1、第八章 現(xiàn)代生物技術(shù)在抗生素工業(yè)中的應(yīng)用基因工程技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用2細(xì)胞工程在傳統(tǒng)制藥工業(yè)中的應(yīng)用3重組DNA技術(shù)在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用18.1 重組DNA技術(shù)在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用幾種典型的抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)2提高抗生素產(chǎn)量的方法3改善抗生素組分4改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝 5產(chǎn)生雜合抗生素6克隆抗生素生物合成基因的方法18.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法1.克隆抗生素生物合成基因的方法（1）抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)特點 鏈霉菌抗生素生物合成基因結(jié)構(gòu)的典型特征之一是高G-C堿基組成，(G-C)的百分含量達(dá)70%以上。三聯(lián)體密碼子中的第3個堿基的G、C比例極高，由于密碼子有簡并性，因而并不

2、改變氨基酸的種類。這種密碼子內(nèi)部的堿基選擇的不對稱性具有一定的實用價值，可用于可靠地預(yù)測開放閱讀框架和DNA序列的編碼鏈。Bibb等正是利用了這一特性，成功地預(yù)測了抗生鏈霉菌(S.antibioticus)的酪氨酸脫羧酶基因及紅霉素鏈霉菌(S.erythreus)的紅霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄方向。8.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法 根據(jù)對不同化學(xué)類別的抗生素生物合成基因的定位研究，發(fā)現(xiàn)參與每種抗生素生物合成的基因約為1030個，幾乎總是成簇存在的，如次甲霉素、新霉素、紅霉素、紫霉素、卡那霉素、土霉素、鏈霉素、嘌羅霉素、氯霉素的生物合成基因都在一個基因簇中。不僅包括生物合成酶結(jié)構(gòu)基因，也包括抗性

3、基因、調(diào)節(jié)基因、抗生素分泌和與胞外處理功能有關(guān)的基因。8.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法 抗生素生物合成基因除定位在染色體上外，還發(fā)現(xiàn)有的定位在質(zhì)粒上。8.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法（2）克隆抗生素生物合成基因的方法阻斷變株法突變克隆法直接克隆法克隆抗生素抗性基因法寡核苷酸探針法同源基因雜交法在標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物法8.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法8.1.1 克隆抗生素生物合成基因的方法8.2.2 幾種典型的抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)1.紅霉素8.2.2 幾種典型的抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)8.2.2 幾種典型的抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)2.青霉素 利用-內(nèi)酯胺抗生素

4、產(chǎn)生菌的無細(xì)胞系統(tǒng)，對青霉素和頭孢菌素C生物合成途徑的研究表明，在低等真核和原核產(chǎn)生菌中，-內(nèi)酰胺抗生素的生物合成途徑基本相同。pcbAB基因編碼的三肽合成酶(ACV合成酶)催化L-氨基己二酸、L-半胱胺酸和L-纈氨酸縮合形成三肽(LLD-ACV)，此三肽在IPNS催化下，從半胱氨酸和纈氨酸殘基上去掉4個氫原子，形成了此途徑中第一個具有-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的化合物異青霉素N。以異青霉素為分支底物，經(jīng)不同的合成酶催化，分別形成不同的-內(nèi)酯胺抗生素青霉素、頭孢菌素C和頭霉素(P115 圖8-4)。8.3.3 提高抗生素產(chǎn)量的方法將產(chǎn)生菌基因隨機(jī)克隆至原株直接篩選高產(chǎn)菌株增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)

5、（P116 圖8-5）強(qiáng)化正調(diào)節(jié)基因的作用增加抗性基因8.1.4 改善抗生素組分 許多抗生素產(chǎn)生菌可以產(chǎn)生多組分抗生素，由于這些組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，但生物活性有時卻相差很大，這給有效組分的發(fā)酵、提取和精制帶來很大不便。隨著對各種抗生素合成途徑的深入了解以及基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用基因工程方法可以定向地改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種以利于下游開發(fā)。8.1.5 改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝8.1.6 產(chǎn)生雜合抗生素1.不同抗生素生物合成基因重組8.1.6 產(chǎn)生雜合抗生素2.生物合成途徑中某個酶基因的突變8.1.6 產(chǎn)生雜合抗生素3.在生物合成途徑中引入一個酶基因4.利用底物特異性不

6、強(qiáng)的酶催化形成新產(chǎn)物（P120 圖8-9 由異青霉素N合成酶(IPNS)產(chǎn)生的新型-內(nèi)酰胺類抗生素）8.2 基因工程技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用8.2 基因工程技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用靶酶受體8.3 細(xì)胞工程在傳統(tǒng)制藥工業(yè)中的應(yīng)用產(chǎn)生新的化合物2細(xì)胞工程在提高抗生素產(chǎn)量方面的應(yīng)用18.3.1 細(xì)胞工程在提高抗生素產(chǎn)量方面的應(yīng)用 通過原生質(zhì)體融合提高微生物代謝產(chǎn)物的單位產(chǎn)量已經(jīng)成為育種常規(guī)方法之一。為了提高某一抗生素的單位產(chǎn)量，可將其產(chǎn)生菌與另一生物合成途徑相似的抗生素產(chǎn)生菌的高產(chǎn)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合。如柔紅霉素（正定霉素）產(chǎn)生菌與四環(huán)素產(chǎn)生菌的種間原生質(zhì)體融合，由于這兩個抗生素的生物合成都是來自聚酮體途徑，使柔紅霉素的單位產(chǎn)量得到明顯提高。將巴龍霉素產(chǎn)生菌與新霉素產(chǎn)生菌的高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行種間原生質(zhì)體融合，獲得了巴龍霉素單位產(chǎn)量提高56倍的重組體。這兩個抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上只有一個羥基和氨基的差別，合成途徑也十分相似。8.3.2 產(chǎn)生新的化合物 通過原生質(zhì)體融合形成新化合物的機(jī)制有兩種可能的解釋：一是某一