蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作手冊(cè)一、引言蛋白質(zhì)相互作用（Protein-ProteinInteraction,PPI）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、基因表達(dá)等生命活動(dòng)的核心機(jī)制。研究PPI有助于解析蛋白質(zhì)功能、闡明疾病發(fā)生機(jī)制（如癌癥、神經(jīng)退行性疾?。┘伴_(kāi)發(fā)靶向藥物。本手冊(cè)聚焦體內(nèi)/體外PPI實(shí)驗(yàn)技術(shù)，涵蓋免疫共沉淀（Co-IP）、GST-Pull-down、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）等常用方法，提供詳細(xì)操作步驟、注意事項(xiàng)及問(wèn)題解決策略，旨在為科研人員提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。二、實(shí)驗(yàn)技術(shù)分類及選擇策略PPI實(shí)驗(yàn)技術(shù)可分為體內(nèi)技術(shù)（模擬生理?xiàng)l件下的相互作用）、體外技術(shù)（人工重構(gòu)相互作用體系）及計(jì)算預(yù)測(cè)技術(shù)（通過(guò)生物信息學(xué)方法推測(cè)相互作用）。下表總結(jié)了常用技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景：技術(shù)類型代表方法優(yōu)勢(shì)局限性應(yīng)用場(chǎng)景體內(nèi)相互作用免疫共沉淀（Co-IP）驗(yàn)證生理?xiàng)l件下的內(nèi)源性相互作用需特異性抗體；無(wú)法檢測(cè)瞬時(shí)/弱相互作用驗(yàn)證已知PPI；篩選復(fù)合物成分雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)時(shí)可視化活細(xì)胞內(nèi)相互作用可能存在假陽(yáng)性（熒光蛋白片段自發(fā)組裝）活細(xì)胞PPI動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；亞細(xì)胞定位分析熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）定量檢測(cè)相互作用親和力對(duì)儀器分辨率要求高；需熒光標(biāo)記相互作用動(dòng)力學(xué)分析；藥物對(duì)PPI的影響體外相互作用GST-Pull-down體外重構(gòu)PPI；適合篩選候選相互作用無(wú)法反映體內(nèi)生理?xiàng)l件；需純化融合蛋白驗(yàn)證體外PPI；篩選未知相互作用伙伴His-TagPull-down操作簡(jiǎn)單；適合高throughput分析標(biāo)簽可能影響蛋白構(gòu)象；非特異性結(jié)合較高融合蛋白相互作用驗(yàn)證；蛋白復(fù)合物純化計(jì)算預(yù)測(cè)STRING、BioGRID快速預(yù)測(cè)候選相互作用；指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性依賴數(shù)據(jù)庫(kù)完整性初篩PPI；構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)三、具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作步驟（一）免疫共沉淀（Co-IP）：驗(yàn)證體內(nèi)內(nèi)源性相互作用原理：利用抗體特異性捕獲靶蛋白（“誘餌”），同時(shí)捕獲與誘餌蛋白結(jié)合的“prey”蛋白，通過(guò)Westernblot檢測(cè)prey蛋白的存在，驗(yàn)證兩者相互作用。1.試劑與材料準(zhǔn)備裂解緩沖液（新鮮配制）：50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1%TritonX-100、1mMEDTA、10%甘油、蛋白酶抑制劑cocktail（1:100稀釋）、磷酸酶抑制劑（如1mMNa?VO?、5mMNaF，可選）。洗滌緩沖液：裂解緩沖液去除TritonX-100（或降低至0.1%），保持其他成分不變?？贵w：IP級(jí)單克隆/多克隆抗體（針對(duì)誘餌蛋白）；無(wú)關(guān)抗體（如IgG，作為陰性對(duì)照）。蛋白A/G瓊脂糖珠：根據(jù)抗體亞型選擇（如兔源抗體用蛋白A，鼠源抗體用蛋白G）。其他：SDS上樣緩沖液（2×）、Westernblot試劑（抗體、ECL底物）。2.樣本處理（細(xì)胞裂解）收集細(xì)胞（1×10?~1×10?個(gè)），用預(yù)冷的PBS洗滌2次，去除培養(yǎng)基殘留。加入預(yù)冷的裂解緩沖液（1mL/1×10?細(xì)胞），冰上裂解30分鐘（期間vortex3次，每次10秒）。4℃、____rpm離心15分鐘，取上清（細(xì)胞裂解液），用BCA法測(cè)定蛋白濃度（目標(biāo)濃度：1~2mg/mL）。3.免疫沉淀步驟取500μL細(xì)胞裂解液（約500~1000μg蛋白），加入誘餌蛋白抗體（1~5μg，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜（12~16小時(shí)）。加入蛋白A/G瓊脂糖珠（50μL，提前用裂解緩沖液平衡），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2~4小時(shí)（捕獲抗體-抗原復(fù)合物）。4℃、3000rpm離心5分鐘，棄上清（保留少量上清作為“Input”對(duì)照）。用預(yù)冷的洗滌緩沖液洗滌瓊脂糖珠3~5次（每次加入1mL洗滌緩沖液，vortex10秒，離心棄上清），去除非特異性結(jié)合蛋白。4.洗脫與Westernblot檢測(cè)向瓊脂糖珠中加入50μL2×SDS上樣緩沖液，vortex10秒，100℃煮沸5分鐘（洗脫復(fù)合物）。4℃、____rpm離心5分鐘，取上清（IP樣品）。取10μLInput樣品（約50μg蛋白）、20μLIP樣品，進(jìn)行SDS電泳。轉(zhuǎn)膜（PVDF或NC膜）后，用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，依次加入prey蛋白抗體（1:1000~1:5000稀釋）、HRP標(biāo)記的二抗（1:5000~1:____稀釋），ECL底物顯色，曝光檢測(cè)。5.注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題解決抗體選擇：必須使用IP級(jí)抗體（經(jīng)驗(yàn)證可用于免疫沉淀），避免用WB級(jí)抗體（親和力不足）；建議用單克隆抗體（特異性更高）。樣本質(zhì)量：細(xì)胞裂解液需新鮮制備，避免反復(fù)凍融（破壞蛋白構(gòu)象）；蛋白濃度過(guò)高易導(dǎo)致非特異性結(jié)合，過(guò)低則無(wú)法捕獲相互作用。對(duì)照設(shè)置：Input對(duì)照：驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中誘餌蛋白和prey蛋白的存在；IgG對(duì)照：用無(wú)關(guān)抗體替代誘餌蛋白抗體，檢測(cè)非特異性結(jié)合；空載對(duì)照：若過(guò)表達(dá)誘餌蛋白，用空載載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。常見(jiàn)問(wèn)題：無(wú)IP信號(hào)：抗體親和力不足（換用高親和力抗體）、誘餌蛋白表達(dá)量低（增加樣本量或過(guò)表達(dá)）、裂解緩沖液過(guò)強(qiáng)（降低去污劑濃度，如用0.5%TritonX-100）。背景過(guò)高：洗滌不充分（增加洗滌次數(shù)或提高NaCl濃度至300mM）、抗體非特異性結(jié)合（用更特異的抗體或降低抗體用量）。（二）GST-Pull-down：體外驗(yàn)證蛋白相互作用原理：將誘餌蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合表達(dá)，通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖珠捕獲GST融合蛋白，再與prey蛋白（細(xì)胞裂解液或純化蛋白）孵育，若兩者相互作用，prey蛋白會(huì)被共同捕獲，通過(guò)Westernblot或考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。1.試劑與材料準(zhǔn)備GST融合蛋白表達(dá)載體：如pGEX-4T-1（含GST標(biāo)簽）。表達(dá)菌株：如E.coliBL21（DE3）（適合高效表達(dá)重組蛋白）。誘導(dǎo)劑：IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）。谷胱甘肽瓊脂糖珠：用于純化GST融合蛋白。結(jié)合緩沖液：50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、0.1%TritonX-100、1mMDTT、蛋白酶抑制劑cocktail。洗脫緩沖液：10mM還原型谷胱甘肽（用50mMTris-HClpH8.0溶解）。2.GST融合蛋白的表達(dá)與純化轉(zhuǎn)化：將pGEX-誘餌蛋白載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂LB平板（含氨芐青霉素，100μg/mL），37℃培養(yǎng)過(guò)夜。誘導(dǎo)表達(dá)：挑取單菌落接種至5mLLB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD???=0.6~0.8，加入IPTG（終濃度0.1~1mM），20~30℃振蕩培養(yǎng)4~6小時(shí)（低溫誘導(dǎo)可減少包涵體形成）。收集菌體：4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清，用預(yù)冷的PBS重懸菌體。裂解菌體：加入裂解緩沖液（10mL/1L培養(yǎng)物），超聲破碎（功率200W，工作3秒，間隔5秒，共30次），4℃、____rpm離心15分鐘，取上清（含GST融合蛋白）。純化：將上清與谷胱甘肽瓊脂糖珠（1mL/1L培養(yǎng)物）混合，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1小時(shí)，用結(jié)合緩沖液洗滌3次，去除雜蛋白。3.Prey蛋白的制備細(xì)胞裂解液：若prey蛋白為內(nèi)源性蛋白，按“Co-IP”部分的方法制備細(xì)胞裂解液（蛋白濃度1~2mg/mL）。純化蛋白：若prey蛋白為重組蛋白（如His-Tag融合蛋白），用鎳柱純化（參考His-TagPull-down方法）。4.Pull-down反應(yīng)將純化的GST融合蛋白-瓊脂糖珠（50μL）與prey蛋白（500μL，約500μg）加入結(jié)合緩沖液（總體系1mL），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2~4小時(shí)。4℃、3000rpm離心5分鐘，棄上清（保留少量作為Input對(duì)照）。用結(jié)合緩沖液洗滌3~5次（每次1mL），去除非特異性結(jié)合蛋白。5.洗脫與檢測(cè)加入洗脫緩沖液（100μL），室溫孵育10分鐘（或4℃旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘），4℃、3000rpm離心5分鐘，取上清（含GST融合蛋白與prey蛋白復(fù)合物）。取20μL洗脫液進(jìn)行SDS電泳，考馬斯亮藍(lán)染色（檢測(cè)GST融合蛋白）或Westernblot（檢測(cè)prey蛋白）。6.注意事項(xiàng)GST融合蛋白的可溶性：若蛋白形成包涵體，可嘗試降低誘導(dǎo)溫度（如16℃）、減少IPTG濃度（如0.1mM）或更換表達(dá)載體（如pGEX-6P-1，含蛋白酶切割位點(diǎn)，可去除GST標(biāo)簽）。對(duì)照設(shè)置：GST空載對(duì)照：用pGEX空載體表達(dá)的GST蛋白替代GST-誘餌蛋白，檢測(cè)prey蛋白與GST的非特異性結(jié)合；無(wú)誘餌對(duì)照：不加GST融合蛋白，檢測(cè)瓊脂糖珠的非特異性結(jié)合。相互作用條件優(yōu)化：可調(diào)整NaCl濃度（100~500mM）、pH（7.0~8.0）或加入小分子（如ATP，模擬生理?xiàng)l件），提高相互作用特異性。（三）雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）：活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)可視化相互作用原理：將黃色熒光蛋白（YFP）拆分為N端（YN，1~154aa）和C端（YC，155~238aa）兩個(gè)無(wú)熒光片段，分別與誘餌蛋白（X）和prey蛋白（Y）融合表達(dá)。若X與Y相互作用，YN和YC會(huì)重新折疊形成完整的YFP，發(fā)出綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)514nm，發(fā)射波長(zhǎng)527nm）。1.試劑與材料準(zhǔn)備BiFC載體：如pBiFC-YN155/YC155（含YN/YC片段）。轉(zhuǎn)染試劑：如Lipofectamine3000（適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染）。熒光顯微鏡：配備YFP濾光片（激發(fā)514nm，發(fā)射527nm）。細(xì)胞系：如HEK293T、HeLa（適合轉(zhuǎn)染且熒光信號(hào)易檢測(cè)）。2.載體構(gòu)建目的基因克?。和ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增誘餌蛋白（X）和prey蛋白（Y）的編碼序列，分別插入pBiFC-YN和pBiFC-YC載體的多克隆位點(diǎn)（確保融合蛋白正確折疊）。載體驗(yàn)證：通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入序列的正確性（無(wú)移碼突變）。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種細(xì)胞至confocal小皿（如35mm皿），待細(xì)胞密度達(dá)50%~70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物：將pBiFC-YN-X（1μg）、pBiFC-YC-Y（1μg）與轉(zhuǎn)染試劑（如3μLLipofectamine3000）混合，室溫孵育15分鐘。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO?培養(yǎng)24~48小時(shí)（待熒光蛋白表達(dá)）。4.熒光顯微鏡觀察用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，去除培養(yǎng)基。加入新鮮培養(yǎng)基（含10%FBS），置于熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)光：514nm（YFP激發(fā)波長(zhǎng)）；發(fā)射光：527nm（YFP發(fā)射波長(zhǎng)）；對(duì)照：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染pBiFC-YN-X或pBiFC-YC-Y（檢測(cè)自發(fā)熒光）；轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)蛋白的融合載體（如YN-GFP、YC-RFP，檢測(cè)假陽(yáng)性）。5.注意事項(xiàng)熒光片段選擇：常用的熒光蛋白片段包括YFP（YN155/YC155）、GFP（GN173/GC174），其中YFP的熒光強(qiáng)度更高，背景更低。融合方向：誘餌蛋白與熒光片段的融合方向（N端或C端）可能影響相互作用，建議同時(shí)構(gòu)建兩種方向的載體，篩選最佳組合。假陽(yáng)性控制：若單獨(dú)轉(zhuǎn)染YN或YC載體出現(xiàn)熒光，說(shuō)明片段自發(fā)組裝，需更換熒光片段或調(diào)整轉(zhuǎn)染劑量（降低質(zhì)粒用量）。定量分析：用ImageJ軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度，比較不同處理組（如藥物處理）的相互作用強(qiáng)度。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析（一）對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)對(duì)照是判斷PPI特異性的關(guān)鍵，需設(shè)置以下對(duì)照：1.Input對(duì)照：驗(yàn)證樣本中誘餌蛋白和prey蛋白的存在（如Co-IP中Inputlane需檢測(cè)到兩者）。2.陰性對(duì)照：抗體對(duì)照（如Co-IP中的IgG）；空載載體對(duì)照（如GST-Pull-down中的GST空載）；片段對(duì)照（如BiFC中的單獨(dú)YN/YC載體）。3.陽(yáng)性對(duì)照：用已知相互作用的蛋白對(duì)（如p53與MDM2）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性。（二）結(jié)果的定性與定量分析定性分析：通過(guò)Westernblot（Co-IP、Pull-down）或熒光顯微鏡（BiFC、FRET）判斷是否存在相互作用（如IPlane出現(xiàn)prey蛋白條帶、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)熒光）。定量分析：Westernblot：用ImageJ計(jì)算IPlane與Inputlane的灰度值比值（反映相互作用效率）；熒光技術(shù)：用ImageJ計(jì)算熒光強(qiáng)度（BiFC）或FRET效率（FRET）；統(tǒng)計(jì)分析：采用t檢驗(yàn)或方差分析比較不同組間的差異（如處理組與對(duì)照組），P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（三）相互作用的特異性驗(yàn)證競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：加入過(guò)量游離誘餌蛋白（如純化的GST-誘餌蛋白），競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合prey蛋白，若IP或Pull-down信號(hào)減弱，說(shuō)明相互作用是特異性的。突變實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建誘餌蛋白的突變體（如破壞相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，如結(jié)合位點(diǎn)突變），若突變后相互作用消失，說(shuō)明相互作用依賴于特定結(jié)構(gòu)域。正交驗(yàn)證：用兩種不同技術(shù)（如Co-IP與BiFC）驗(yàn)證同一對(duì)PPI，提高結(jié)果的可靠性。五、實(shí)驗(yàn)安全與廢棄物處理1.化學(xué)試劑安全：使用SDS、TritonX-100等去污劑時(shí)需戴手套，避免接觸皮膚；IPTG、谷胱甘肽等試劑需避光保存（防止降解）。2.生物安全：細(xì)胞培養(yǎng)需在生物安全柜中操作，避免交叉污染；感染性廢棄物需高壓滅菌（121℃，20分鐘）后處理。3.熒光