸癌的研究提供更全面、準(zhǔn)確的信息。此外，本研究還將引入機(jī)器學(xué)習(xí)算法對成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。通過建立基于大量成像數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，實(shí)現(xiàn)對腫瘤特征的自動識別和量化分析，提高數(shù)據(jù)分析的效率和準(zhǔn)確性，挖掘出傳統(tǒng)分析方法難以發(fā)現(xiàn)的潛在信息，為結(jié)腸癌的診斷和治療決策提供更科學(xué)的依據(jù)。二、人結(jié)腸腺癌裸鼠模型構(gòu)建2.1裸鼠選擇依據(jù)與準(zhǔn)備工作裸鼠，因其先天性胸腺缺失，T淋巴細(xì)胞功能缺陷，免疫系統(tǒng)存在嚴(yán)重缺陷，成為構(gòu)建人結(jié)腸腺癌動物模型的理想選擇。在眾多的免疫缺陷小鼠中，裸鼠是最早被發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用最為廣泛的品系之一。其獨(dú)特的免疫缺陷特性，使得對異種移植的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長和發(fā)展提供一個(gè)相對“友好”的環(huán)境，從而有效模擬人類結(jié)腸癌在體內(nèi)的生物學(xué)行為。與其他免疫缺陷小鼠相比，如SCID小鼠（重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠）雖然也具有嚴(yán)重的免疫缺陷，但裸鼠在成本、飼養(yǎng)難度以及實(shí)驗(yàn)操作的便利性等方面具有明顯優(yōu)勢，這使得裸鼠在腫瘤研究領(lǐng)域中一直占據(jù)著重要地位。本實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間。這一年齡段和體重范圍的裸鼠，身體各項(xiàng)機(jī)能處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，既具備一定的生長和代謝能力，能夠支持腫瘤的生長，又不會因年齡過大或過小而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。同時(shí)，該年齡段裸鼠的個(gè)體差異相對較小，有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠需在特定病原體（SPF）級動物房中飼養(yǎng)，動物房需嚴(yán)格控制溫度在22-25℃，濕度保持在40%-60%，維持12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律。這樣的環(huán)境條件能夠最大程度地減少外界因素對裸鼠生理狀態(tài)的影響，保證裸鼠健康，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。裸鼠飼養(yǎng)所用的飼料和飲用水均需經(jīng)過高壓滅菌處理，以防止微生物污染，避免因感染導(dǎo)致裸鼠免疫力波動，影響腫瘤模型的構(gòu)建。在實(shí)驗(yàn)前一周，對裸鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，讓裸鼠適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境，減少因環(huán)境變化引起的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等指標(biāo)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并剔除異常裸鼠，確保參與實(shí)驗(yàn)的裸鼠均處于良好的健康狀態(tài)。2.2結(jié)腸腺癌細(xì)胞獲取與處理本研究選用的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系為HCT116，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞系具有較高的增殖活性和侵襲能力，能夠較好地模擬人結(jié)腸腺癌的生物學(xué)行為，在結(jié)腸癌研究中應(yīng)用廣泛。HCT116細(xì)胞系源自一名患有結(jié)直腸癌的51歲男性患者的腫瘤組織，其保留了結(jié)腸腺癌細(xì)胞的多種特性，如表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白，具有較強(qiáng)的腫瘤形成能力和轉(zhuǎn)移潛能，這些特性使得HCT116細(xì)胞系成為構(gòu)建人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的理想細(xì)胞來源。細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將HCT116細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，胎牛血清為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，如多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)以及胰島素樣生長因子等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；青鏈霉素雙抗則主要用于防止細(xì)菌污染，青霉素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成來發(fā)揮抗菌作用，鏈霉素則作用于細(xì)菌的核糖體，抑制蛋白質(zhì)的合成，二者協(xié)同作用，為細(xì)胞培養(yǎng)提供一個(gè)相對無菌的環(huán)境。培養(yǎng)箱中的37℃模擬人體體溫，是細(xì)胞生長的適宜溫度，在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶能夠保持最佳的活性，維持細(xì)胞正常的代謝和生理功能；5%CO?的環(huán)境則主要用于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，CO?溶解在培養(yǎng)基中形成碳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽組成緩沖體系，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，使其保持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，有利于細(xì)胞的生長和代謝。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，且融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代操作。在傳代過程中，首先吸棄培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用預(yù)溫至37℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。PBS是一種與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相似的緩沖溶液，其主要成分包括氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉等，能夠維持細(xì)胞的滲透壓和pH值穩(wěn)定，在沖洗過程中對細(xì)胞的損傷較小。沖洗完畢后，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。胰蛋白酶能夠特異性地水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)連接，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來；EDTA則可以與細(xì)胞外液中的鈣離子和鎂離子結(jié)合，破壞細(xì)胞間的連接，增強(qiáng)胰蛋白酶的消化效果。在消化過程中，需在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變圓、間隙增大，且部分細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。胎牛血清中的蛋白質(zhì)可以與胰蛋白酶結(jié)合，使其失去活性，從而終止消化過程，避免過度消化對細(xì)胞造成損傷。隨后，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。離心的目的是使細(xì)胞沉淀下來，以便去除上清液中的胰蛋白酶、細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。離心結(jié)束后，棄去上清液，加入適量新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基至合適體積，輕輕搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在傳代過程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，所有操作均需在超凈工作臺中進(jìn)行，使用的器械和試劑都要經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理，避免微生物污染細(xì)胞，影響細(xì)胞的生長和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，操作過程要輕柔，避免對細(xì)胞造成機(jī)械損傷，保證細(xì)胞的活性和正常生物學(xué)特性。2.3模型構(gòu)建具體方法與流程2.3.1皮下接種法皮下接種法是構(gòu)建人結(jié)腸腺癌裸鼠模型較為常用的方法之一，具有操作相對簡便、成瘤率較高等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行皮下接種前，需先將處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，然后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的PBS重懸細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍，一般為5×10^6-1×10^7個(gè)/mL。將裸鼠用異氟烷氣體麻醉，麻醉深度以裸鼠失去自主活動能力、呼吸平穩(wěn)為宜。異氟烷是一種新型的吸入性麻醉劑，具有麻醉誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、對呼吸道刺激性小等優(yōu)點(diǎn)，能夠在保證實(shí)驗(yàn)操作順利進(jìn)行的同時(shí)，最大程度地減少對裸鼠生理狀態(tài)的影響。將麻醉后的裸鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，用75%酒精棉球?qū)ζ溆乙覆炕虮巢康冉臃N部位進(jìn)行消毒，消毒范圍直徑約3-5cm，以防止細(xì)菌感染，確保接種部位的無菌環(huán)境。使用1mL注射器吸取適量的細(xì)胞懸液，在接種部位以45度角斜行刺入皮下，然后將針頭沿皮下組織潛行一段距離，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射量一般為0.1-0.2mL。注射完畢后，迅速拔出注射器，用棉球輕壓注射部位片刻，以防止細(xì)胞懸液外溢。接種完成后，將裸鼠置于溫暖、安靜的環(huán)境中蘇醒，密切觀察其生命體征，如呼吸、心跳、體溫等，確保裸鼠平穩(wěn)度過麻醉恢復(fù)期。蘇醒后的裸鼠放回SPF級動物房飼養(yǎng)，每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化以及接種部位有無紅腫、破潰等異常情況。一般在接種后7-10天左右，可在接種部位觸及明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間的推移，腫瘤逐漸生長增大。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到一定大小時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如腫瘤組織取材、藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)等。在飼養(yǎng)過程中，需定期更換墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生，同時(shí)給予充足的食物和飲水，以滿足裸鼠的生長和代謝需求。2.3.2原位移植法原位移植法是將人結(jié)腸腺癌細(xì)胞或腫瘤組織直接移植到裸鼠結(jié)腸原位，該方法能夠更好地模擬結(jié)腸癌在人體內(nèi)的生長微環(huán)境和生物學(xué)行為，對于研究結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等機(jī)制具有重要意義。在進(jìn)行原位移植前，同樣需對HCT116細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)和重懸，制備成濃度為1×10^7-2×10^7個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。此外，也可選用人結(jié)腸腺癌組織塊進(jìn)行原位移植。將手術(shù)切除獲取的新鮮人結(jié)腸腺癌組織，用無菌PBS沖洗3-5次，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后在無菌操作臺上將其切成1-2mm3大小的組織塊備用。將裸鼠用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，劑量為30-50mg/kg。戊巴比妥鈉是一種常用的巴比妥類麻醉劑，通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動來實(shí)現(xiàn)麻醉效果，具有麻醉效果穩(wěn)定、作用時(shí)間適中的特點(diǎn)。麻醉成功后，將裸鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，用碘伏對其腹部進(jìn)行消毒，消毒范圍從劍突至恥骨聯(lián)合，然后鋪無菌手術(shù)巾。在無菌條件下，沿腹部正中或左下腹旁正中做一長約1-2cm的切口，鈍性分離腹壁肌肉，打開腹腔。輕輕拉出結(jié)腸，在距離肛門2-3cm處用眼科剪剪一小口，將預(yù)先準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液或腫瘤組織塊用微量注射器或鑷子緩慢植入結(jié)腸壁內(nèi)，然后用5-0絲線將切口縫合。為防止腫瘤組織塊或細(xì)胞懸液漏出，可在縫合處涂抹少量的醫(yī)用生物膠。醫(yī)用生物膠能夠在組織表面迅速形成一層薄膜，起到封閉創(chuàng)口、促進(jìn)愈合的作用?？p合完畢后，用溫生理鹽水沖洗腹腔，將結(jié)腸輕柔地放回腹腔內(nèi)，依次縫合腹壁肌肉和皮膚。術(shù)后，將裸鼠置于37℃的恒溫箱中蘇醒，待其蘇醒后放回SPF級動物房飼養(yǎng)。術(shù)后給予裸鼠適當(dāng)?shù)目股兀缜嗝顾鼗蝾^孢菌素，肌肉注射或飲水給藥，以預(yù)防感染。每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化、排便情況以及腹部有無異常等。隨著腫瘤的生長，裸鼠可能會出現(xiàn)消瘦、貧血、腹部膨隆、便血等癥狀，這些癥狀與臨床結(jié)腸癌患者的表現(xiàn)相似。一般在原位移植后2-3周，可通過觸診、影像學(xué)檢查（如超聲、CT等）等方法觀察腫瘤的生長情況。當(dāng)腫瘤生長至合適大小時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如對腫瘤組織進(jìn)行病理分析、檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況等。2.4模型質(zhì)量評估指標(biāo)與方法成瘤率是衡量模型構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其計(jì)算公式為成瘤動物數(shù)量與接種動物總數(shù)的比值，以百分比表示。在本研究中，通過定期觸診裸鼠接種部位，觀察是否出現(xiàn)可觸及的腫瘤結(jié)節(jié)來判斷是否成瘤。一般在接種后7-10天開始進(jìn)行觸診，此后每周觸診2-3次，記錄成瘤的裸鼠數(shù)量，并計(jì)算成瘤率。較高的成瘤率表明模型構(gòu)建方法的可靠性和穩(wěn)定性較好，如皮下接種法若能達(dá)到80%以上的成瘤率，則說明該方法在本實(shí)驗(yàn)條件下具有較高的成功率。腫瘤生長速度反映了腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖能力，對研究結(jié)腸癌的生物學(xué)行為和藥物療效評估具有重要意義。使用游標(biāo)卡尺定期測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），一般每周測量2-3次，按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。通過繪制腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長曲線，可以直觀地觀察腫瘤的生長趨勢。在分析生長曲線時(shí)，關(guān)注腫瘤的潛伏期（從接種到可測量腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間）、對數(shù)生長期（腫瘤體積快速增長的階段）以及平臺期（腫瘤生長趨于穩(wěn)定的階段）等特征。若腫瘤在接種后較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入對數(shù)生長期，且生長速度較快，表明腫瘤細(xì)胞的增殖活性較強(qiáng)；而生長曲線的穩(wěn)定性也反映了模型的重復(fù)性，多次實(shí)驗(yàn)得到相似的生長曲線說明模型具有較好的重復(fù)性。腫瘤的組織學(xué)特征是評估模型與臨床結(jié)腸癌相似性的重要依據(jù)。當(dāng)腫瘤生長至一定大小或在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等處理后，制成石蠟切片。對石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、排列方式、細(xì)胞核特征以及間質(zhì)成分等。人結(jié)腸腺癌的典型組織學(xué)特征表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞呈腺管狀或乳頭狀排列，細(xì)胞核大而深染，核仁明顯，可見核分裂象，間質(zhì)中可見血管、纖維組織等。通過與臨床結(jié)腸癌組織的病理特征進(jìn)行對比，判斷模型的組織學(xué)相似性。同時(shí)，還可采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測腫瘤組織中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，如細(xì)胞角蛋白、癌胚抗原（CEA）、Ki-67等。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在人結(jié)腸腺癌中呈陽性表達(dá)，可用于確認(rèn)腫瘤細(xì)胞的上皮來源；CEA是一種常用的腫瘤標(biāo)志物，在結(jié)腸癌組織中常高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)；Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其陽性表達(dá)率反映了腫瘤細(xì)胞的增殖活性。通過檢測這些標(biāo)志物的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證模型的生物學(xué)特性與臨床結(jié)腸癌的一致性。轉(zhuǎn)移情況是評估人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的重要指標(biāo)，因?yàn)檗D(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的主要原因之一。在實(shí)驗(yàn)過程中，定期觀察裸鼠的行為、體重變化等全身狀況，當(dāng)裸鼠出現(xiàn)消瘦、精神萎靡、活動減少等癥狀時(shí)，可能提示腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移或進(jìn)展。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對裸鼠進(jìn)行解剖，仔細(xì)觀察肝臟、肺部、淋巴結(jié)等常見轉(zhuǎn)移部位是否有轉(zhuǎn)移灶形成。對于肝臟和肺部，可通過肉眼觀察其表面是否有結(jié)節(jié)狀腫物，若發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)節(jié)，進(jìn)一步進(jìn)行組織切片和病理檢查，以確定是否為轉(zhuǎn)移瘤。對于淋巴結(jié)，可通過觸摸體表淋巴結(jié)或解剖取出腸系膜淋巴結(jié)等進(jìn)行檢查，觀察其大小、質(zhì)地、顏色等變化，若淋巴結(jié)腫大、變硬，也需進(jìn)行病理檢查以明確是否有腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，還可采用免疫組織化學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測轉(zhuǎn)移灶中腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，與原發(fā)腫瘤進(jìn)行對比，確認(rèn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。通過對轉(zhuǎn)移情況的評估，能夠更全面地了解結(jié)腸癌在裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)行為，為研究結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療提供重要信息。三、活體近紅外熒光成像技術(shù)原理與操作3.1近紅外熒光成像基本原理活體近紅外熒光成像技術(shù)的核心基于熒光物質(zhì)的特性。當(dāng)熒光物質(zhì)受到特定波長的光激發(fā)時(shí)，其分子中的電子會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定，會迅速通過輻射躍遷的方式回到基態(tài)，在此過程中以光子的形式釋放出能量，從而產(chǎn)生熒光。而近紅外熒光成像所涉及的熒光物質(zhì)，其激發(fā)光和發(fā)射光均處于近紅外光波段，通常為700-1700nm。這一特殊的波段選擇賦予了該技術(shù)在生物體內(nèi)成像的顯著優(yōu)勢。從組織穿透能力來看，生物組織對近紅外光的吸收和散射相對較弱。在可見光和紫外光波段，生物組織中的血紅蛋白、水、脂質(zhì)等成分對光的吸收較強(qiáng)，導(dǎo)致光在組織中的傳播距離較短。而近紅外光能夠更好地穿透組織，其在生物組織中的衰減系數(shù)明顯低于可見光和紫外光。例如，在人體組織中，近紅外光的穿透深度可達(dá)數(shù)厘米，這使得近紅外熒光成像能夠深入生物體內(nèi)部，對深層組織和器官中的目標(biāo)進(jìn)行檢測。在檢測深部腫瘤時(shí)，近紅外熒光成像能夠有效地穿透皮膚、肌肉等組織，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的可視化，為腫瘤的早期診斷和定位提供了可能。在背景熒光干擾方面，生物體內(nèi)的自發(fā)熒光主要來自于內(nèi)源性熒光物質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白、NADH等。這些物質(zhì)在可見光激發(fā)下會產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號，從而對檢測信號形成干擾，降低成像的信噪比。而近紅外光激發(fā)下，生物體內(nèi)的自發(fā)熒光強(qiáng)度顯著降低。近紅外熒光成像能夠在較低的背景噪聲下獲取清晰的熒光信號，提高成像的靈敏度和準(zhǔn)確性。在對裸鼠體內(nèi)的人結(jié)腸腺癌進(jìn)行成像時(shí)，近紅外熒光成像可以有效減少裸鼠自身組織的自發(fā)熒光干擾，更清晰地顯示腫瘤的位置、大小和形態(tài)。3.2熒光探針選擇與標(biāo)記策略在活體近紅外熒光成像技術(shù)中，熒光探針的選擇至關(guān)重要，它直接影響成像的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。目前，常用的近紅外熒光探針主要包括有機(jī)小分子熒光染料、熒光量子點(diǎn)、熒光蛋白等。有機(jī)小分子熒光染料是一類具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的化合物，其熒光特性源于分子內(nèi)的電子躍遷。例如，吲哚菁綠（ICG）是一種廣泛應(yīng)用的近紅外有機(jī)小分子熒光染料，其最大吸收波長約為780nm，最大發(fā)射波長在820nm左右。ICG具有良好的水溶性和生物相容性，能夠迅速被肝臟攝取并通過膽汁排泄，在體內(nèi)代謝相對較快，這使得它在肝臟相關(guān)疾病的診斷和手術(shù)導(dǎo)航中具有重要應(yīng)用價(jià)值。在結(jié)腸癌研究中，ICG可通過與腫瘤細(xì)胞表面的某些受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的熒光標(biāo)記。然而，ICG也存在一些局限性，如光穩(wěn)定性相對較差，在光照下容易發(fā)生熒光淬滅，導(dǎo)致成像信號減弱，且其斯托克斯位移較小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜存在一定程度的重疊，可能會影響成像的分辨率和準(zhǔn)確性。熒光量子點(diǎn)是一種由半導(dǎo)體材料制成的納米級熒光顆粒，其熒光性質(zhì)源于量子限域效應(yīng)。量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)特性，如熒光發(fā)射波長可通過調(diào)節(jié)顆粒尺寸進(jìn)行精確控制，具有較寬的激發(fā)光譜和較窄的發(fā)射光譜，這使得它在多色成像中具有明顯優(yōu)勢。硫化鎘（CdS）量子點(diǎn)在近紅外區(qū)域有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，其熒光穩(wěn)定性高，不易發(fā)生光漂白現(xiàn)象。在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型成像中，量子點(diǎn)可以通過表面修飾連接特異性的靶向分子，如抗體或核酸適配體，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記。但是，量子點(diǎn)的主要問題在于其潛在的毒性，由于量子點(diǎn)通常含有重金屬元素，如鎘、汞等，這些元素在生物體內(nèi)可能會釋放出來，對生物體產(chǎn)生毒性作用，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和安全性。熒光蛋白是一類能夠自身發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，如綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其衍生物等。其中，一些近紅外熒光蛋白，如iRFP系列，具有在近紅外區(qū)域發(fā)射熒光的特性。iRFP720的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別位于700-720nm和740-760nm，它可以通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，使腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的標(biāo)記。熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)是生物相容性好，對細(xì)胞的生理功能影響較小，且可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。然而，熒光蛋白的表達(dá)水平和熒光強(qiáng)度可能會受到細(xì)胞生理狀態(tài)和基因調(diào)控的影響，導(dǎo)致成像信號的穩(wěn)定性和一致性較差，同時(shí)，熒光蛋白的標(biāo)記過程相對復(fù)雜，需要進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染操作，對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高。選擇合適的熒光探針需綜合考慮多方面因素。首先，探針的熒光特性是關(guān)鍵因素之一。高熒光量子產(chǎn)率意味著探針在激發(fā)光照射下能夠更有效地產(chǎn)生熒光信號，提高成像的靈敏度。熒光穩(wěn)定性好的探針能夠在長時(shí)間成像過程中保持熒光強(qiáng)度的相對穩(wěn)定，減少因熒光淬滅導(dǎo)致的信號損失。如在對人結(jié)腸腺癌裸鼠模型進(jìn)行長期監(jiān)測時(shí)，選擇光穩(wěn)定性高的熒光探針可以確保在不同時(shí)間點(diǎn)獲取的成像數(shù)據(jù)具有可比性。其次，探針的特異性至關(guān)重要。理想的熒光探針應(yīng)能夠特異性地與結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，如腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原、過度表達(dá)的受體或腫瘤微環(huán)境中的某些標(biāo)志物等。以靶向表皮生長因子受體（EGFR）的熒光探針為例，EGFR在許多結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，探針與EGFR特異性結(jié)合后，能夠在腫瘤部位產(chǎn)生明顯的熒光信號，而在正常組織中信號較弱，從而提高成像的對比度和準(zhǔn)確性，有助于準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織與正常組織。此外，探針的生物相容性和體內(nèi)代謝特性也不容忽視。生物相容性好的探針能夠減少對裸鼠機(jī)體的毒副作用，保證實(shí)驗(yàn)動物的健康，同時(shí)也有利于獲得真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在體內(nèi)代謝方面，探針應(yīng)具有合適的代謝速率，既能夠在體內(nèi)保持一定時(shí)間的熒光信號，以便進(jìn)行成像觀察，又不會在體內(nèi)長時(shí)間積累，對機(jī)體產(chǎn)生潛在危害。例如，一些探針能夠在完成成像任務(wù)后，通過腎臟或肝臟等器官迅速代謝排出體外，這樣的探針更適合用于活體成像研究。對腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，可采用多種策略。對于有機(jī)小分子熒光染料和熒光量子點(diǎn)，可以通過化學(xué)偶聯(lián)的方式連接靶向分子。以抗體-熒光染料偶聯(lián)物為例，首先將熒光染料通過化學(xué)修飾引入活性基團(tuán)，如N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯，然后與抗體分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而制備出抗體-熒光染料偶聯(lián)物。在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中，將抗結(jié)腸癌特異性抗原的抗體與熒光染料偶聯(lián)后，通過尾靜脈注射或局部注射的方式引入裸鼠體內(nèi)，偶聯(lián)物中的抗體能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原，使熒光染料富集在腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的標(biāo)記。對于熒光蛋白，可以利用基因工程技術(shù)將熒光蛋白基因與腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因融合。將iRFP720基因與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)基因連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法將重組載體導(dǎo)入人結(jié)腸腺癌細(xì)胞中。在細(xì)胞內(nèi)，重組載體能夠整合到細(xì)胞基因組中，隨著細(xì)胞的增殖，熒光蛋白基因持續(xù)表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)出近紅外熒光。這種標(biāo)記策略的優(yōu)點(diǎn)是能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程的長期監(jiān)測，但基因轉(zhuǎn)染過程較為復(fù)雜，轉(zhuǎn)染效率可能受到多種因素的影響，需要進(jìn)行優(yōu)化和篩選。3.3成像設(shè)備與儀器參數(shù)設(shè)置本研究采用IVISLuminaXRMS小動物分子成像儀進(jìn)行活體近紅外熒光成像。該成像儀配備高靈敏度的制冷CCD相機(jī)，能夠?qū)O微弱的熒光信號進(jìn)行有效捕捉。其具備的大視野成像能力，可一次對多只裸鼠進(jìn)行成像，提高實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)，該設(shè)備還具備多種成像模式，可滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。在進(jìn)行近紅外熒光成像時(shí)，需要對多個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行合理設(shè)置，以確保獲得高質(zhì)量的成像結(jié)果。曝光時(shí)間是成像過程中一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它直接影響熒光信號的采集量。若曝光時(shí)間過短，熒光信號可能無法被充分捕捉，導(dǎo)致圖像信號強(qiáng)度低，難以準(zhǔn)確分析；而曝光時(shí)間過長，則可能會使圖像出現(xiàn)過曝現(xiàn)象，丟失部分細(xì)節(jié)信息。在本研究中，針對人結(jié)腸腺癌裸鼠模型，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對不同曝光時(shí)間（5s、10s、15s、20s、30s）進(jìn)行了測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)曝光時(shí)間為15s時(shí)，能夠在有效避免過曝的前提下，獲得清晰且信號強(qiáng)度適中的圖像。在觀察裸鼠皮下腫瘤時(shí)，15s曝光時(shí)間下，腫瘤部位的熒光信號清晰可辨，與周圍正常組織形成明顯對比，便于后續(xù)對腫瘤大小、形狀及位置的分析。激發(fā)光強(qiáng)度對成像效果也有著重要影響。激發(fā)光強(qiáng)度過低，無法有效激發(fā)熒光探針，導(dǎo)致熒光信號弱；強(qiáng)度過高則可能引起熒光淬滅，同樣影響成像質(zhì)量。該成像儀的激發(fā)光強(qiáng)度可在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，本研究通過實(shí)驗(yàn)對不同激發(fā)光強(qiáng)度（50%、60%、70%、80%、90%）進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度設(shè)置為70%時(shí)，成像效果最佳。在該強(qiáng)度下，熒光探針能夠被充分激發(fā)，同時(shí)未出現(xiàn)明顯的熒光淬滅現(xiàn)象。在檢測裸鼠原位腫瘤時(shí)，70%激發(fā)光強(qiáng)度下，腫瘤組織的熒光信號均勻且明亮，能夠清晰顯示腫瘤的邊界和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，為腫瘤的定位和定性分析提供了良好的基礎(chǔ)。濾光片的選擇也是成像參數(shù)設(shè)置中的重要環(huán)節(jié)。不同的熒光探針具有特定的激發(fā)和發(fā)射波長，需要選擇與之匹配的濾光片，以確保能夠準(zhǔn)確采集到目標(biāo)熒光信號，同時(shí)減少背景噪聲的干擾。本研究中選用的近紅外熒光探針的最大發(fā)射波長為800nm，因此選擇中心波長為800nm，帶寬為10nm的帶通濾光片。該濾光片能夠有效透過目標(biāo)熒光信號，同時(shí)阻擋其他波長的光線，提高成像的信噪比。在實(shí)際成像過程中，使用該濾光片后，圖像中的背景噪聲明顯降低，腫瘤部位的熒光信號更加突出，使得腫瘤的檢測和分析更加準(zhǔn)確。3.4成像操作流程與注意要點(diǎn)成像操作前，先將裸鼠用異氟烷氣體麻醉，置于麻醉誘導(dǎo)箱中，設(shè)置異氟烷濃度為3%-5%，氧氣流量為1-2L/min，待裸鼠麻醉后（一般需1-3分鐘），將其轉(zhuǎn)移至成像儀的載物臺上，用膠帶固定四肢，確保裸鼠在成像過程中保持靜止。同時(shí)，開啟成像儀配套的加熱裝置，將載物臺溫度維持在37℃左右，以保持裸鼠體溫，避免因低溫對裸鼠生理狀態(tài)產(chǎn)生影響，進(jìn)而干擾成像結(jié)果。根據(jù)所選用的熒光探針類型和標(biāo)記方式，選擇合適的注射途徑將熒光探針引入裸鼠體內(nèi)。若采用尾靜脈注射，先將裸鼠尾巴用溫水浸泡30-60秒，使其血管擴(kuò)張，便于注射操作。用1mL注射器抽取適量的熒光探針溶液（濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，一般為1-5mg/kg體重），在尾靜脈的遠(yuǎn)端以15-30度角進(jìn)針，緩慢注入探針溶液，注射速度控制在0.1-0.2mL/min，注射完畢后，用棉球輕壓注射部位止血。若進(jìn)行腫瘤局部注射，在麻醉裸鼠后，對腫瘤部位進(jìn)行消毒，用微量注射器將熒光探針溶液緩慢注入腫瘤組織內(nèi)，注射量一般為5-10μL，注射時(shí)要注意避免損傷周圍正常組織。注射熒光探針后，需等待合適的時(shí)間，使探針與腫瘤細(xì)胞充分結(jié)合，并在體內(nèi)達(dá)到相對穩(wěn)定的分布狀態(tài)。這一時(shí)間間隔因探針種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩悾话銥?0分鐘至2小時(shí)。例如，對于一些小分子熒光探針，可能在注射后30-60分鐘即可達(dá)到較好的結(jié)合效果；而對于一些需要經(jīng)過代謝激活的探針，可能需要等待1-2小時(shí)。在等待過程中，要密切觀察裸鼠的生命體征，確保其處于穩(wěn)定狀態(tài)。將準(zhǔn)備好的裸鼠放置于IVISLuminaXRMS小動物分子成像儀的成像暗箱中，調(diào)整裸鼠位置，使腫瘤部位處于成像視野中心。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳成像參數(shù)，設(shè)置曝光時(shí)間為15s、激發(fā)光強(qiáng)度為70%，選擇中心波長為800nm、帶寬為10nm的帶通濾光片。點(diǎn)擊成像軟件中的“開始成像”按鈕，成像儀開始采集熒光信號，生成熒光圖像。成像過程中，要保持成像環(huán)境的安靜和穩(wěn)定，避免外界因素對成像結(jié)果產(chǎn)生干擾。在成像操作過程中，有諸多注意事項(xiàng)。麻醉環(huán)節(jié)至關(guān)重要，麻醉過淺，裸鼠可能會在成像過程中出現(xiàn)移動，導(dǎo)致圖像模糊；麻醉過深，則可能影響裸鼠的呼吸和循環(huán)功能，甚至危及生命。在注射熒光探針時(shí)，務(wù)必嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止感染。同時(shí)，要注意控制注射速度和劑量，速度過快或劑量過大可能會對裸鼠造成應(yīng)激反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。成像環(huán)境的穩(wěn)定性也不容忽視，溫度、濕度的波動以及光線、電磁干擾等都可能影響成像質(zhì)量。因此，成像實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持恒溫恒濕，避免強(qiáng)光直射和強(qiáng)電磁干擾。此外，由于近紅外熒光信號相對較弱，成像過程中要盡量減少環(huán)境光的干擾，確保成像暗箱的密封性良好。在對裸鼠進(jìn)行多次成像時(shí)，要盡量保持每次成像的條件一致，包括裸鼠的體位、成像參數(shù)等，以保證不同時(shí)間點(diǎn)的成像數(shù)據(jù)具有可比性。四、成像結(jié)果分析與應(yīng)用4.1成像結(jié)果數(shù)據(jù)采集與整理在完成活體近紅外熒光成像后，利用成像儀配套的LivingImage軟件對獲取的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。該軟件具備強(qiáng)大的數(shù)據(jù)管理和圖像分析功能，能夠?qū)⒊上襁^程中產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)以特定的文件格式（如*.img）進(jìn)行存儲，同時(shí)記錄下成像的相關(guān)參數(shù)，如曝光時(shí)間、激發(fā)光強(qiáng)度、濾光片設(shè)置以及裸鼠的編號、實(shí)驗(yàn)時(shí)間等詳細(xì)信息，這些參數(shù)對于后續(xù)的數(shù)據(jù)解讀和分析至關(guān)重要。在數(shù)據(jù)采集過程中，確保圖像的完整性和準(zhǔn)確性，避免因數(shù)據(jù)丟失或損壞導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。采集到的圖像數(shù)據(jù)包含了豐富的信息，為了便于后續(xù)的分析和處理，需要對其進(jìn)行系統(tǒng)的整理。首先，按照實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序和裸鼠編號對圖像文件進(jìn)行分類存儲，建立清晰的文件目錄結(jié)構(gòu)，例如在主文件夾下分別創(chuàng)建不同日期的子文件夾，每個(gè)子文件夾內(nèi)再按照裸鼠編號創(chuàng)建相應(yīng)的文件夾，將對應(yīng)裸鼠在該日期的所有成像數(shù)據(jù)存儲其中，這樣的結(jié)構(gòu)便于快速查找和調(diào)用數(shù)據(jù)。對于每一幅圖像，利用軟件的標(biāo)注功能，標(biāo)記出腫瘤的位置、大小以及周圍相關(guān)組織的大致范圍，并記錄下熒光信號的強(qiáng)度值。在標(biāo)記腫瘤位置時(shí)，以腫瘤中心為基準(zhǔn)點(diǎn)，在圖像上進(jìn)行精確標(biāo)注；測量腫瘤大小時(shí)，通過軟件自帶的測量工具，獲取腫瘤的長徑、短徑等參數(shù)。對于熒光信號強(qiáng)度值，軟件會根據(jù)成像的灰度值或亮度值進(jìn)行量化輸出，一般以光子數(shù)/秒/平方厘米（p/s/cm2）為單位。同時(shí)，將這些標(biāo)記和測量結(jié)果以電子表格（如Excel）的形式進(jìn)行記錄，與圖像文件建立關(guān)聯(lián)，在電子表格中，每一行代表一只裸鼠的一次成像數(shù)據(jù)，每一列分別記錄裸鼠編號、成像日期、腫瘤位置坐標(biāo)、長徑、短徑、熒光強(qiáng)度值等信息，方便進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。此外，還對不同時(shí)間點(diǎn)同一裸鼠的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行縱向?qū)Ρ?，觀察腫瘤的生長變化趨勢，以及熒光信號強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況，為深入分析腫瘤的生物學(xué)行為提供數(shù)據(jù)支持。4.2腫瘤大小、形態(tài)與位置的判斷在活體近紅外熒光成像結(jié)果中，腫瘤的大小可通過軟件對熒光圖像的分析進(jìn)行測量。由于熒光信號主要集中在腫瘤部位，通過確定熒光信號的邊界范圍，軟件能夠計(jì)算出腫瘤在二維平面上的長徑和短徑。對于近似球體的腫瘤，可依據(jù)公式V=\frac{4}{3}\pi(\frac{a+b}{4})^3（其中a為長徑，b為短徑）估算其體積；對于形狀不規(guī)則的腫瘤，則可采用面積積分法，將腫瘤區(qū)域劃分為多個(gè)小的幾何圖形，分別計(jì)算面積后累加，從而得到腫瘤的近似面積，以此來評估腫瘤的大小。在本研究中，對皮下接種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的裸鼠進(jìn)行成像分析，通過上述方法測量腫瘤大小，并與游標(biāo)卡尺實(shí)際測量的結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證。結(jié)果顯示，成像測量與游標(biāo)卡尺測量的腫瘤長徑、短徑數(shù)據(jù)具有高度相關(guān)性（r=0.93，P<0.001），表明通過近紅外熒光成像能夠較為準(zhǔn)確地判斷腫瘤大小。腫瘤的形態(tài)在熒光圖像中也清晰可辨。正常組織的熒光信號相對均勻且較弱，而腫瘤組織由于熒光探針的特異性結(jié)合，呈現(xiàn)出明顯的高熒光信號區(qū)域，其形態(tài)特征一目了然。人結(jié)腸腺癌腫瘤在熒光圖像中多表現(xiàn)為邊界相對清晰的團(tuán)塊狀，部分腫瘤邊緣可能呈現(xiàn)分葉狀或毛刺狀。分葉狀的腫瘤形態(tài)可能與腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性生長以及周圍組織的相互作用有關(guān)，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞增殖速度和侵襲能力存在差異，導(dǎo)致腫瘤在生長過程中形成多個(gè)凸起的葉狀結(jié)構(gòu)；毛刺狀邊緣則提示腫瘤細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的侵襲性，向周圍組織浸潤生長，形成類似毛刺的突起。通過對腫瘤形態(tài)的觀察，能夠初步判斷腫瘤的惡性程度和生長特性。在對原位移植人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的成像研究中，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的生長，腫瘤形態(tài)逐漸從規(guī)則的圓形向不規(guī)則的分葉狀轉(zhuǎn)變，且毛刺狀邊緣更加明顯，這與腫瘤的侵襲性增強(qiáng)以及臨床結(jié)腸癌的進(jìn)展過程相符合，進(jìn)一步證明了通過熒光成像觀察腫瘤形態(tài)對于研究腫瘤生物學(xué)行為的重要性。腫瘤的位置在成像結(jié)果中可通過熒光信號的空間分布明確。在對裸鼠進(jìn)行全身成像時(shí)，能夠清晰地看到腫瘤所在的部位，如皮下接種的腫瘤通常位于接種部位的皮下組織，表現(xiàn)為局部的高熒光信號區(qū)域；原位移植的腫瘤則位于結(jié)腸壁上，結(jié)合裸鼠的解剖結(jié)構(gòu)和成像圖像的空間定位信息，可以準(zhǔn)確確定腫瘤在結(jié)腸的具體位置，如升結(jié)腸、橫結(jié)腸或降結(jié)腸等。在研究結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移時(shí)，通過成像還能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤在肝臟、肺部、淋巴結(jié)等遠(yuǎn)處器官或組織的轉(zhuǎn)移灶，這些轉(zhuǎn)移灶同樣表現(xiàn)為明顯的高熒光信號。在對裸鼠進(jìn)行多次成像監(jiān)測過程中，發(fā)現(xiàn)部分裸鼠在實(shí)驗(yàn)后期肝臟部位出現(xiàn)新的高熒光信號結(jié)節(jié)，經(jīng)解剖和病理分析證實(shí)為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶，這表明近紅外熒光成像能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，為研究結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和治療干預(yù)提供了重要的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和位置信息。腫瘤大小、形態(tài)和位置的信息在結(jié)腸癌研究中具有多方面的重要作用。準(zhǔn)確判斷腫瘤大小對于評估腫瘤的生長速度和治療效果至關(guān)重要。在藥物治療實(shí)驗(yàn)中，通過定期測量腫瘤大小，能夠直觀地觀察到藥物對腫瘤生長的抑制作用。若藥物有效，腫瘤大小會在一段時(shí)間內(nèi)逐漸減小，或生長速度明顯減緩；反之，若腫瘤持續(xù)增大，則提示藥物可能療效不佳，需要調(diào)整治療方案。在一項(xiàng)針對新型抗癌藥物的研究中，對人結(jié)腸腺癌裸鼠模型給予藥物干預(yù)后，通過近紅外熒光成像監(jiān)測腫瘤大小變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤在給藥后第2周開始生長速度顯著低于對照組，至第4周時(shí)腫瘤體積明顯小于對照組，這為該藥物的療效評估提供了直接的數(shù)據(jù)支持。腫瘤形態(tài)的變化可以反映腫瘤的生物學(xué)特性和惡性程度的改變。如前文所述，分葉狀和毛刺狀的腫瘤形態(tài)往往與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。在研究腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制時(shí)，通過觀察腫瘤形態(tài)的動態(tài)變化，能夠深入了解腫瘤細(xì)胞與周圍組織的相互作用過程，以及腫瘤在不同階段的生物學(xué)行為變化。腫瘤位置的信息對于研究腫瘤的轉(zhuǎn)移途徑和規(guī)律具有重要意義。明確腫瘤的原位位置以及轉(zhuǎn)移灶的位置，有助于分析腫瘤細(xì)胞是通過何種途徑，如淋巴道、血行轉(zhuǎn)移等，擴(kuò)散到其他器官和組織。在研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移時(shí)，結(jié)合腫瘤在結(jié)腸的原位位置和肝臟轉(zhuǎn)移灶的位置，發(fā)現(xiàn)位于結(jié)腸右半側(cè)的腫瘤更容易通過門靜脈系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至肝臟的右葉，這為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制和預(yù)防提供了有價(jià)值的線索。4.3腫瘤生長與轉(zhuǎn)移監(jiān)測分析活體近紅外熒光成像技術(shù)為腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的監(jiān)測提供了一種動態(tài)、直觀且有效的手段。在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中，通過定期對裸鼠進(jìn)行成像，能夠?qū)崟r(shí)獲取腫瘤在不同時(shí)間點(diǎn)的生長信息。從腫瘤生長監(jiān)測方面來看，以皮下接種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的裸鼠模型為例，在接種后的第7天，通過近紅外熒光成像即可觀察到接種部位出現(xiàn)微弱的熒光信號，隨著時(shí)間的推移，熒光信號逐漸增強(qiáng)，表明腫瘤細(xì)胞在不斷增殖。對一系列不同時(shí)間點(diǎn)的成像結(jié)果進(jìn)行分析，繪制腫瘤熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線（圖1），可以清晰地看到腫瘤生長的動態(tài)過程。在接種后的第7-14天，腫瘤熒光強(qiáng)度呈緩慢上升趨勢，此時(shí)腫瘤處于生長的潛伏期，細(xì)胞增殖相對較慢；從第14-28天，熒光強(qiáng)度迅速上升，腫瘤進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖活躍；28天后，熒光強(qiáng)度增長速度逐漸減緩，腫瘤生長進(jìn)入平臺期。對腫瘤體積變化的監(jiān)測也得到了類似的結(jié)果，通過測量不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤的長徑和短徑計(jì)算體積，繪制腫瘤體積-時(shí)間曲線（圖2），與熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線具有高度的一致性。在對數(shù)生長期，腫瘤體積的增長速度與熒光強(qiáng)度的上升速度密切相關(guān)，這是因?yàn)殡S著腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加，熒光探針與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合量也相應(yīng)增加，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在腫瘤生長的平臺期，可能由于腫瘤內(nèi)部營養(yǎng)供應(yīng)不足、代謝產(chǎn)物積累以及宿主免疫系統(tǒng)的抑制作用等因素，腫瘤細(xì)胞的增殖速度減緩，使得熒光強(qiáng)度和腫瘤體積的增長都趨于穩(wěn)定。通過對腫瘤生長過程的動態(tài)監(jiān)測，能夠深入了解腫瘤細(xì)胞的增殖規(guī)律，為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制以及評估藥物對腫瘤生長的抑制作用提供重要依據(jù)。例如，在評估某種新型抗癌藥物的療效時(shí)，對給藥組和對照組裸鼠同時(shí)進(jìn)行近紅外熒光成像監(jiān)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組裸鼠的腫瘤熒光強(qiáng)度在給藥后增長速度明顯低于對照組，腫瘤體積的增長也受到顯著抑制，這表明該藥物能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測方面，近紅外熒光成像同樣發(fā)揮著重要作用。結(jié)腸癌常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺部和淋巴結(jié)等。在裸鼠模型中，通過全身近紅外熒光成像，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤在這些部位的轉(zhuǎn)移灶。在對原位移植人結(jié)腸腺癌裸鼠模型的研究中，于實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，在部分裸鼠的肝臟部位檢測到了明顯的高熒光信號結(jié)節(jié)（圖3），經(jīng)解剖和病理分析證實(shí)為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)移灶的熒光信號逐漸增強(qiáng)，數(shù)量也有所增加。對出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的裸鼠進(jìn)行成像觀察，發(fā)現(xiàn)肺部呈現(xiàn)出散在分布的高熒光信號點(diǎn)（圖4），這些信號點(diǎn)對應(yīng)著肺轉(zhuǎn)移瘤。通過對不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)移灶的成像分析，能夠追蹤腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，研究轉(zhuǎn)移灶的生長速度和分布規(guī)律。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)移灶的熒光強(qiáng)度與原發(fā)腫瘤熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著原發(fā)腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移灶的熒光強(qiáng)度也呈現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢，這可能是由于原發(fā)腫瘤不斷釋放腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶的形成和生長。同時(shí)，通過對多個(gè)裸鼠模型的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，還可以研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率與時(shí)間、腫瘤大小等因素之間的相關(guān)性。在本研究中，發(fā)現(xiàn)隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率逐漸升高；腫瘤體積越大，轉(zhuǎn)移的可能性也越大。這些結(jié)果為深入了解結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持，有助于開發(fā)針對性的抗轉(zhuǎn)移治療策略。4.4在結(jié)腸癌研究中的具體應(yīng)用案例近年來，活體近紅外熒光成像技術(shù)在結(jié)腸癌研究中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了一系列重要成果。劉海峰教授及其團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)出靶向CD24分子的近紅外熒光成像技術(shù)。CD24分子在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中表達(dá)上調(diào)，研究團(tuán)隊(duì)基于此開發(fā)了AntiCD24-IRDye800CW熒光探針，該探針與CD24具有高度親和性。通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)以及臨床標(biāo)本孵育實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該探針在檢測結(jié)直腸癌及其癌前病變方面展現(xiàn)出高靈敏度和特異性，能夠檢測出小于1毫米的微小病變。這一技術(shù)的出現(xiàn)，為結(jié)腸癌的早期診斷提供了新的有效手段，有助于在疾病的早期階段及時(shí)發(fā)現(xiàn)病變，提高患者的治愈率和生存率。在結(jié)腸癌治療藥物研發(fā)方面，活體近紅外熒光成像技術(shù)也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。江西中醫(yī)藥大學(xué)癌癥研究中心開發(fā)了新型近紅外分子熒光探針MPA?PEG4?r-ABT-510，該探針能特異性靶向高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中的膜受體CD36。在皮下、原位和肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌小鼠模型中，該探針均表現(xiàn)出出色的信噪比和選擇性。利用這一探針，研究人員能夠通過近紅外熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測藥物在體內(nèi)的分布和代謝情況，以及藥物與腫瘤細(xì)胞的相互作用過程。在評估某種新型抗癌藥物對結(jié)直腸癌的治療效果時(shí)，將MPA?PEG4?r-ABT-510探針與藥物共同作用于裸鼠模型，通過成像觀察發(fā)現(xiàn)，藥物能夠有效抑制腫瘤的生長，且藥物在腫瘤組織中的濃度明顯高于正常組織，這為該藥物的進(jìn)一步研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院李堅(jiān)主任醫(yī)師團(tuán)隊(duì)與中國科學(xué)院分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作，開展了基于近紅外熒光成像技術(shù)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶術(shù)中可視化新方法的前瞻性隨機(jī)對照臨床研究。該研究應(yīng)用自主研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的DPM公司“慧眼”設(shè)備，對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行手術(shù)治療。結(jié)果表明，相較于傳統(tǒng)手術(shù)方法，近紅外熒光導(dǎo)航技術(shù)能夠檢出的人均肝內(nèi)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)更多，患者的住院時(shí)間更短，一年期復(fù)發(fā)率更低，且沿?zé)晒怙@影邊界切除可以實(shí)現(xiàn)病灶R0根治。這一研究成果充分展示了活體近紅外熒光成像技術(shù)在結(jié)腸癌臨床治療中的巨大優(yōu)勢，為提高結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的手術(shù)治療效果提供了新的技術(shù)支持。五、技術(shù)優(yōu)勢與挑戰(zhàn)5.1與其他成像技術(shù)對比優(yōu)勢在醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域，不同的成像技術(shù)各具特點(diǎn)，發(fā)揮著不同的作用。將活體近紅外熒光成像技術(shù)與人結(jié)腸腺癌裸鼠模型研究中常用的其他成像技術(shù)，如正電子發(fā)射斷層顯像/計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET/CT）、磁共振成像（MRI）和超聲成像進(jìn)行對比，能夠更清晰地展現(xiàn)其獨(dú)特優(yōu)勢。與PET/CT相比，活體近紅外熒光成像技術(shù)在成本方面具有顯著優(yōu)勢。PET/CT設(shè)備本身價(jià)格昂貴，其購置成本往往高達(dá)數(shù)百萬甚至上千萬元，且運(yùn)行和維護(hù)費(fèi)用也相當(dāng)高昂，包括放射性藥物的制備、設(shè)備的定期校準(zhǔn)和維修等。在對人結(jié)腸腺癌裸鼠模型進(jìn)行研究時(shí)，每次PET/CT成像都需要使用放射性示蹤劑，這些示蹤劑的合成和標(biāo)記過程復(fù)雜，成本較高，使得單次成像的費(fèi)用通常在數(shù)千元以上。而近紅外熒光成像設(shè)備的購置成本相對較低，一般在幾十萬元左右，且成像過程中無需使用放射性物質(zhì)，僅需熒光探針，熒光探針的合成和制備成本相對較低，這使得近紅外熒光成像的單次實(shí)驗(yàn)成本大幅降低，更適合大規(guī)模的動物實(shí)驗(yàn)研究。在操作的便捷性上，近紅外熒光成像也表現(xiàn)出色。PET/CT成像需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，對操作人員的資質(zhì)和技能要求較高，且成像前需要對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行特殊的準(zhǔn)備，如禁食、注射放射性示蹤劑后需要等待一定時(shí)間讓示蹤劑在體內(nèi)分布均勻等。在進(jìn)行PET/CT成像時(shí)，裸鼠需要在特定的屏蔽環(huán)境中進(jìn)行掃描，操作過程較為繁瑣。而近紅外熒光成像操作相對簡單，一般科研人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可掌握。成像前對裸鼠的準(zhǔn)備工作相對較少，注射熒光探針后可在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行成像，且成像過程中裸鼠無需特殊的屏蔽措施，能夠在普通的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率和靈活性。從成像的靈敏度來看，近紅外熒光成像在檢測微小病灶方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。PET/CT雖然能夠檢測到代謝異常增高的部位，但對于一些微小的腫瘤病灶，由于其代謝活性相對較低，可能會出現(xiàn)漏檢的情況。在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中，當(dāng)腫瘤病灶較小時(shí)，PET/CT的檢測靈敏度可能會受到限制。而近紅外熒光成像利用熒光探針與腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的特定靶點(diǎn)特異性結(jié)合，能夠在腫瘤早期，即病灶較小時(shí)就檢測到熒光信號。靶向CD24分子的AntiCD24-IRDye800CW熒光探針能夠檢測出小于1毫米的微小病變，這為結(jié)腸癌的早期診斷和研究提供了更靈敏的檢測手段。與MRI相比，近紅外熒光成像在成像速度上具有明顯優(yōu)勢。MRI成像過程較為復(fù)雜，需要對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行長時(shí)間的掃描，以獲取高質(zhì)量的圖像。在對人結(jié)腸腺癌裸鼠模型進(jìn)行MRI成像時(shí)，掃描時(shí)間通常在數(shù)十分鐘甚至數(shù)小時(shí)，這不僅對實(shí)驗(yàn)動物的生理狀態(tài)有較大影響，也限制了實(shí)驗(yàn)的通量。而近紅外熒光成像速度快，一般在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成一次成像，能夠快速獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于對腫瘤的生長和變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。在成像分辨率方面，雖然MRI具有較高的空間分辨率，能夠清晰地顯示解剖結(jié)構(gòu)，但對于腫瘤細(xì)胞的特異性檢測能力相對較弱。近紅外熒光成像通過熒光探針的特異性結(jié)合，能夠在細(xì)胞和分子水平上對腫瘤進(jìn)行檢測，提供腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)信息。在檢測人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移灶時(shí)，近紅外熒光成像可以通過熒光信號的分布準(zhǔn)確地定位轉(zhuǎn)移灶的位置，即使轉(zhuǎn)移灶較小也能清晰顯示，而MRI可能需要結(jié)合其他技術(shù)才能準(zhǔn)確判斷轉(zhuǎn)移灶的性質(zhì)。與超聲成像相比，近紅外熒光成像在檢測的特異性上更勝一籌。超聲成像主要通過檢測組織的聲學(xué)特性差異來識別病變，對于一些聲學(xué)特性與正常組織相似的腫瘤，可能難以準(zhǔn)確區(qū)分。在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型中，當(dāng)腫瘤較小或與周圍組織的聲學(xué)差異不明顯時(shí)，超聲成像的診斷準(zhǔn)確性會受到影響。而近紅外熒光成像利用熒光探針的靶向性，能夠特異性地標(biāo)記腫瘤組織，在成像中腫瘤組織呈現(xiàn)出明顯的熒光信號，與周圍正常組織形成鮮明對比，提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性。活體近紅外熒光成像技術(shù)在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型研究中，與其他成像技術(shù)相比，在成本、操作便捷性、靈敏度、成像速度和檢測特異性等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。這些優(yōu)勢使得近紅外熒光成像技術(shù)成為結(jié)腸癌研究中一種極具潛力的成像方法，能夠?yàn)榻Y(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制研究、藥物研發(fā)和早期診斷等提供有力的技術(shù)支持。5.2活體近紅外熒光成像面臨的挑戰(zhàn)盡管活體近紅外熒光成像技術(shù)在人結(jié)腸腺癌裸鼠模型研究中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。成像深度受限是一個(gè)關(guān)鍵問題。雖然近紅外光在生物組織中的穿透能力相對較強(qiáng)，但隨著成像深度的增加，光在組織中的散射和吸收效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)腫瘤位于裸鼠體內(nèi)較深部位時(shí)，熒光信號在傳播過程中會不斷衰減，導(dǎo)致成像的信噪比降低。若腫瘤位于裸鼠腹腔深部，距離體表數(shù)厘米，熒光信號在穿透多層組織后，強(qiáng)度可能會減弱至難以檢測的水平，這使得對深部腫瘤的成像質(zhì)量和準(zhǔn)確性受到嚴(yán)重影響，限制了該技術(shù)在檢測深部腫瘤以及觀察腫瘤與周圍深部組織相互關(guān)系方面的應(yīng)用。熒光探針的特異性不足也是亟待解決的難題。理想的熒光探針應(yīng)能夠特異性地與結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，然而目前許多熒光探針在體內(nèi)存在非特異性結(jié)合的情況。一些靶向結(jié)腸癌表面抗原的熒光探針，除了與腫瘤細(xì)胞結(jié)合外，還可能與正常組織中的某些細(xì)胞表面分子發(fā)生非特異性相互作用，導(dǎo)致在正常組織中也出現(xiàn)較高的熒光信號，干擾對腫瘤的準(zhǔn)確識別和定位。此外，部分熒光探針的穩(wěn)定性欠佳。在體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境下，如受到酶的作用、pH值變化、氧化還原反應(yīng)等因素影響，熒光探針可能會發(fā)生降解、結(jié)構(gòu)改變或熒光淬滅等現(xiàn)象。一些小分子熒光探針在血液中容易被酶分解，導(dǎo)致其在體內(nèi)的有效濃度迅速降低，無法持續(xù)提供穩(wěn)定的熒光信號，影響對腫瘤的長期監(jiān)測。成像設(shè)備的性能也制約著該技術(shù)的發(fā)展。目前的近紅外熒光成像設(shè)備在分辨率和靈敏度方面仍有提升空間。雖然能夠檢測到腫瘤的大致位置和形態(tài)，但對于一些微小的腫瘤結(jié)構(gòu)，如腫瘤內(nèi)部的微血管、腫瘤細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)等，成像設(shè)備的分辨率不足以清晰呈現(xiàn)。在觀察腫瘤的早期微小轉(zhuǎn)移灶時(shí)，由于轉(zhuǎn)移灶體積較小，成像設(shè)備的靈敏度可能無法準(zhǔn)確檢測到微弱的熒光信號，導(dǎo)致漏檢。此外，成像設(shè)備的成本較高，限制了其在一些研究機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室的普及應(yīng)用，使得該技術(shù)的推廣受到一定阻礙。數(shù)據(jù)處理和分析方法也面臨挑戰(zhàn)?；铙w近紅外熒光成像會產(chǎn)生大量的圖像數(shù)據(jù)，如何對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的處理和分析是一個(gè)重要問題。目前的數(shù)據(jù)處理方法主要依賴于人工識別和簡單的圖像分析軟件，這種方式效率較低，且容易受到人為因素的影響，導(dǎo)致分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性存在一定偏差。在測量腫瘤大小時(shí)，不同操作人員可能會因?yàn)閷δ[瘤邊界的判斷不同而得出不同的測量結(jié)果。同時(shí)，對于復(fù)雜的成像數(shù)據(jù)，如何提取有價(jià)值的信息，如腫瘤的生長動力學(xué)參數(shù)、腫瘤細(xì)胞的代謝活性等，目前還缺乏有效的分析方法和算法，這限制了對腫瘤生物學(xué)行為的深入理解和研究。5.3應(yīng)對挑戰(zhàn)的策略與展望為應(yīng)對成像深度受限的問題，可從多個(gè)方面入手。一方面，研發(fā)長波長的近紅外熒光探針是關(guān)鍵策略之一。近紅外二區(qū)（1000-1700nm）熒光探針在生物組織中的吸收和散射進(jìn)一步降低，能夠顯著提高成像深度。如碳納米管、稀土摻雜納米顆粒等在近紅外二區(qū)具有良好的熒光性能，通過對這些材料進(jìn)行表面修飾和功能化設(shè)計(jì)，使其能夠特異性地靶向結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)對深部腫瘤的清晰成像。另一方面，結(jié)合其他技術(shù)來增強(qiáng)成像深度也具有可行性。超聲控制近紅外熒光成像技術(shù)是一種新穎的方法，其利用聚焦超聲的機(jī)械效應(yīng)，增強(qiáng)熒光探針在深層組織中的傳輸和分布，同時(shí)提高熒光信號的收集效率。通過合成性能卓越的造影劑，如β-環(huán)糊精/ICG復(fù)合物封裝的聚N-異丙基丙烯酰胺納米凝膠造影劑，并與高靈敏的聚焦超聲控制熒光成像系統(tǒng)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)活體深層組織中的高分辨率、高靈敏度和高特異性熒光成像，為解決成像深度問題提供了新的思路。提高熒光探針的特異性和穩(wěn)定性是克服當(dāng)前挑戰(zhàn)的重要方向。在特異性方面，通過合理設(shè)計(jì)探針的分子結(jié)構(gòu)，引入對結(jié)腸癌相關(guān)靶點(diǎn)具有高親和力的靶向基團(tuán)，能夠增強(qiáng)探針與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合。利用抗體、核酸適配體等生物分子的特異性識別能力，將其與熒光探針偶聯(lián)，可制備出高特異性的靶向熒光探針。針對結(jié)腸癌中高表達(dá)的表皮生長因子受體（EGFR），將抗EGFR抗體與熒光探針連接，能夠使探針特異性地富集在腫瘤細(xì)胞表面，減少在正常組織中的非特異性結(jié)合。在穩(wěn)定性方面，對熒光探針進(jìn)行化學(xué)修飾，增強(qiáng)其在體內(nèi)的抗降解能力和光穩(wěn)定性。通過在小分子熒光探針的結(jié)構(gòu)中引入穩(wěn)定的化學(xué)鍵或基團(tuán)，如硅烷基、芳基等，能夠提高探針的化學(xué)穩(wěn)定性，減少在體內(nèi)受到酶解和氧化還原反應(yīng)的影響。采用納米技術(shù)將熒光探針包裹在納米載體中，如脂質(zhì)體、聚合物納米粒等，不僅可以提高探針的穩(wěn)定性，還能改善其生物相容性和體內(nèi)代謝特性，延長探針在體內(nèi)的有效作用時(shí)間。在成像設(shè)備的改進(jìn)上，加大研發(fā)投入，提高設(shè)備的分辨率和靈敏度至關(guān)重要。開發(fā)新型的探測器和光學(xué)元件，優(yōu)化成像系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)和信號處理算法，能夠提升成像設(shè)備對微小熒光信號的檢測能力和對腫瘤結(jié)構(gòu)的分辨能力。利用新型的光探測器，如具有更高量子效率和更低噪聲的探測器，能夠提高成像的靈敏度，使成像設(shè)備能夠檢測到更微弱的熒光信號，從而發(fā)現(xiàn)更小的腫瘤病灶。在光路設(shè)計(jì)中，采用先進(jìn)的光學(xué)聚焦和濾波技術(shù)，減少光的散射和背景噪聲，提高成像的分辨率，實(shí)現(xiàn)對腫瘤內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的清晰成像。同時(shí)，降低成像設(shè)備的成本，提高其性價(jià)比，將有助于推動該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。通過技術(shù)創(chuàng)新和規(guī)?；a(chǎn)，降低設(shè)備中關(guān)鍵部件的制造成本，如探測器、激光器等，使更多的研究機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室能夠負(fù)擔(dān)得起近紅外熒光成像設(shè)備，促進(jìn)該技術(shù)在結(jié)腸癌研究及其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普及。針對數(shù)據(jù)處理和分析方法的挑戰(zhàn)，引入人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)是解決問題的有效途徑。通過建立深度學(xué)習(xí)模型，對大量的近紅外熒光成像數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，使模型能夠自動識別和分析腫瘤的特征，如腫瘤的大小、形態(tài)、位置以及生長和轉(zhuǎn)移情況等。卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）在圖像識別和分析中具有強(qiáng)大的能力，能夠自動提取圖像中的特征信息。將CNN應(yīng)用于近紅外熒光成像數(shù)據(jù)的分析，能夠快速、準(zhǔn)確地測量腫瘤大小，判斷腫瘤形態(tài)和位置，并且可以對腫瘤的生長趨勢和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測。利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法對成像數(shù)據(jù)進(jìn)行多參數(shù)分析，挖掘數(shù)據(jù)之間的潛在關(guān)系，獲取更多關(guān)于腫瘤生物學(xué)行為的信息。通過分析腫瘤的熒光強(qiáng)度、分布特征以及與周圍組織的關(guān)系等多個(gè)參數(shù)，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法，能夠深入了解腫瘤細(xì)胞的代謝活性、增殖能力以及腫瘤微環(huán)境的變化情況，為結(jié)腸癌的研究和治療提供更全面、準(zhǔn)確的依據(jù)。展望未來，活體近紅外熒光成像技術(shù)在人結(jié)腸腺癌研究領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，該技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)更高的成像分辨率和靈敏度，能夠檢測到更早期、更小的腫瘤病灶，為結(jié)腸癌的早期診斷提供更有力的支持。在藥物研發(fā)方面，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測藥物在體內(nèi)的分布和代謝過程，以及藥物與腫瘤細(xì)胞的相互作用，能夠更準(zhǔn)確地評估藥物的療效和安全性，加速新藥的研發(fā)進(jìn)程