第54課時基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)課標要求1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.DNA的粗提取與鑒定。4.闡明基因工程的基本操作程序?？记榉治?.基因工程的基本工具2024·湖南·T52.基因工程的基本操作程序2024·貴州·T212024·湖南·T212024·甘肅·T212024·全國甲·T382023·湖北·T42023·新課標·T62023·廣東·T202023·海南·T202023·山東·T252023·天津·T172022·廣東·T222022·北京·T212022·山東·T253.DNA的粗提取與鑒定2024·安徽·T142024·山東·T132022·山東·T13考點一基因工程的基本工具1．基因工程的概念[提醒]基因工程的理論基礎(chǔ)[教材隱性知識]源自選擇性必修3P68“科技探索之路”肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移；科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細菌細胞間轉(zhuǎn)移；多種限制酶、DNA_連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件；基因組編輯技術(shù)可以實現(xiàn)對特定基因的定點插入、敲除或替換。2．重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡稱“限制酶”)[提醒]①限制酶的識別序列一般由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。③在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶(3)載體3．DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理(2)操作流程[提醒]①本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核和其他細胞器(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作為材料。②加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。(1)使用不同的限制酶也能產(chǎn)生相同的黏性末端(2024·貴州，13D)(√)(2)羊的成熟紅細胞可作為提取DNA的材料(2020·海南，10A)(×)提示羊?qū)儆诓溉閯游?，其成熟紅細胞沒有細胞核，不可作為提取DNA的材料。(3)向雞血細胞液中加蒸餾水攪拌，可見玻璃棒上有白色絲狀物(×)提示向雞血細胞液中加蒸餾水攪拌，雞血細胞吸水漲破，DNA溶于蒸餾水，觀察不到白色絲狀物。(4)動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行(2022·湖北，4A)(×)提示動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行。分析限制酶的作用和選擇將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個操作步驟。實驗人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識別序列和切割位點以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點。請思考以下問題：(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端分別是和。(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請說明理由。提示用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，實驗人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒，應(yīng)選用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，從而達到比一個標記基因更高的篩選成功率，防止只有一個標記基因時出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端?？枷蛞槐嫖龌蚬こ痰幕竟ぞ?．(2023·新課標，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接答案C解析酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選，D不符合題意。2．(2024·連云港調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標記基因(如圖所示)，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況不同。如表是外源基因插入(插入點有a、b、c)后細菌的生長情況。下列有關(guān)敘述正確的是()項目細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長情況細菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長情況①能生長不能生長②能生長能生長③不能生長能生長A.質(zhì)粒的復(fù)制原點上有RNA聚合酶的結(jié)合位點B．①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是a，②是c，③是bC．質(zhì)粒被一種限制酶切開時，被水解的磷酸二酯鍵有2個D．將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA聚合酶答案C解析質(zhì)粒的復(fù)制原點上有DNA聚合酶的結(jié)合位點，A錯誤；①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是b，②是c，③是a，B錯誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA連接酶，D錯誤。與DNA有關(guān)的幾種酶的比較考向二DNA的粗提取與鑒定3．(2024·安徽，14)下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是()A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B．利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)答案D解析研磨液中含有NaCl，有利于DNA的溶解，若換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，因此利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進行粗提取，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，因此二苯胺試劑可用于鑒定DNA，不能檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，D錯誤。4．(2024·山東，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是()A．整個提取過程中可以不使用離心機B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中C．鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變D．僅設(shè)置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾答案A解析研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應(yīng)取上清液倒入燒杯中，B錯誤；鑒定過程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，C錯誤；加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時間要在5分鐘以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)，僅設(shè)置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。考點二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進行篩選。(3)目的基因的獲取①人工合成目的基因。②PCR獲取和擴增目的基因a．PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))：是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。b．PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動調(diào)控溫度的儀器。c．PCR擴增的過程d．PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。[歸納提升](1)耐高溫的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子鏈。(2)引物(2種)的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(3)緩沖液的作用：維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定。(4)復(fù)性溫度過高，則引物難以與模板鏈結(jié)合，溫度過低則易使兩條母鏈配對結(jié)合，均無法獲得PCR產(chǎn)物。③通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。2．基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)基因表達載體的組成及作用(3)構(gòu)建過程[提醒]啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(正常情況下，不編碼氨基酸)3.將目的基因?qū)胧荏w細胞生物種類植物動物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導(dǎo)入[辨析](1)轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入4．目的基因的檢測與鑒定分析基因工程的基本操作程序接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙型肝炎病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙型肝炎病毒表面抗原(一種病毒蛋白)?；卮鹣铝袉栴}：(1)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導(dǎo)入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是用于篩選含有重組表達載體的細胞。為確保目的基因可以正常表達，其上下游序列需具有啟動子和終止子。(2)目的基因?qū)虢湍讣毎螅粢獧z測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取染色體DNA(基因組DNA)并用PCR擴增，電泳后觀察是否擴增出目的基因。(3)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。從酵母細胞中提取蛋白質(zhì)，再用相應(yīng)的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測是否出現(xiàn)雜交帶?？枷蛉嫖龌蚬こ痰幕静僮鞒绦?．(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落答案D解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。雙標記基因與影印接種法篩選含重組質(zhì)粒的菌落(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉(zhuǎn)化的細菌有三種：含自身環(huán)化目的基因的細菌、含重組質(zhì)粒的細菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細菌。(3)篩選方法：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的細菌即為含重組質(zhì)粒的細菌，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。6．(2024·河池模擬)研究人員將目的基因插入質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程如圖所示，再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。由LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)，使菌落呈藍色，否則菌落為白色。下列敘述錯誤的是()A．將目的基因插入質(zhì)粒中時，需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA連接酶B．需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)C．按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，大腸桿菌可正常表達該目的基因D．在含X－gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可出現(xiàn)藍色菌落答案C解析按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，由于目的基因的轉(zhuǎn)錄方向和啟動子的方向相反，大腸桿菌不能正常表達該目的基因，C錯誤；重組質(zhì)粒含有LacZ基因，其編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)，故在含X－gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可使菌落呈藍色，D正確。1．下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是()A．與洋蔥相比，豬血更適合作為DNA的粗提取與鑒定實驗的材料B．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低C．因DNA溶于酒精但蛋白質(zhì)不溶于酒精可分離DNA與蛋白質(zhì)D．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，取沉淀進一步實驗E．預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解F．加入預(yù)冷酒精析出白色絲狀物的過程中用玻璃棒沿一個方向輕輕攪拌G．兩次離心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中H．將提取的絲狀物溶解在2mol/LNaCl溶液中，將二苯胺試劑加入就能出現(xiàn)藍色答案ACDH解析豬血細胞無細胞核，不適合用于提取DNA，A錯誤；因DNA不溶于酒精但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，因而可分離DNA與蛋白質(zhì)，C錯誤；研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，故取上清液進一步實驗，D錯誤；將絲狀物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑，經(jīng)過沸水浴加熱5min才會出現(xiàn)藍色，H錯誤。2．下列關(guān)于基因工程中工具酶的敘述，正確的是()A．限制性內(nèi)切核酸酶可以從某些原核生物中提取B．限制性內(nèi)切核酸酶也可以識別和剪切RNAC．不同限制性內(nèi)切核酸酶可能切割出相同的黏性末端D．DNA連接酶連接的是兩條鏈堿基對之間的氫鍵E．E.coliDNA連接酶只能將有互補黏性末端的兩個DNA片段連接起來答案AC解析限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，不能識別剪切RNA，B錯誤；DNA連接酶連接的是兩個DNA片段之間的磷酸二酯鍵，D錯誤；E.coliDNA連接酶既能連接具有黏性末端的DNA片段，也能連接具有平末端的DNA片段，只是連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低于T4DNA連接酶，E錯誤。3．下列關(guān)于基因工程中載體的敘述，錯誤的是()A．基因工程中所用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動植物病毒等B．基因工程中用的載體大多數(shù)為天然質(zhì)粒C．質(zhì)粒是常用的載體，有2個游離的磷酸基團D．必須具有自我復(fù)制能力E．具有一個至多個限制酶切割位點，以便目的基因的插入F．載體質(zhì)粒中必須有抗生素抗性基因，便于重組DNA分子的篩選答案BCF解析在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的，B錯誤；質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，無游離的磷酸基團，C錯誤；載體質(zhì)粒中必須有標記基因，但不一定是抗生素抗性基因，F(xiàn)錯誤。4．下列關(guān)于基因表達載體及其構(gòu)建過程的說法，正確的是()A．基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建B．構(gòu)建基因表達載體的目的是使目的基因在受體細胞中能穩(wěn)定存在且遺傳給下一代C．一個基因表達載體一般包括目的基因、標記基因、起始密碼子和終止密碼子等結(jié)構(gòu)D．基因表達載體的構(gòu)建至少需要兩種工具酶E．基因表達載體的構(gòu)建過程中會發(fā)生堿基互補配對F．誘導(dǎo)物與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合可激活或抑制目的基因表達G．基因表達載體中啟動子具有DNA聚合酶的結(jié)合部位，啟動復(fù)制過程答案ABDEF解析基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分，C錯誤；基因表達載體中啟動子具有RNA聚合酶的結(jié)合部位，啟動轉(zhuǎn)錄過程，G錯誤。5．下列關(guān)于將目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因的檢測和鑒定的敘述，正確的()A．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是利用土壤農(nóng)桿菌侵染植物細胞，然后將重組Ti質(zhì)粒整合到受體植物細胞的染色體DNA上B．將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌中時，可以用鈣離子處理細菌C．應(yīng)該將抗蟲基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA片段內(nèi)D．將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ皿w細胞作受體細胞，采用顯微注射技術(shù)進行操作E．可采用PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄和翻譯F．某抗蟲基因轉(zhuǎn)基因是否成功，最簡便的方法是觀察該植物有沒有抗蟲性狀答案BCF解析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因插入農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中的T－DNA上，讓攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物細胞，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞的染色體DNA上，A錯誤；動物受精卵全能性最高，應(yīng)用顯微注射技術(shù)將表達載體導(dǎo)入受精卵來獲得轉(zhuǎn)基因動物，D錯誤；可采用PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄，采用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測目的基因是否翻譯，E錯誤。課時精練選擇題1～2題，每小題7分，3～6題，每小題8分，共46分。一、選擇題1．(2024·湖南，5)某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是()A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶答案B解析限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，A正確；在酶切條件不合適時，可能會出現(xiàn)DNA完全沒有被酶切的情況，需要調(diào)整反應(yīng)條件如溫度、pH等，但調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；質(zhì)粒DNA突變可能會導(dǎo)致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應(yīng)更換為正常質(zhì)粒DNA，C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。2．(2024·石家莊調(diào)研)圖1為某種質(zhì)粒簡圖，圖2表示某外源DNA上的目的基因，小箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位點。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．在基因工程中若只用一種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割，則可選EcoRⅠB．如果將一個外源DNA分子和一個質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切后，再用DNA連接酶連接，形成一個含有目的基因的重組DNA，此重組DNA中EcoRⅠ切割位點有1個C．為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒和目的基因D．一個如圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)EcoRⅠ切割后，含有2個游離的磷酸基團答案B解析圖中目的基因兩側(cè)都有EcoRⅠ酶切位點，質(zhì)粒上也存在EcoRⅠ酶切位點，若只用一種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割，可選EcoRⅠ，A正確；EcoRⅠ切割外源DNA分子和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，形成的含目的基因的重組DNA分子中，EcoRⅠ酶切割位點有2個，B錯誤；為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒和目的基因，C正確；該質(zhì)粒分子經(jīng)EcoRⅠ切割后，產(chǎn)生兩個黏性末端，含有2個游離的磷酸基團，D正確。3．(2022·山東，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)答案B解析離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確。4．(2023·廣東，11)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色答案D解析裂解是使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)，針對不同的實驗材料，可選擇不同的方法破壞細胞，如植物細胞可選擇研磨的方法，而動物細胞可選擇吸水漲破的方法，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的純度，C正確；將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘，待冷卻后，溶液能呈現(xiàn)藍色，D錯誤。5．(2025·黃石模擬)如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結(jié)合，然后導(dǎo)入棉花細胞。下列操作不符合實驗?zāi)康氖?)A．用PCR技術(shù)可檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細胞中B．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞C．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA—ACA融合基因D．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確答案B解析根據(jù)GNA－ACA融合基因的兩端序列設(shè)計合適的引物，可以利用PCR技術(shù)檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細胞的染色體DNA上，A正確；由于重組質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細胞，B錯誤；GNA和ACA基因均有BsaBⅠ酶切位點，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA－ACA融合基因，C正確；圖中質(zhì)粒與GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確，D正確。6．(2025·十堰調(diào)研)當蘋果削好皮或切開后放置一會兒，切口面的顏色就會由淺變深，最后變成深褐色。發(fā)生色變反應(yīng)主要是因為這些植物體內(nèi)存在著酚類化合物。酚類化合物易被氧化成醌類化合物，即發(fā)生變色反應(yīng)變成黃色，隨著反應(yīng)的量的增加顏色就逐漸加深，最后變成深褐色。氧化反應(yīng)的發(fā)生是由于與空氣中的氧接觸和細胞中酚氧化酶的釋放。如圖是培育抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果的過程，下列敘述不正確的是()A．要想獲得抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果，目的基因可選擇抑制酚氧化酶表達的基因B．實施步驟①是需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶的參與C．步驟④階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素和卡那霉素等物質(zhì)D．為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導(dǎo)入含pBI121質(zhì)粒的植株作對照答案B解析褐變是細胞中的酚氧化酶催化酚類化合物變成黃色所致，故要想獲得抗褐變的轉(zhuǎn)基因蘋果，可選擇抑制酚氧化酶表達的基因作為目的基因，A正確；步驟①是目的基因表達載體的構(gòu)建，該過程中需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的參與，B錯誤；步驟④是脫分化階段，該階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素(影響細胞的發(fā)育方向)和卡那霉素(將含有目的基因的細胞篩選出來)，C正確；為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導(dǎo)入不含目的基因質(zhì)粒的植株作對照，本實驗設(shè)計的目的是排除質(zhì)粒本身對實驗結(jié)果的影響，同時也能檢測導(dǎo)入目的基因的效果，D正確。二、非選擇題7．(16分)(2024·重慶，19)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關(guān)研究。(1)基因S啟動子的基本組成單位是____________。(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大豆品種YZ。根據(jù)題圖所示信息(不考慮未標明序列)判斷構(gòu)建重組表達載體時，為保證目標序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________________________________。(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應(yīng)有________________________________________________________________________。經(jīng)驗證的重組表達載體需轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，檢測轉(zhuǎn)入是否成功的技術(shù)是______________。(4)用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ－1的種子變大。同時將從TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導(dǎo)入YZ，所得再生植株YZ－2的種子也變大，但小于YZ－1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是___________________________________________________________________________________________________________。答案(1)脫氧核糖核苷酸(脫氧核苷酸)(2)EcoRⅠ酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環(huán)化；不能保證目標片段與載體定向鏈接(反向鏈接)(3)酶切后的空載體片段，啟動子D＋基因S片段PCR(4)品種DN的基因S上游啟動子效應(yīng)比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大解析(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，用于驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄，是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，其基本組成單位是四種脫氧核糖核苷酸。(2)根據(jù)圖示信息可知，“啟動子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的識別序列，若使用限制酶EcoRⅠ，會使目的基因序列被破壞；根據(jù)圖中限制酶的識別序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端相同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA片段在構(gòu)建基因表達載體時，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，以及無法保證目的基因片段與載體片段單向連接，影響目的基因在受體細胞中的表達。(3)DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達載體酶切后的產(chǎn)物不僅有“啟動子D＋基因S”片段，還有酶切后的空載體片段，因此電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應(yīng)有酶切后的空載體片段和“啟動子D＋基因S”片段；在分子水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入成功可通過PCR等技術(shù)檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(4)根據(jù)(4)題目信息可知，再生植株YZ－1導(dǎo)入的目的基因為取自品種DN的“啟動子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2導(dǎo)入的目的基因為取自品種TL的“啟動子T＋基因S”序列，結(jié)合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上游的啟動子D的效應(yīng)強于品種TL的啟動子T，啟動子D使基因S表達量更高，因而種子更大。8．(20分)(2024·貴州，21)研究者用以蔗糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌A的野生型(含NV基因)、突變體(NV基因突變)和轉(zhuǎn)基因菌株(轉(zhuǎn)入NV基因)，檢測三種菌株NV酶的生成與培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，結(jié)果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示無)。檢測用菌株蔗糖NV酶葡萄糖(培養(yǎng)液中)野生型＋＋＋野生型－－－突變體＋－－轉(zhuǎn)基因菌株＋＋＋回答下列問題：(1)據(jù)表可推測__________誘導(dǎo)了NV基因表達。NV酶的作用是____________________。檢測NV酶活性時，需測定的指標是_______________________________________________________________________________________________________________(答出1點即可)。(2)表中突變體由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得。從野生型與突變體中分別提取基因組DNA作為模板，用與__________(填“T－DNA”或“NV基因”)配對的引物進行PCR擴增。若突變體擴增片段長度__________(填“>”“＝”或“<”)野生型擴增片段長度，則表明突變體構(gòu)建成功，從基因序列分析其原因是______________________________________________________________________________________________________。(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉(zhuǎn)基因菌株是將NV基因?qū)隷_________細胞獲得的。在構(gòu)建NV基因表達載體時，需要添加新的標記基因，原因是_______________________________________________________________________________________________。答案(1)蔗糖參與蔗糖分解代謝，將蔗糖分解成葡萄糖單位時間內(nèi)葡萄糖的生成量(或蔗糖的減少量等)(2)NV基因＞突變體NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中堿基對增加而發(fā)生突變(3)突變體便于篩選出成功導(dǎo)入NV基因的細胞解析(1)根據(jù)表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培養(yǎng)基中會合成NV酶，不加蔗糖不會合成NV酶，推測蔗糖誘導(dǎo)了NV基因表達。分析表格可知，有NV酶時，菌株就能將蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能參與蔗糖的分解代謝過程。檢測NV酶活性時，需測定單位時間內(nèi)葡萄糖的生成量或蔗糖的減少量等。(2)從題目中可知，突變體是由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得的。在進行PCR擴增時，使用的引物需要與特定的DNA序列互補配對，才能啟動DNA的擴增。野生型菌株的基因組DNA中沒有T－DNA的插入，所以只有用與NV基因配對的引物進行擴增時，才可以擴增出兩種菌株的基因片段。突變體中的NV基因中插入了T－DNA序列，導(dǎo)致其堿基對增加，因此若突變體擴增片段長度＞野生型擴增片段長度，則表明突變體構(gòu)建成功。(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉(zhuǎn)基因菌株是將NV基因?qū)胪蛔凅w細胞獲得的。突變體由于NV基因發(fā)生突變，無法正常表達NV酶，導(dǎo)致相關(guān)生理功能缺失或異常。將正常的NV基因?qū)胪蛔凅w細胞，如果能夠恢復(fù)原本在突變體中缺失或異常的生理功能，就可以有力地證明NV基因確實具有特定的功能。在構(gòu)