15Specificationforpredatoryactivityofn2022-01-25發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I捕食線蟲性真菌捕食活性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了捕食線蟲性真菌捕食活性的評(píng)價(jià)方法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和捕食線蟲性真菌nematodetrapp由捕食線蟲性真菌菌絲營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞自發(fā)或在一定條件刺激下特化產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，簡(jiǎn)稱捕食12被捕食線蟲性真菌捕獲的目標(biāo)蟲體占目標(biāo)蟲體總量的百分率。4目標(biāo)蟲體及捕食線蟲性真菌培養(yǎng)4.1捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲培養(yǎng)與收集取感染有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的羊只糞便樣本，于28℃條件下培養(yǎng)，收集感染性幼蟲，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的相關(guān)規(guī)定。詳細(xì)步驟見附錄A。4.2捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲的無(wú)菌處理將收集的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3用無(wú)菌蒸餾水、抗生素等反復(fù)洗滌，以達(dá)到無(wú)菌效果，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的相關(guān)規(guī)定。詳細(xì)步驟見附錄A。4.3有孔玉米粉瓊脂培養(yǎng)基的制備取商品化的玉米粉瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)高壓后制備有孔固體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的相關(guān)規(guī)定。詳細(xì)步驟見附錄B。4.4捕食線蟲性真菌的培養(yǎng)取待檢捕食線蟲性真菌，置于有孔玉米粉瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。詳細(xì)步驟見附錄B。5捕食線蟲性真菌捕食活性評(píng)價(jià)方法5.1操作步驟在顯微鏡下觀察有孔玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上捕食線蟲性真菌的生長(zhǎng)情況，待其5個(gè)孔完全被菌絲覆蓋后，取出培養(yǎng)皿，在生物安全柜中加入按4.2處理且活力正常、30d內(nèi)收集的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3,每孔加入約50條。自加入蟲體6d后，于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)捕食率，捕食率以5個(gè)培養(yǎng)孔的平均捕食率計(jì)算。5.2捕食率統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蟲體被捕食線蟲性真菌的捕食器捕獲無(wú)法掙脫為捕食成功。捕食率計(jì)算公式如下：A=X/(X+Y)×100%...式中：A——表示捕食率；X——表示被捕獲的蟲體數(shù)；Y——表示自由活動(dòng)的蟲體數(shù)。6捕食線蟲性真菌捕食活性評(píng)價(jià)指標(biāo)6.1捕食線蟲活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以捕食線蟲性真菌捕食率的高低評(píng)價(jià)其捕食活性的強(qiáng)弱。6.2捕食線蟲活性強(qiáng)捕食線蟲性真菌對(duì)目標(biāo)蟲體的捕食率大于7捕食線蟲性真菌對(duì)目標(biāo)蟲體的捕食率大于50%且不大于70捕食線蟲性真菌對(duì)目標(biāo)蟲體的捕食率不大于3A.2儀器與試劑A.2.1儀器設(shè)備A.2.2試劑耗材餾水噴壺、燒杯、一次性吸管、移液器、吸頭、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、15mL離心管、一次性收糞袋（材質(zhì)：40A.2.3耗材的無(wú)菌化處理A.3捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲的培養(yǎng)A.4捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲的收集培養(yǎng)7d后，用滅菌蒸餾水將蓋上的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3沖洗到無(wú)菌燒杯中，自然沉淀后棄去上清，用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整濃度為1000條/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶A.5捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲的無(wú)菌化處理將收集的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3用無(wú)菌水4000r/min離心5min，重復(fù)洗滌3次。最后一清，將沉淀加入0.5%的甲醛中浸泡15min，然后再用無(wú)菌水4000r/min離心5min，重復(fù)μg/mL過(guò)夜，最后再用無(wú)菌水4000r/min離心5min，重復(fù)洗滌3次，可達(dá)到無(wú)4500g；精度：0.01g）、生化培養(yǎng)箱（溫度范圍：0℃~60℃;溫度波動(dòng)度：±0.5℃)。培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，用直徑為10mm的打孔器在培養(yǎng)基邊緣15mm的位置打5個(gè)孔，隨后在酒精燈下加熱使培養(yǎng)基底部融化，在孔底部形成約1mm厚度的薄膜，便于顯微鏡觀察和拍照。手術(shù)刀切下直徑約為5mm左右的瓊脂塊，倒置放在有56(資料