MicroRNA-144真核表達(dá)載體的構(gòu)建以及對紅系分化調(diào)控的研究摘要本研究旨在構(gòu)建MicroRNA-144（miR-144）真核表達(dá)載體，并探究其對紅系分化的調(diào)控作用。通過基因克隆技術(shù)將miR-144前體序列插入真核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切和測序鑒定成功構(gòu)建載體。隨后，將其轉(zhuǎn)染至紅系細(xì)胞系，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)檢測紅系分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明，miR-144過表達(dá)可顯著影響紅系分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，提示miR-144在紅系分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，本研究為深入理解紅系分化機制及相關(guān)血液疾病的治療提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞MicroRNA-144；真核表達(dá)載體；紅系分化；調(diào)控機制一、引言紅細(xì)胞在氧氣運輸和維持機體正常生理功能中起著關(guān)鍵作用，紅系分化是一個復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及眾多基因和非編碼RNA的參與。MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。已有研究表明，多種miRNAs在紅系分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，然而，關(guān)于miR-144在紅系分化中的作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建miR-144真核表達(dá)載體，探究其對紅系分化的調(diào)控作用，為揭示紅系分化的分子機制提供新的線索。二、材料與方法（一）材料細(xì)胞系與菌株：選用人紅系細(xì)胞系K562，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自某生物公司。載體與試劑：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表達(dá)載體由實驗室保存；限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等購自NEB公司；RNA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自ThermoFisherScientific公司；蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Westernblot相關(guān)抗體購自CellSignalingTechnology公司。引物設(shè)計與合成：根據(jù)miR-144前體序列（GenBank登錄號：XXX），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，引物兩端分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5'-CGGGATCCATGCTGTCTGAGCTGCTG-3'，下游引物：5'-CCGGAATTCCTAGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。（二）方法miR-144前體序列的獲取：提取人外周血單個核細(xì)胞總RNA，按照TRIzol試劑說明書操作。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用上述設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收目的片段。真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體和回收的miR-144前體片段分別用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL：載體或DNA片段10μL，10×Buffer2μL，BamHI1μL，EcoRI1μL，ddH?O6μL。37℃水浴反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收目的片段。將回收的載體片段和miR-144前體片段按1:3的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶1μL，10×T4DNA連接酶Buffer2μL，ddH?O補足至20μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h。提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和測序分析。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建好的miR-144真核表達(dá)載體（實驗組）和空載質(zhì)粒（對照組）分別轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。qRT-PCR檢測：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用qRT-PCR試劑盒檢測紅系分化相關(guān)基因（如α-珠蛋白、β-珠蛋白、GATA1等）和miR-144的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。Westernblot檢測：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，加入紅系分化相關(guān)蛋白（如α-珠蛋白、β-珠蛋白、GATA1等）和內(nèi)參蛋白β-actin的一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。三、結(jié)果（一）miR-144真核表達(dá)載體的鑒定雙酶切鑒定：對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在約200bp處出現(xiàn)目的條帶（miR-144前體片段），同時在約7000bp處出現(xiàn)載體片段條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符，初步表明miR-144前體序列已成功插入真核表達(dá)載體。測序分析：將雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中公布的miR-144前體序列完全一致，進(jìn)一步證實miR-144真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。（二）miR-144過表達(dá)對紅系分化相關(guān)基因表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中miR-144的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。同時，紅系分化相關(guān)基因α-珠蛋白、β-珠蛋白和GATA1的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）（圖2），表明miR-144過表達(dá)抑制了紅系分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。（三）miR-144過表達(dá)對紅系分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Westernblot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中α-珠蛋白、β-珠蛋白和GATA1蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）（圖3），與qRT-PCR結(jié)果一致，說明miR-144過表達(dá)不僅抑制了紅系分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，還影響了其翻譯過程，進(jìn)而抑制紅系分化。四、討論本研究成功構(gòu)建了miR-144真核表達(dá)載體，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗證實miR-144過表達(dá)可顯著抑制紅系分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，表明miR-144在紅系分化過程中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用。GATA1是紅系分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠激活一系列紅系分化相關(guān)基因的表達(dá)，如α-珠蛋白和β-珠蛋白基因。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-144過表達(dá)導(dǎo)致GATA1基因和蛋白表達(dá)水平降低，推測miR-144可能通過靶向調(diào)控GATA1來影響紅系分化。已有研究表明，miRNAs主要通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域互補配對，抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解。因此，后續(xù)研究可通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-144與GATA1mRNA3'-UTR的結(jié)合位點，并通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)行驗證，以明確miR-144對GATA1的調(diào)控機制。此外，紅系分化是一個受到多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜過程。除GATA1外，miR-144可能還通過調(diào)控其他關(guān)鍵基因和信號通路參與紅系分化的調(diào)控。未來可進(jìn)一步篩選miR-144的潛在靶基因，深入研究其在紅系分化中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為揭示紅系分化的分子機制提供更全面的認(rèn)識。本研究的結(jié)果也為相關(guān)血液疾病的治療提供了新的思路。例如，在某些貧血性疾病中，紅系分化異?？赡芘cmiR-144的異常表達(dá)有關(guān)。通過調(diào)節(jié)miR-144的表達(dá)水平，可能成為治療這些疾病的潛在策略。然而，本研究僅在細(xì)胞水平初步探討了miR-144對紅系分化的調(diào)控作用，后續(xù)還需要在動物模型中進(jìn)一步驗證其生物學(xué)功能，并深入研究其在體內(nèi)的作用機制。五、結(jié)論本研究成功構(gòu)建了miR-144真核表達(dá)載體，并證實miR-144過表達(dá)可抑制紅系分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，在紅系分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。本研究為深入理解紅系分化的分子機制提供了新的理論依據(jù)，同時也為相關(guān)血液疾病的治療提供了潛在的靶點和研究方向。參考文獻(xiàn)[1]作者1,作者2,作者3,等。紅細(xì)胞生成的調(diào)控機制研究進(jìn)展[J].中國血液學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[2]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281-297.[3]作者4,作者5,作者6,等.MicroRNA-150在紅系分化中的調(diào)控作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[4]作者7,作者8,作者9,等.GATA1在紅細(xì)胞發(fā)育中的作用[J].國際輸血及血液學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[5]LewisBP,ShihIH,Jones-RhoadesMW,etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets[J].Cell,2003,115(7):787-798.[2]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281-297.[3]作者4,作者5,作者6,等.MicroRNA-150在紅系分化中的調(diào)控作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[4]作者7,作者8,作者9,等.GATA1在紅細(xì)胞發(fā)育中的作用[J].國際輸血及血液學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[5]LewisBP,ShihIH,Jones-RhoadesMW,etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets[J].Cell,2003,115(7):787-798.[3]作者4,作者5,作者6,等.MicroRNA-150在紅系分化中的調(diào)控作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[4]作者7,作者8,作者9,等.GATA1在紅細(xì)胞發(fā)育中的作用[J].國際輸血及血液學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[5]LewisBP,ShihIH,Jones-RhoadesMW,etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets[J].Cell,2003,115(7):787-798.[4]作者7,作者8,作者9,等.GATA1在紅細(xì)胞發(fā)育中的作用[J].國際輸血及血液學(xué)雜志，20XX,XX(X):XXX-XXX.[5]LewisBP,ShihIH,Jones-