15Technicalspecificationfordi2022-07-29發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC1本文件主要起草人：徐曉靜、謝夢(mèng)圓、王建龍、常繼濤、馬立峰、郭宇、黃海碧、陳堅(jiān)、劉景龍。I牛冠狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了牛冠狀病毒腹瀉的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物BCoV：牛冠狀病毒（BovinecoronaviruCPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEDMEM：最低營養(yǎng)需要培養(yǎng)基（DuLbFBS：胎牛血清（FetalBovineSeHRT-18細(xì)胞：人直腸腫瘤18細(xì)胞（HPBS：磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferSaliPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactTCID50：半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量（MedianTissueCultureInfective樣品處理的生物安全措施符合GB19489的12牛冠狀病毒屬冠狀病毒科，乙型冠狀病毒屬，病毒顆粒為球狀，直徑通常在80nm~120nm,具有囊膜和棒狀纖突，核衣殼螺旋狀對(duì)稱?；蚪M為單股正鏈RNA。7臨床診斷7.1流行病學(xué)7.1.1易感動(dòng)物7日齡的犢牛易感，其他日齡犢牛及成年牛也可感染。病牛是本病自然流行的主要傳染源，犢牛一旦感染，可排出大量病毒粒子。7.1.3傳播途徑經(jīng)消化道、呼吸道及接觸傳播。7.1.4流行特點(diǎn)冬春季節(jié)多發(fā)，腹瀉通常在同一牛場(chǎng)連續(xù)發(fā)生。7.2臨床癥狀犢牛感染后發(fā)生腹瀉，發(fā)病初期出現(xiàn)帶血的黃色黏性糞便，后期發(fā)展為水瀉，有時(shí)出現(xiàn)脫水、虛弱、體溫低，少數(shù)犢牛出現(xiàn)發(fā)熱、臥地不起等癥狀，嚴(yán)重的犢牛會(huì)出現(xiàn)昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴發(fā)，排出深褐色帶血稀糞，伴有產(chǎn)奶下降、沉郁及厭食等癥狀。7.3病理變化小腸腸壁變薄、透明，腸腔液體增多，嚴(yán)重者引起腹腔積水，胃內(nèi)有未消化的凝乳塊。感染的?？赡馨殡S呼吸道癥狀，表現(xiàn)為氣管黏膜充血、局限性肺炎等。7.4結(jié)果判定符合6.1、6.2、6.3,可判定為牛冠狀病毒腹瀉疑似病例。8實(shí)驗(yàn)室診斷8.1主要儀器設(shè)備電鏡、低溫高速離心機(jī)、倒置顯微鏡、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、PCR儀、PCR管、電泳儀、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀。8.2主要試劑TAE電泳緩沖液。主要試劑配制見附錄A。8.3樣品采集與處理漩渦振蕩器充分振蕩，12000r/min4℃離心5min～8min，取上清編號(hào)備用。稱取1g樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS混勻，8000r/min4℃離心5min室溫靜置30min，3000r/min～4000r/min離心5min～10min。分采集的樣品應(yīng)低溫運(yùn)送，盡量12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)采集或處理后的樣品在2℃~8℃保存，一般不超過24h，若長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件保r/min離心30min，取上清，15000r/min離心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min離心4h～5h，棄上清，加1～2滴蒸餾水懸浮，滴加銅網(wǎng)，2%3瓶細(xì)胞，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組。接種前，先棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中液體，按細(xì)胞維持液終體積的10%加入處理好的樣品，37℃吸附1h，期間每隔20min搖晃一次，吸附完成后補(bǔ)加含15μg/mL～25μg/mL胰3度接種4孔；同時(shí)設(shè)對(duì)照非免疫血清（對(duì)照組）和正常細(xì)胞各4孔。于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，計(jì)將采集的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理，按RN保存，若需長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件，避免反中BcoV引物序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT；BCo4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序，于NCBI中Blast分析是否為BCoVN基可看到直徑為80nm～120nm的病毒顆粒，外周突起排列成當(dāng)正常對(duì)照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長良好，證明試驗(yàn)成立；可根據(jù)Reed-Muench），陽性對(duì)照、PCR產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（460bp同時(shí)陰性對(duì)照無條帶；即判按ELISA試劑盒結(jié)果進(jìn)行判定，樣品結(jié)果符合陽性標(biāo)準(zhǔn)即每個(gè)不同稀釋度的血清內(nèi)均加入100μLBCoV病毒液，充分混勻，37℃水浴感作1時(shí)設(shè)血清毒性對(duì)照（細(xì)胞內(nèi)加最低稀釋度的血清）、1:10稀釋的BcoV陽性血清對(duì)照、1:5稀釋的陰性5將細(xì)胞板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察5d～7d，觀察并記錄各血清中和BCoV的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:5時(shí)，中和試驗(yàn)結(jié)發(fā)病初期和發(fā)病后2周中和試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，且發(fā)病后2周抗體效價(jià)達(dá)發(fā)病初期的4倍，即判定為6試劑配制NaClNa2HPO4A.2細(xì)胞培養(yǎng)液青鏈霉素(10000U/mL)A.3細(xì)胞維持液Tris和EDTA-2Na溶于800mL去離子水，攪拌均勻；加入冰乙酸，充分溶解；用1moL/LNaOH調(diào)pH值至8.3，滅菌去離子水定容至1000mL后，室溫保存。使7中和抗