152022-08-30發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定檢測中心（巴彥淖爾市天賦河套質量標準檢驗研究中心）、本文件主要起草人：JIUHUANFENG（秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉諾、賈向春I食用向日葵品種純度鑒定SNP標記法GB/T3543.2農作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T3543.5農作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和品種在特征特性或DNA分子標記基因型方面一致性的程度。通常用供單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepoly124.1不同向日葵品種的基因組間存在核苷酸序列差異，其中單核苷酸(A、C、G、T)多態(tài)性(SNP)在基4.2利用一套多態(tài)性高、具良好基因型分型質量的推薦標記，檢測供檢樣品中不同個體間的基因型差異，統(tǒng)計供檢樣品中異型個體數，從而對供檢樣品整體的遺傳一致性程度進行測算，判——實時熒光定量PCR儀、全自動樣品快速研磨儀、高速離心機、核酸濃度測定儀、微孔板離心——96孔深孔板、384孔PCR板(白色)、微量離心管、普通槍頭、封板膜、鋼珠等。6.1.1所用試劑至少為分析純或分子生物學純。試劑配制用水應符合GB/T6682規(guī)定的一級水要求。 6.2.12mol/LTris-HCl溶液(pH8.0):稱取Tris堿242.8g,溶于850mL水中，pH至8.0,定容至1000mL,高壓滅菌。6.2.20.25mol/LEDTA溶液(pH8.0):稱取84.06gNa?EDTA·2H?O,溶于900mL水中，加固體NaOH(約20g)調pH至8.0,加水定容至1000mL,高壓滅菌。6.2.310%SDS溶液：稱取100gSDS,加水定容至1000mL。6.2.4溶液I:取2mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.25mol/LEDTA溶液(pH8.0)、10%SDS各100mL,加水900mL,調pH至8.0,定容至1000mL。用時按2%(M/V)加入聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-6.2.5溶液Ⅱ:取500g醋酸銨固體，加水定容至860mL,抽濾后放4℃冰箱備用。37.1.2除供檢樣品外，必要時應提供對照7.1.3供檢樣品為種子時，重量應不低于500g。7.1.5依據需達到的品種純度的國家規(guī)定的質量標準，試樣數量應符合GB/T3543.5的規(guī)定，或通過Seedcalc8計算。比如，在95%置信水平，要達到96%、98%、9種子數應分別不少于100粒、200粒、400粒?！腥∠蛉湛N子約1/3(通常選取非胚芽一端),或剪取葉片0.5cm~1cm大小，放入96深孔板中，每孔1個樣品。放入4mm鋼珠，加100μL溶液I,用全自動樣品快速研磨儀50Hz研磨60s,重復2～3次，使樣品完全破碎；——于4000rpm離心約3min,小心打開膠蓋(注意避免樣品間污染)。加500μL溶液I,蓋——取上清液300μL移入新的96深孔板，加入0.6倍體積預冷的異丙醇，蓋上膠蓋，顛倒混勻，-20℃靜置10min。4000rpm離心15min,棄去上清液(勿使DNA倒掉);7.3.1總則依據檢測目的，統(tǒng)籌考慮檢測規(guī)模和成本，確定適宜的樣品檢測數量及標記數量。配制反應體系時，每板應同時設置2個無DNA模板陰性對照(NTC)。根據NTC信號強弱，判斷最適擴增循環(huán)數。若NTC信號過高，則應降低——選擇遺傳多態(tài)性高、基因組上分布均勻、基因型分型——本文件優(yōu)先選用了17個SNP分子標記作為推薦標記(見附錄A),用于檢測所有試樣個體的——對于仍處于遺傳分離或不穩(wěn)定的標記位點應予以剔除。若17個推薦標記中，有3個以上標推薦用量(μL）2×1×Primer_AlleleXPrimer_AlleleY----8.2.3判定雜交種的品種純度是否達到國家規(guī)定的質量標準、合同和標簽標注指標要求，使用GB/T48.2.4判定親本或原種的品種純度是否達到國家規(guī)定的質量標準、合同和標簽標注指標要求，可按照）；純度%51GTGTAAGATGTGGTAGACG2GCATATTAACAGGCAAGAACAGCATATTAACAGGCAAGAACAGTCTGTAATGATCTTGCAGC3GAAATTCCGGTCCCGCATTCGGACTTTGGTTTTGAGGATC4GGCTTACCATCTTGACATTATGCTTACCATCTTGACATTATGGTATGGCATCAACGAGGTATCCA5CAAGGGTTGTATACAACACAAAAGGGTTGTATACAACACAAAGCAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCA6ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGACACCTTAACGATATTAACCCGA7TACGATGACGTTGTGGAACGCCTGATTTTAGATGGATCGTC8GAGAGCGAGTTCACCAACATAAAGAGCGAGTTCACCAACATA9GCATCATCAAAGAATCGAGCTACATCATCAAAGAATCGAGCAATTAAATTTCATTATGCTAGCTCAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGCGAAACCTTGTGAAACTTGTTGATCTTTGACACCACCAAACTCTAGCTTTGACACCACCAAACTCTAGTACATCCAAGGTTATGAAGAGATAATGGTTTCCCGGTCGAAGATAATGGTTTCCCGGTCGAAACCGAACCGGCTCCTCCGTGATAACGAAAGATCACACCATAACGAAAGATCACACCGGGGCCGTGAAGTTGAAGGATAGTTAGACGAAGACGATAAGGTAGACGAAGACGATAAGGTTAT