3.2.1植物細(xì)胞工程第1節(jié)植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)

細(xì)胞工程：是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的原理和方法，通過(guò)_________水平、_______水平或_______水平上的操作，有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。

根據(jù)操作對(duì)象的不同，可分為植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程兩大領(lǐng)域。細(xì)胞細(xì)胞器組織3.2.1植物細(xì)胞工程第1節(jié)植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)1、概念：是指將_______的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的________上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成_____________的技術(shù)。完整植株培養(yǎng)基離體一、植物組織培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，仍然具有___________________________________________的潛能，即細(xì)胞具有全能性。但是，在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，并不是所有的細(xì)胞都表現(xiàn)出全能性，這是因?yàn)樵谔囟ǖ腳_____________條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)__________。產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞時(shí)間和空間選擇性地表達(dá)2、植物細(xì)胞的全能性外植體愈傷組織芽、根植株脫分化再分化3、植物組織培養(yǎng)的基本流程外植體：_______的植物器官、組織或細(xì)胞。

細(xì)胞分化：個(gè)體發(fā)育中，由一個(gè)或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在______、______和______上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過(guò)程。

脫分化：已經(jīng)分化的細(xì)胞，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成__________細(xì)胞，形成愈傷組織的過(guò)程。

愈傷組織：由外植體脫分化形成的一團(tuán)排列疏松無(wú)規(guī)則、高度液泡化的具有______能力的薄壁細(xì)胞。

再分化：由愈傷組織重新分化成__________等器官的過(guò)程。離體形態(tài)結(jié)構(gòu)功能未分化分生根、芽外植體愈傷組織芽、根植株脫分化再分化愈傷組織見(jiàn)光后愈傷組織變?yōu)榫G色愈傷組織4、案例：菊花的組織培養(yǎng)

（1）材料的選取

同一種植物材料，材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開(kāi)花植株莖上部新萌生的側(cè)枝。

（2）常用的培養(yǎng)基是____________，主要成分包括：

①____________：N、P、S、K、Ca、Mg等。

②____________：B、Mn、Cl、Zn、Fe、Mo、I、Co等。

③有機(jī)物：甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、以及________（葡萄糖/蔗糖）等。MS培養(yǎng)基大量元素微量元素蔗糖

思考1、MS培養(yǎng)基中為什么用蔗糖而不用葡萄糖？

分析：蔗糖同樣可以作為植物細(xì)胞的碳源和能源物質(zhì)。配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯______（低于/高于）葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細(xì)胞脫水而生長(zhǎng)不良。同時(shí)，植物細(xì)胞吸收蔗糖的速率要明顯______（慢于/快于）吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可較長(zhǎng)時(shí)間地保持相對(duì)穩(wěn)定。此外，微生物生長(zhǎng)所需的最適合的碳源是__________，因此，采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少____________________。

④植物激素：_________和______________是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素，二者的______、及____________等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。常用的生長(zhǎng)素及類似物有NAA(萘乙酸)、2，4-D等

。常用的細(xì)胞分裂素有6-BA（6-芐基腺嘌呤）、KT（激動(dòng)素）和玉米素。低于慢于葡萄糖生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素濃度用量的比例微生物的污染

（3）外界條件：如pH、溫度、光照等環(huán)境條件。

思考2、組培時(shí)，光照條件該如何控制？

分析：形成愈傷組織以及愈傷組織的擴(kuò)大培養(yǎng)需______，誘導(dǎo)愈傷組織再分化出芽需______。

思考3、胡蘿卜組織培養(yǎng)時(shí)，若選取胡蘿卜韌皮部細(xì)胞，______（能/不能）培養(yǎng)出完整植物體。與韌皮部細(xì)胞相比，選取胡蘿卜形成層細(xì)胞進(jìn)行組培更______。避光照光能容易

使用情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果生長(zhǎng)素用量/細(xì)胞分裂素用量的比值高生長(zhǎng)素用量/細(xì)胞分裂素用量的比值低生長(zhǎng)素用量/細(xì)胞分裂素用量的比值適中促進(jìn)根分化，抑制芽形成促進(jìn)芽分化，抑制根形成促進(jìn)愈傷組織的形成5、操作提示

（1）無(wú)菌技術(shù)是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素

①由于植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小，抗性差，所以對(duì)培養(yǎng)條件要求高。MS培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物生長(zhǎng)，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的______操作。

②無(wú)菌技術(shù)包括對(duì)培養(yǎng)基、器械和植物材料（外植體）的____________。對(duì)培養(yǎng)材料表面消毒時(shí)要考慮藥劑的______________和材料的__________。

③培養(yǎng)基可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌污染或真菌污染。妥善處理被污染的培養(yǎng)物，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料污染，一定要先______再打開(kāi)清洗。無(wú)菌滅菌或消毒消毒效果耐受性滅菌5、操作提示

（2）試管苗培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題

①培養(yǎng)一株完整的試管苗，必須先進(jìn)行______（生根/生芽）培養(yǎng)，然后進(jìn)行______（生根/生芽）培養(yǎng)，如果順序顛倒，就不容易誘導(dǎo)生芽了。

②試管苗一般在高濕、弱光、恒溫下生長(zhǎng)，移出瓶后一定要保溫、保濕。

③試管苗____________能力低，在移栽前應(yīng)給予較強(qiáng)光照且進(jìn)行閉瓶煉苗，以促進(jìn)小苗向自養(yǎng)轉(zhuǎn)化。生芽生根光合作用稀釋70%酒精無(wú)菌水5%的次氯酸鈉消毒效果材料耐受性70%酒精灼燒滅菌酒精燈火焰旁倒插封口膜培養(yǎng)基外植體的選擇與消毒外植體的接種配制誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基愈傷組織培養(yǎng)（不需要光照）生芽培養(yǎng)（每天光照12～16h）生根培養(yǎng)更換培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基煉苗、移栽入土操作者、外植體、其他器物或環(huán)境消毒在等待外植體消毒的同時(shí)，做后面的準(zhǔn)備工作：如點(diǎn)燃酒精燈、用酒精棉進(jìn)行培養(yǎng)基瓶口的消毒、桌面的酒精消毒、準(zhǔn)備無(wú)菌紙等。超凈工作臺(tái)貼標(biāo)簽：植物名稱、接種日期、姓名等生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比例適當(dāng)細(xì)胞分裂素含量較高生長(zhǎng)素含量較高接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根外植體愈傷組織幼苗（芽、根）植株離體控制光照溫度pH脫分化再分化移栽比例適中照光無(wú)菌激素生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物無(wú)機(jī)鹽凝固劑（瓊脂）避光配比低→發(fā)芽配比高→生根MS培養(yǎng)基大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg大量元素：Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo植物體細(xì)胞雜交二、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合的原生質(zhì)體去除細(xì)胞壁雜種細(xì)胞植株融合組培再生細(xì)胞壁A細(xì)胞A原生質(zhì)體B細(xì)胞再生出細(xì)胞壁愈傷組織雜種植株移栽后的植株纖維素酶果膠酶PEG融合法高鈣-高pH融合法電融合法離心法B原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體篩選

思考3、誘導(dǎo)融合之后為什么要對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行篩選？

分析：融合體系中有多個(gè)原生質(zhì)體A和多個(gè)原生質(zhì)體B，由于融合是______的，所以除了會(huì)出現(xiàn)融合原生質(zhì)體AB，也會(huì)出現(xiàn)____________________和____________________；又由于融合的的成功率不是百分之百，所以除了會(huì)出現(xiàn)融合細(xì)胞，也會(huì)有_______________。因此誘導(dǎo)融合之后要對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行篩選。隨機(jī)融合原生質(zhì)體AA融合原生質(zhì)體BB未融合細(xì)胞選出AB型(雜種)細(xì)胞的方法方法1：互補(bǔ)選擇法第一次培養(yǎng)在適合A不適合B的條件下第二次培養(yǎng)在適合B不適合A的條件下淘汰B和BB型的細(xì)胞淘汰A和AA型的細(xì)胞選出AB型細(xì)胞方法2：融合前兩個(gè)親本有可分辨的明顯標(biāo)記親本1：來(lái)自愈傷組織親本2：來(lái)自葉肉細(xì)胞(含葉綠體)細(xì)胞壁薄且含有葉綠體的細(xì)胞選擇方法3：利用抗性互補(bǔ)親本1：對(duì)放線菌素D有抗性，但在MS培養(yǎng)基不能超過(guò)50個(gè)世代親本2：對(duì)放線菌素D敏感，但能在MS培養(yǎng)基生生長(zhǎng)。將雜種細(xì)胞培養(yǎng)在含有放線菌素D的MS培養(yǎng)基上即可。選出AB型(雜種)細(xì)胞的方法

思考4、科學(xué)家已經(jīng)培育出“番茄一馬鈴薯”超級(jí)雜種植株，但并未出現(xiàn)，地上長(zhǎng)番茄、地下結(jié)馬鈴薯的性狀，可能的原因是什么？

提示：馬鈴薯基因組的____________可能影響了番茄基因組的表達(dá)，番茄基因組的表達(dá)產(chǎn)物也可能影響了馬鈴薯基因組的表達(dá)，導(dǎo)致融合植株細(xì)胞中的基因不能______表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物有序

思考5、據(jù)報(bào)道，某男子培育出一株奇怪的植株，實(shí)現(xiàn)了“地上長(zhǎng)番茄、地下結(jié)馬鈴薯”，你認(rèn)為該男子可能是利用什么方法獲得的該植株？分析：______________________________________________________。接穗砧木嫁接

以土豆植株為砧木，以番茄植株為接穗項(xiàng)目體細(xì)胞雜交P1：2n(Aabb)與P2：2m(ccDd)生殖類型變異類型染色體數(shù)染色體組數(shù)基因組成植物體細(xì)胞雜交后代的遺傳變化無(wú)性繁殖，育種過(guò)程中不遵循孟德?tīng)柖扇旧w數(shù)目變異兩親本染色體數(shù)之和（2n+2m）兩親本染色體組數(shù)之和（2+2）兩親本基因之和（AabbccDd）意義：打破遠(yuǎn)緣親本雜交不親和的障礙。大大擴(kuò)展雜交的親本組合范圍。植物體細(xì)胞雜交育種雜交育種誘導(dǎo)多倍體秋水仙素四倍體四倍體二倍體1902年，哈伯蘭特（G.

Haberlandt，1854-1945）提出了細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)嘗試沒(méi)有成功。1958年，斯圖爾特（F.

G.

Steward，1904-1993）等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。1960年，科金（E.

C.

Cocking，1931-）用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。1964年，古哈（S.

Guha，1938-2007）等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，首次得到了由花藥中的花粉發(fā)育而成的胚。1890年，希普（W.

Heape，1855-1929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。1907年，哈里森（R.

G.Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)法。1951年，張明覺(jué)（1908-1991）等發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子的獲能現(xiàn)象。1958年，格登（J.Gurdon，1933-）用非洲爪蟾進(jìn)行體細(xì)胞核移植，成功培育出性成熟個(gè)體。同一時(shí)期，童弟周（1902-1979）等開(kāi)展了魚類細(xì)胞核移植工作。1959年試管兔誕生，之后多種試管動(dòng)物相繼出生。1975年，米爾斯坦（C.Milstein，1927-2002）和科勒（G.

K?hler，1946-1995）等創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)。1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。1996年，世界上第一只細(xì)胞克隆羊多莉在英國(guó)誕生。隨后多種克隆動(dòng)物相繼問(wèn)世。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941-）等成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細(xì)胞。2006年，山中伸彌（S.Yamanaka，1962-）等獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。我國(guó)科學(xué)家利用這種細(xì)胞培育出了小鼠。2014年，世界上第一個(gè)用單細(xì)胞基因組測(cè)序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國(guó)誕生。2017年，我國(guó)科學(xué)家首次培育出體細(xì)胞克隆猴。植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程（含胚胎工程）1971年，卡爾森（P.S.

Carlson，1944-2017）誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得種間雜種。1974年，土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交二

植物細(xì)胞工程的應(yīng)用1、快速繁殖快速繁殖優(yōu)良品種的_________________技術(shù)，被人們形象地稱為植物的快速繁殖技術(shù)，也叫作____________技術(shù)。它不僅可以高效、快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖，還可以保持優(yōu)良品種的___________。植物組織培養(yǎng)微型繁殖遺傳特性一、植物繁殖的新途徑快速繁殖微型繁殖無(wú)性繁殖有絲分裂，保持親代優(yōu)良的遺傳特性1、快速繁殖快速繁殖優(yōu)良品種的_________________技術(shù)，被人們形象地稱為植物的快速繁殖技術(shù)，也叫作____________技術(shù)。它不僅可以高效、快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖，還可以保持優(yōu)良品種的___________。2、作物脫毒馬鈴薯、草莓和香蕉等通常是用______繁殖的方式進(jìn)行繁殖的，它們感染的______很容易傳給后代。病毒在作物體內(nèi)逐年積累，就會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差?？茖W(xué)家就發(fā)現(xiàn)植物頂端________附近（如莖尖）的病毒極少，甚至無(wú)病毒。因此，切取一定大小的_______進(jìn)行____________，再生的植株就有可能不帶病毒，從而獲得________。植物組織培養(yǎng)微型繁殖遺傳特性無(wú)性病毒分生區(qū)莖尖組織培養(yǎng)脫毒苗一、植物繁殖的新途徑馬鈴薯草莓香蕉感染的病毒很容易傳給后代無(wú)性繁殖病毒在作物體內(nèi)積累作物產(chǎn)量降低品質(zhì)變差頂端分生區(qū)病毒極少，甚至無(wú)毒（如莖尖、根尖)植物組織培養(yǎng)脫毒苗明顯提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)一、植物繁殖的新途徑3、作物新品種的培育單倍體育種常規(guī)選育出一個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的作物優(yōu)良品種，一般要經(jīng)過(guò)5～6年的連續(xù)篩選。而單倍體育種可以先通過(guò)花藥（或花粉）培養(yǎng)獲得單倍體植株，然后經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)染色體加倍，當(dāng)年就能培育出遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定的純合二倍體植株，這極大地縮短了育種的年限。此外，由于大多數(shù)單倍體植株的細(xì)胞中只含有一套染色體，染色體加倍后得到的植株的隱性性狀容易顯現(xiàn)，因此它也是進(jìn)行體細(xì)胞誘變育種和研究遺傳突變的理想材料。一、植物繁殖的新途徑單倍體育種花藥離體培養(yǎng)人工誘導(dǎo)染色體加倍優(yōu)良品種花藥花粉離體培養(yǎng)單倍體(A、a)（一個(gè)染色體組）純合二倍體(AA、aa)人工誘導(dǎo)染色體加倍選擇二倍體（Aa）四倍體（AAaa）單倍體(AA、aa、Aa)（2個(gè)染色體組）四倍體(AAAA、aaaa、AAaa)AABB×aabbAaBbABAbaBabABAbaBabAABBAAbbaaBBaabb減數(shù)分裂花藥離體培養(yǎng)秋水仙素處理幼苗親本F1

F1配子單倍體恢復(fù)育性高桿抗病矮桿感病F29A_B_3A_bb3aaB_1aabb多代連續(xù)自交選優(yōu)，提高純合體的比例選優(yōu)aaB_純合體U雜交育種單倍體育種育種時(shí)間較長(zhǎng)極大縮短育種時(shí)間3、作物新品種的培育單倍體育種常規(guī)選育出一個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的作物優(yōu)良品種，一般要經(jīng)過(guò)5～6年的連續(xù)篩選。而單倍體育種可以先通過(guò)花藥（或花粉）培養(yǎng)獲得單倍體植株，然后經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)染色體加倍，當(dāng)年就能培育出遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定的純合二倍體植株，這極大地縮短了育種的年限。此外，由于大多數(shù)單倍體植株的細(xì)胞中只含有一套染色體，染色體加倍后得到的植株的隱性性狀容易顯現(xiàn)