DB15Real-timePCRMethodforAuthentificationofCattleandBuffaloDerivedMaterials2020-10-20發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件起草單位：錫林郭勒職業(yè)學(xué)院、錫林郭勒食品藥品檢驗檢測和風(fēng)險評估中本文件主要起草人：郭梁、李春冬、郭元晟、其勒木格、徐偉良、劉國強、羅建I牛和水牛源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法本文件適用于鮮肉、鮮乳、加工肉制品、加工乳下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測實時熒光PCRrealtimePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實時檢測整個PCR過程，對未知模板進(jìn)行每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循1利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記特異性牛和水牛探針以及質(zhì)控探取于鮮肉、鮮乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA進(jìn)行擴增。在同一反應(yīng)中及質(zhì)控基因同時擴增，三種熒光同時檢測。其中，同管質(zhì)控探針的檢測旨在監(jiān)控擴增反應(yīng)是否正常進(jìn)行，避免假陰性結(jié)果。通過評價Ct值判斷動物產(chǎn)品（5.2異戊醇。5.3異丙醇。5.6CTAB提取液：稱取10gCTAB（十六烷基三甲基），），F(xiàn)AM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRA2HEX-CTCTCATGTGGTTAGTGCATTTAAATAGGG-TAMRAROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-B6.1實時熒光PCR儀：通道數(shù)≥3，溫度控制精度<±0.1℃。6.5金屬浴或恒溫水浴鍋：溫度控制精度<±0.5℃。利用均質(zhì)器將固態(tài)樣品充分混勻，裝入清潔容器中，加封后，注明標(biāo)記。利用攪拌器將液態(tài)樣），置于65℃水浴30min，期間每隔5min顛倒混勻一次；13000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液于新離心管中，加入等體積三氯甲烷和異戊醇混合液（體積比為24:1），旋渦混勻，13000rpm離心5min，取上清液于新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13000rpm離心5min保存。對陽性對照和陰性對照進(jìn)行同法操作。用滅菌水代替樣品進(jìn)行核酸抽提作為提取空白對照。3離心管上層乳脂和中間層的液體，保留底部沉淀；），），分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，按公式（1）計算DNA濃度DNA濃度在10ng/μL～100ng/μL，A260/A280比值在1.7～2.1之間時，適合實時熒光PCR反應(yīng)。若濃度大于100ng/μL時，建議用滅菌水稀釋；若濃度小于10ng/μL或比值小于1.7時，建議重新進(jìn)行DNAc=A×N×50/1000???????????（1）c—DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μL反應(yīng)體系見表2。4反應(yīng)程序根據(jù)不同廠家的商品試劑盒或不同型號的實時熒光PCR儀進(jìn)9結(jié)果分析與表述9.1結(jié)果判定c)特異性探針35.0＜Ct值＜40.0且質(zhì)控探針Ct值≤35.0，則需要重復(fù)實驗；如再次擴9.2結(jié)果表述9.2.1樣品陽性，表述為“檢出牛或/和水牛源性成分”。9.2.2樣品陰性，表述為“未檢出?；?和水牛源性成分”。5A.1牛特異性基因?qū)崟r熒光PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列（120bp）及引物和探針位置TTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGA.2水牛特異性基因?qū)崟r熒光PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列（120bp）及引物和探針位置TTGAACTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTAAATATAATGCATC