PCR儀操作技術(shù)規(guī)范說(shuō)明一、引言聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是分子生物學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于基因克隆、突變檢測(cè)、病原體鑒定等場(chǎng)景。PCR儀作為實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)的關(guān)鍵設(shè)備，其操作的規(guī)范性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及儀器使用壽命。本規(guī)范基于《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（第四版）及主流PCR儀（如Bio-Rad、AppliedBiosystems等）的操作手冊(cè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際經(jīng)驗(yàn)制定，旨在為實(shí)驗(yàn)人員提供標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及風(fēng)險(xiǎn)控制指導(dǎo)。二、前期準(zhǔn)備（一）試劑與耗材檢查1.試劑有效性驗(yàn)證：檢查引物、DNA聚合酶（如Taq酶）、dNTPs、緩沖液（含Mg2?）、模板核酸等試劑的有效期，確保未過(guò)期；確認(rèn)試劑保存條件符合要求（如Taq酶需-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融；dNTPs需-20℃分裝保存）；目測(cè)試劑外觀：若出現(xiàn)沉淀、渾濁或顏色變化（如Taq酶由無(wú)色變?yōu)辄S色），禁止使用。2.耗材準(zhǔn)備與滅菌：選擇與PCR儀適配的PCR管/板（如0.2mL薄壁管、96孔板），確保無(wú)裂紋、變形；使用無(wú)RNA酶/DNA酶的一次性槍頭（帶濾芯優(yōu)先），避免交叉污染；耗材需經(jīng)高壓滅菌（121℃，20min）或輻照滅菌，未滅菌耗材禁止用于模板或試劑配制。（二）儀器狀態(tài)檢查1.物理外觀檢查：確認(rèn)儀器電源線、數(shù)據(jù)線連接正常，無(wú)破損；檢查樣本倉(cāng)蓋密封膠條是否完好，無(wú)老化或脫落；清理樣本倉(cāng)內(nèi)雜物（如殘留的PCR管帽、液體痕跡），用75%乙醇擦拭內(nèi)壁。2.功能預(yù)檢測(cè)：開啟電源，等待儀器自檢完成（通常需2-5min）；測(cè)試加熱模塊溫度準(zhǔn)確性：將校準(zhǔn)用溫度計(jì)放入樣本倉(cāng)，設(shè)置37℃保溫10min，誤差應(yīng)≤±0.5℃（若超出范圍，需聯(lián)系廠家校準(zhǔn)）；檢查倉(cāng)蓋壓力：關(guān)閉倉(cāng)蓋后，應(yīng)能感受到明顯的向下壓力（防止PCR管因壓力不足導(dǎo)致蒸發(fā)）。（三）實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)需在無(wú)核酸污染的環(huán)境中進(jìn)行，建議劃分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)，各區(qū)工具（槍頭、移液器、離心機(jī)）專用；操作臺(tái)面用10%次氯酸鈉或DNA去除劑擦拭，紫外線照射30min（擴(kuò)增區(qū)需在實(shí)驗(yàn)后照射）；實(shí)驗(yàn)人員需佩戴一次性手套（每操作一步更換）、口罩，避免說(shuō)話或咳嗽對(duì)著樣本。三、操作流程（一）反應(yīng)體系配制注：所有操作需在冰上進(jìn)行，避免酶活性喪失。1.體系設(shè)計(jì)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定反應(yīng)體積（常用20μL、50μL），按以下比例配制（以20μL體系為例）：試劑體積（μL）終濃度/用量無(wú)RNA酶水|12.3|—|10×PCR緩沖液|2|1×|dNTPs（2.5mMeach）|1.6|0.2mMeach|上游引物（10μM）|0.8|0.4μM|下游引物（10μM）|0.8|0.4μM|模板核酸|2|____ng（DNA）|Taq酶（5U/μL）|0.5|2.5U|2.加樣順序：遵循“水→緩沖液→dNTPs→引物→模板→酶”的順序，避免Taq酶提前接觸高濃度Mg2?或模板（導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）。3.混合與離心：加樣完成后，用移液器輕輕吹吸3-5次（避免產(chǎn)生氣泡），然后將PCR管放入離心機(jī)（4000rpm，1min），使液體集中于管底。（二）樣本加載與儀器設(shè)置1.樣本放置：將PCR管按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)順序放入樣本倉(cāng)（如96孔板需對(duì)應(yīng)孔位標(biāo)記）；確保PCR管底部與加熱模塊完全接觸（無(wú)懸空），倉(cāng)蓋關(guān)閉時(shí)聽到“咔嗒”聲。2.程序設(shè)置：根據(jù)模板類型（DNA/RNA）、片段長(zhǎng)度設(shè)計(jì)PCR程序，常規(guī)程序如下（以DNA模板為例）：步驟溫度（℃）時(shí)間循環(huán)次數(shù)預(yù)變性|95|5min|1|變性|95|30s|30-35|退火|55-65|30s||延伸|72|1min/kb||終延伸|72|10min|1|保存|4|∞|—|關(guān)鍵參數(shù)說(shuō)明：退火溫度：根據(jù)引物Tm值調(diào)整（通常比Tm低5℃），可通過(guò)梯度PCR優(yōu)化；延伸時(shí)間：根據(jù)目的片段長(zhǎng)度計(jì)算（如1kb片段需1min，2kb需2min）；循環(huán)次數(shù)：常規(guī)PCR為30-35次（次數(shù)過(guò)多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物）。3.熒光檢測(cè)設(shè)置（僅實(shí)時(shí)熒光PCR）：選擇熒光通道（如FAM、VIC），對(duì)應(yīng)探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)；設(shè)置檢測(cè)步驟（通常在延伸后或退火后），確保熒光信號(hào)采集準(zhǔn)確。（三）運(yùn)行與監(jiān)控1.啟動(dòng)程序：確認(rèn)程序設(shè)置無(wú)誤后，點(diǎn)擊“開始”按鈕，儀器進(jìn)入運(yùn)行狀態(tài)。2.實(shí)時(shí)監(jiān)控：觀察儀器界面顯示的溫度曲線（應(yīng)平穩(wěn)上升/下降，無(wú)波動(dòng)）；注意有無(wú)報(bào)錯(cuò)信息（如“蓋未關(guān)閉”“溫度失控”），若出現(xiàn)報(bào)錯(cuò)，立即停止運(yùn)行并排查原因（如重新關(guān)閉倉(cāng)蓋、檢查電源）。3.運(yùn)行結(jié)束：程序完成后，儀器會(huì)發(fā)出提示音，此時(shí)方可打開倉(cāng)蓋；用鑷子取出PCR管（避免燙傷），立即放入冰盒或4℃冰箱保存（待后續(xù)分析）。（四）后處理1.樣本分析：常規(guī)PCR產(chǎn)物需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳（1%-2%凝膠，120V，20-30min）或毛細(xì)管電泳驗(yàn)證；實(shí)時(shí)熒光PCR需通過(guò)軟件分析Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）、熔解曲線（判斷擴(kuò)增特異性）。2.儀器清潔：用75%乙醇擦拭樣本倉(cāng)、倉(cāng)蓋及操作臺(tái)面（避免使用丙酮等腐蝕性溶劑）；若有液體泄漏，立即用吸水紙吸干，再用DNA去除劑擦拭（防止交叉污染）。3.廢棄物處理：用過(guò)的PCR管、槍頭放入生物安全袋（標(biāo)注“感染性廢物”），經(jīng)高壓滅菌后丟棄；剩余試劑需密封保存（如Taq酶放回-20℃，引物放回-4℃），避免污染。四、注意事項(xiàng)（一）污染防控分區(qū)操作：試劑配制區(qū)（無(wú)模板）、樣本處理區(qū)（含模板）、擴(kuò)增區(qū)（含產(chǎn)物）嚴(yán)格分離，避免產(chǎn)物帶入前兩區(qū)；耗材專用：各區(qū)移液器、槍頭、離心機(jī)專用，禁止交叉使用；陰性對(duì)照：每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC）（用無(wú)RNA酶水替代模板），若NTC出現(xiàn)擴(kuò)增，說(shuō)明存在污染，需重新實(shí)驗(yàn)。（二）酶與模板處理Taq酶需冰上融化（避免室溫放置），用后立即放回-20℃；模板核酸需定量（用分光光度計(jì)測(cè)OD???/OD???，DNA應(yīng)在1.8-2.0，RNA應(yīng)在2.0-2.2），避免濃度過(guò)高或過(guò)低；RNA模板需通過(guò)反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）轉(zhuǎn)化為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（三）儀器使用安全運(yùn)行過(guò)程中禁止打開倉(cāng)蓋（防止高溫燙傷及核酸污染）；儀器未完全冷卻前（<40℃），禁止觸摸加熱模塊；長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，關(guān)閉電源，拔下電源線，蓋好防塵罩。五、常見問(wèn)題及解決問(wèn)題可能原因解決方法無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物模板質(zhì)量差（降解/濃度低）重新提取模板，定量驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤（Tm值過(guò)低）重新設(shè)計(jì)引物（Tm≥55℃）酶失活更換新酶，檢查保存條件非特異性產(chǎn)物多退火溫度過(guò)低提高退火溫度（1-2℃梯度）循環(huán)次數(shù)過(guò)多減少循環(huán)次數(shù)（30次以內(nèi)）模板濃度過(guò)高稀釋模板（____ng/反應(yīng)）儀器報(bào)錯(cuò)“溫度失控”加熱模塊故障聯(lián)系廠家維修傳感器污染用酒精擦拭傳感器熒光信號(hào)弱（實(shí)時(shí)PCR）探針濃度不足增加探針用量（0.1-0.2μM）模板降解重新提取模板六、維護(hù)與保養(yǎng)（一）日常維護(hù)每次實(shí)驗(yàn)后，用75%乙醇擦拭樣本倉(cāng)及倉(cāng)蓋；每周檢查一次密封膠條（若有老化，及時(shí)更換）；每月校準(zhǔn)一次溫度（用廠家提供的校準(zhǔn)試劑盒）。（二）長(zhǎng)期維護(hù)每季度清潔一次風(fēng)扇濾網(wǎng)（避免灰塵堆積導(dǎo)致散熱不良）；每年聯(lián)系廠家進(jìn)行全面檢修（包括溫度準(zhǔn)確性、機(jī)械部件磨損情況）